分子生物学检验完整版
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告
实验目的：
通过本次实验，我们旨在探究DNA复制、基因表达和蛋白质合成等分子生物学的基本原理，加深对分子水平生物学过程的理解，培养实验操作技能和科学思维能力。
实验材料与方法：
1. 实验材料：大肠杆菌（E. coli）细菌菌斑、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳试剂、PCR扩增仪、电泳仪等。
2. 实验步骤：
a. DNA提取：取一支含E. coli细菌菌斑的移液管，用DNA提取试剂盒提取DNA。
b. PCR扩增：将提取的DNA加入PCR试剂盒中进行PCR扩增反应。
c. 原核表达：将扩增后的DNA片段转入大肠杆菌进行原核表达。
d. SDS-PAGE电泳：将蛋白质样品加入琼脂糖凝胶，通过电泳进行蛋白质分子量的分离。
实验结果与分析：
1. DNA提取：成功提取到E. coli细菌的DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳观察到DNA的带型。
2. PCR扩增：成功扩增出目标DNA片段，并经过验证测序结果正确。
3. 原核表达：大肠杆菌成功表达了目标蛋白质，通过SDS-PAGE电泳观察到目标蛋白质的条带。
4. SDS-PAGE电泳：观察到蛋白质的分子量差异，验证了蛋白质的分离效果。
结论与讨论：
通过本次实验，我们成功实现了DNA提取、PCR扩增、原核表达和蛋白质分离等分子生物学实验步骤，从而全面了解了分子生物学过程的基本原理。
实验结果表明，实验操作规范，结果可靠，为今后的科研工作和实验基础奠定了坚实的基础。
同时，也发现了实验中的一些不足之处，提出了改进的建议，为进一步的研究工作提供了参考。
参考文献：
无。
【2024版】分子生物学检验技术教学大纲
可编辑修改精选全文完整版分子生物学检验技术教学大纲第一章原核生物基因组与病毒基因组[目的要求]掌握基因的分子生物学定义;限制性片段长度多态性的概念；质粒的定义与用途；操纵子的结构熟悉病毒基因组与细菌基因组的特点。
原核细胞内核酸含量、种类、功能与组织结构的差异;熟悉转座因子大肠杆菌、HIV与HBV基因组特点[教学时数]3学时[讲授内容]基因的概念基因的生物学定义、基因的分子生物学定义、细胞基因组。
原核生物与真核生物生物种类、原核细胞与真核细胞内核酸含量、种类、功能的差异，操纵子结构。
病毒基因组：重叠基因HBV与HIV等病毒的结构特点细菌基因纽细菌染色体基因组的结构特点;大肠杆菌、质粒。
[复习思考题]名词解释基因、质粒、断裂基因、假基因、限制性片段长度多态性、操纵子问答题1·简述原核细胞基因组特点。
第二章真核生物基因组[目的要求]掌握真核生物基因组的特点;单拷贝序列、中度重复序列与高度重复序列的概念。
熟悉：染色质的结构与要紧成分、核小体是染色质的基本结构单位。
熟悉染色体形态、功能研究中所用术语与新技术简介、朊病毒。
[教学时数]3学时[讲授内容] 真核生物学特点通常特点、C值矛盾、真核生物DNA序列的类型(单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列、人多基因家族、DNA指纹技术(限制性片段长度多态性)。
染色体的要紧成分、染色体的分型、染色体疾病[复习思考题]名词解释单顺反子、外显子、内含子、C值矛盾、单拷贝序列、中度重复序列、高度重复序列问答题真核生物基因组的特点。
第三章癌基因与抑瘤基因[目的要求]掌握癌基因与抑癌基因的概念；癌基因激活的机制熟悉sis家族、src家族、myc与myb家族、P53、RB家族及其表达产物；癌基因与抑癌基因的检测熟悉肿瘤发生的步骤；结肠癌的发病步骤[教学时数]3学时[讲授内容]肿瘤细胞的特征肿瘤病毒与癌基因DNA肿瘤病毒与癌基因;反转录病毒与癌基因。
肿瘤抑制基因肿瘤抑制基因存在的证据;RB基因，p53基因。
分子生物学检验完整版
1病原生物基因组在医学上有何应用?详见书P3a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查2什么是原癌基因,原癌基因有什么特性,原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些?原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因,能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。
特性:进化上高度保守,负责调控正常细胞生命活动,可以转化为癌基因。
功能分类:生长因子,生长因子受体,信号转导蛋白,核调节蛋白,细胞周期调节蛋白,抑制凋亡蛋白激活机制:插入激活,基因重排,基因点突变,基因扩增,基因转录改变3试述Down综合征(21三体综合征)的主要临床特征及核型。
临床特征:生长发育障碍,智力低。
呆滞面容,又称伸舌样痴呆。
40%患者有先天性心脏畸形。
肌张力低,50%患者有贯通手,男患者无生育能力,女患者少数有生育能力,遗传风险高。
核型:92.5%患者游离型:核型为47,XX(XY),+212.5%患者为嵌合型:46,XX(XY)/47,XX(XY),+215%患者为易位型:46,XX(XY),-14,+t(14q21q)4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点,对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检:敏感度和特异性差,不能用于确诊。
2分离培养法:诊断NG感染的金标准,但是其对标本和培养及营养要求高,培养周期长,出报告慢,难以满足临床要求。
3免疫学法:分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制,推广受限。
分子生物学的优点:敏感,特异,可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌,适应于快速检测5、在单基因遗传病的分子生物学检验中,点突变检测常用方法有哪些?1异源双链分析法(HA)2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸(DNA RNA)的检测、基因分型和耐药基因分析等。
分子生物学检验技术
1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料，通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变,为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科。
