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图6
LCN2对在AGEs诱导下HAGE通过与其受体结合，激活NADPH-氧化酶活性通路激活PI3k-Akt-C/EBPβ 通路及JNK-C/EBPβ通路，进而促进LCN2的表达，从而表现出相应的生物学特性。 此外，实验中我们发现，通过shLCN2抑制LCN2的表达能够阻碍AGE诱导的HASMCs的 侵袭和迁移特性。
D：接下来，我们要验证C/EBPβ是否参与LCN2的转录激活。 实验：HASMCs,AGEs200μg /ml 24h 裂解细胞后加入各种检测物对应的抗体，经沉淀后CHIP分析。 IgG被用于排除非特异性免疫沉淀反应。 CHIP分析（染色质免疫沉淀分析）数据后显示绑定在LCN2启动子上的C/EBPβ在AGE处理后明显增加。而 经同样处理后的P65和c-fos却没有明显增多。 E、F:启动子分析也表明LCN2启动子的转录活性被AGE处理后显著增强（图3E） 为了探究C/EBPβ的哪个结合位点引起的上述结果，我们对C/EBPβ结合位点进行点突变(对HASMCs同时转 染带有LCN2启动子和PCMV-β-半乳糖苷酶的质粒，培养24h之后，AGEs处理，24h后荧光素酶分析)，结 果显示C/EBP-2参与转录激活HASMCs中AGE诱导LCN2的表达.
B图：检测NF-κB的亚单位p65, c-fos, c-jun, 和 C/EBPβ的核易位。数据显 示，C/EBPβ的核易位在经AGE处理后的3-6h内明显增加，易位的p65从1h 之后轻度增多，而c-fos, c-jun的位置却几乎没有明显的改变。（左右分别为 细胞质细胞核提取物）
C图，对C/EBPβ进行免 疫荧光染色清楚地显示 AGEs诱导C/EBPβ易位进 入细胞核。
实验表明:LCN2的表达与RAGE-NADPH活性氧通路有关，该通路可以引起PI3K-Akt和 JNK信号的激活。
为了进一步探究LCN2的表达与相关分子的影响，对LCN2基因序列进行分析
A图为一条LCN2基因序列，在该序列上划线标记的部分为潜在的转录因子结合位点。盒装 区域显示两个潜在的C/EBPβ结合位点，C/EBPβ突变序列在盒装区以下。箭头标示的是两 个引物对，用于启动子克隆和CHIP分析。NF-κB, AP-1和 C/EBPβ增强子结合蛋白均在启 动子序列区域。
杂志：BBA Molecular Cell Research 影响因子：5.297
研究背景
动脉粥样硬化在心血管疾病和糖尿病及其多种并发症中扮演重要角色。 AGEs被认为是参与糖尿病血管并发症发生发展的重要物质。现已证实，该物 质可以诱导血管平滑肌细胞增殖、钙化、粘附以及迁移。并且，血管平滑肌 细胞迁移至血管内膜在血管斑块形成过程的起始步骤中有重要作用。虽然我 们已经知道血管平滑肌细胞的迁移活动受AGEs调控，但是具体的分子学机制 仍不明了。 人脂质运载蛋白2(lipocalin 2,LCN2)又称中性粒细胞明胶酶相关脂质运载 蛋白(neutrophil gelati-nase associated lipocalin,NGAL), 也有称之为噬铁蛋白 （siderocalin)是一种属于脂质运载蛋白家族的糖蛋白。它可以参与变构，激 活并降解基质金属蛋白酶（MMP）-9的保护作用。之前关于LCN2的研究主 要聚焦于其作为生物标记物在包括贫血、代谢性疾病、炎症性肠病、急性肾 损伤及糖尿病肾病等众多疾病中的作用。此外，其表达的增加，会导致许多 包括动脉粥样硬化、心肌梗塞、血管内斑块形成在内的血管疾病的发生。然 而，关于其与糖尿病血管并发症相关的机制尚不明了。
取材 HASMCs
细胞 培养
各种 干预
明胶酶谱检测、RT-PCR、 实时定量RT-PCR
移除LCN2基因
流式细胞仪分 析DNA含量
细胞的迁移 和入侵检测
共聚焦显 微镜观测
数据统计、分 析、绘制结果 图，得出结论
实验结果报告（图1）
我们知道，MMPs(基质金属酶蛋白)尤其是MMP-2， MMP-9被认为在VSMCs的迁移和内膜增生过程中 有重要的作用。因此，我们猜想，二者可能参与 AGE诱导的VSMCs的迁移。 通过明胶酶谱法实验测定，我们奇怪的发现在AGE 的诱导下二者的表达却没有明显变化。并且通过蛋白 质印迹及RT-PCR法检测均得出上述结果（未附图）。 然而，在一条130KDa的蛋白质带上却检测到了 MMP-9/LCN2的表达随AGE浓度的增加而增加。 之前有报道称，这条带是MMP-9/LCN2混合的异质 二聚体。我们通过蛋白质印迹、RT-PCR及RTqPCR法检测得到右图结果。 结果显示：在VSMCs中LCN2的表达与AGEs密切 相关，且具有浓度依赖性。
蛋白印迹法检测同一AGE浓度下不同 时间点上述分子的表达
结果显示：AGEs能够增加这些分子的磷酸化。
实验组经过特异性抑制剂处理后我们发现只有Akt和JNK分子的激活被AGEs诱导的LCN2的表达过 程所需要，ERK和p38分子对该过程没有影响。此外，通过BAY 11-7082（一种NF-κB的特异性抑制 剂）处理后也表明其对LCN2的表达没有作用。
图1
为了探究AGEs对VSMCs 增殖和迁移的影响，我们 设计实验： B：对照组：HSA（人血清 白蛋白） 实验组：AGE不同浓度 梯度 C: HSA 200μg/ml AGE 200μg/ml 通过实验检测（如右图） 发现AGEs能够促进血管平 滑肌细胞增殖和迁移。
我们已经证实了在VSMCs中AGEs可以促进LCN2的表达，但具体是通过哪种途径 实现的，还不清楚，因此，我们做了如下实验。
图2：加入不同试剂后检测LCN2的表达
结果显示：在经AGEs处理的HASMCs中，加入了抗AGEs的抗体后LCN2的 mRNA和蛋白质的表达明显减少，但是加入了同型的抗IgG抗体后却未观察 到上述变化。（图2A）另外，研究发现：DPI（二亚苯基碘）一种NADPH氧 化酶抑制剂，N-乙酰半胱氨酸 一种ROS抑制剂，两者也可以减少LCN2的表 达。（图2B）
结果表明：去除LCN2基因的表达会明显抑制HASMCs的迁移和侵袭。
图5 共聚 焦显微镜 照片 桩蛋白
（是一种分子 量为68KDa的 局部粘附蛋白， 参与肿瘤细胞 的粘附与转 移。 ）
肌动蛋白
黏着斑蛋 白（一种细胞
骨架蛋白兼粘着 斑组成蛋白）
图为三种蛋白质在共聚焦显微镜下观测的结果。为了能观测到桩蛋白和黏着蛋白，我们 将细胞用抗二者蛋白的抗体处理，然后用共轭的异硫氰酸荧光素进行抗体复合物着色， 结果显示出图中的绿色部分，肌动蛋白为图中红色部分。 实验结果表明：经shLCN2去除LCN2基因的表达处理后抑制了AGE诱导的桩蛋白聚 积形成黏着斑的作用以及F-肌动蛋白的聚合作用。
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2014年09月04日
实验结论
1、AGEs通过激活RAGE-NADPH氧化酶活性氧通路诱导
LCN2的表达，进而引起PI3K-AKT和JNK在人血管平滑肌细 胞中激活。 2、C/EBPβ的激活对AGE诱导的LCN2的表达至关重要。用 shRNA抑制LCN2的表达后可以阻碍AGE诱导的HASMCs的 侵袭和迁移特性。 3、LCN-2是一种在糖尿病血管并发症的诊断和治疗过程中 新颖而有效的分子靶向物质。
图2：我们知道，MAPKs和PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3-羟激酶)是NADPH-氧化酶活 性氧信号通路的下游信号分子，它们参与VSMCs的增殖和迁移。因此，我们探究 这些信号分子（包括Akt, JNK, ERK, p38）在HASMCs中AGEs诱导的LCN2的表 达过程中的作用关系。
蛋白印迹法检测同一时间点不同 浓度的AGE对上述分子的表达
图5：那么，HASMCs的迁移和侵袭作用与移除LCN2的基因表达有何关联？
A: AGEs/TIMP-1(一种 MMP-9的抑制剂)分 别处理细胞，培养 24h后，显微镜下计 数入侵细胞的量。
B： 两种载体转导细胞后 AGEs处理细胞，培 养24h后，上述方法 测定细胞量。
C:经B步骤处理后进行迁移细胞的计数，绘制左图。右图为实验过程中，选取的具有 代表性的细胞迁移图片。
Lipocalin-2 elicited by advanced glycation end-products promotes the migration of vascular smooth muscle cells
Lipocalin-2(脂质运载蛋白-2)在晚期糖基化终产物的 诱导作用下促进血管平滑肌细胞的迁移
研究目的
1、探讨在人血管平滑肌细胞中AGEs如何诱导LCN2的表 达？在此过程中哪些物质参与其表达？抑制LCN2的表达 后，对HASMCs有何影响？ 2、通过实验研究，提出新的关于诊治糖尿病血管并发症 的观点。
技术路线图
蛋白印 迹分析 细胞生 长测定 质粒结构和荧 光素酶测定 染色质免疫 反应测定
G：为了证实C/EBPβ在功能上是否可以作为一种转录因子对LCN2的表达起作用，我们用shC/EBPβ慢病毒 基因载体将C/EBPβ的基因表达移除，然后检测LCN2启动子活性。 左图所示，与对照组相比 C/EBPβ的表达明显减少；右图示C/EBPβ的基因表达移除后LCN2启动子活性明显 下降。 图示结果表明：AGEs通过C/EBPβ转录因子影响LCN2基因的转录调控。
接下来我们继续用shC/EBPβ慢病毒基因载体将C/EBPβ的基因表达移除以 探究LCN2的生物学功能
A:明胶酶谱法、蛋白印迹、 PCR分别检测 B: 细胞生长率检测（无明显差异） C:流式细胞仪分析DNA含量评估实验对细胞周期调节的影响（无明显差异）
图4：结果显示:移除LCN2的基因表达，HSMCs细胞LCN2/MMP-9的表达明显减少(推测 可能影响其侵袭功能)，但其增殖和细胞周期的调控功能没有受到明显影响。