2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用。
（1）感染性微生物的检测.如:用PCR技术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解脲脲原体的检测等. （2)基因突变的检测.如：用PCR一限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测地中海贫血基因突变。
（3）法医学检测。
如:用PCR微卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别。
（4）基因异常表达的检测。
如：用cDNA表达的芯片技术进行基因异常表达的检测。
（5）基因定位。
如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位。
3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质。
4、基因:是基因组中一个功能单位,是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。
5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称，是最简单的细胞生物体。
6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位.7、质粒:是指细菌细胞染色体外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子。
8、转座因子：又称为转座元件,是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DNA序列.9、原核生物基因组的结构特征：(1）原核生物基因组通常仅由一个DNA分子构成，基因组中只有一个复制起点，具有类核结构。
（2）具有操纵子结构，模板mRNA为多顺反子mRNA。
编码区远远大于真核生物基因组，但又远远小于病毒基因组。
在基因组中存在多功能的识别区域，如复制起始区、转录启动区和终止区等，这些区域常常含有反向重复序列.（3）结构基因通常为单拷贝基因，编码顺序一般不重叠。
(4）具有编码同工酶的基因.（5)含有可移动的DNA序列。
10、病毒基因组的结构特点：（1）与细菌和真核生物基因组相比,病毒基因组结构简单，基因数少，所含信息量也少。
(完整word)临床分子生物学检验 总
四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA)为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1。
菌种鉴定：PCR—测序和PCR—DNA探针杂交;缩短检测时间2。
确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效3.病毒分析:基因型变异产生不同临床症状4。
细菌耐药监测和分子流行病学调查 :随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1。
致病基因的分子缺陷 2.线粒体基因突 3。
肿瘤相关基因单基因病1。
致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。
2。
致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2。
疾病诊断和遗传咨询3。
多基因病的研究4。
器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。
分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。
重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI） 3。
日本国立遗传研究所(DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPRO T等。
蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等.蛋白质数据库常用的有SWISS—PROT、 PIR、 PDB数据库。
2024版临床分子生物学检验技术
信号分子异常
信号分子的合成、分泌、运输或 降解异常均可影响细胞信号传导， 导致细胞功能紊乱和疾病发生。
信号通路异常
信号通路中关键分子的基因突变、 表达异常或相互作用异常均可破 坏信号通路的平衡，导致细胞增 殖、分化、凋亡等异常，进而引 发疾病。
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细胞信号传导检测技术及应用
免疫学检测技术
利用荧光共振能量转移（FRET）、 生物发光等成像技术，实时监测 活体内细胞信号传导的动态过程。
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2024/1/30
05
CATALOGUE
免疫分析技术
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抗原抗体反应原理及特点
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抗原抗体反应原理
基于抗原与抗体之间的特异性结合 反应，形成抗原-抗体复合物。
特点
高度特异性、敏感性和可逆性，受 多种因素影响如温度、pH值等。
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组织芯片和细胞芯片的原理及应用
原理
组织芯片和细胞芯片是一种高通量的组织或细胞分析技术，通过将大量组织或细胞样本固定在固相支持物 上，利用组织学、免疫组化、原位杂交等方法对组织或细胞进行染色和分析，实现对组织或细胞的形态、 功能和基因表达的研究。
应用
组织芯片和细胞芯片在疾病病理研究、药物筛选、生物标志物发现等领域具有广泛应用。例如，在肿瘤研 究中，可以利用组织芯片对大量肿瘤组织样本进行高通量的病理分析和基因表达研究，为肿瘤的分子分型、 预后评估和个性化治疗提供重要依据。
蛋白质分离与鉴定方法
01
02
03
双向凝胶电泳技术
通过等电聚焦和SDSPAGE两步电泳，实现蛋 白质的分离。
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质谱技术
利用质谱仪对蛋白质进行 鉴定，包括MALDI-TOF、 ESI等。
(完整word)临床分子生物学检验
绪论1.20世纪50年代，Waston和Crick提出了DNA双螺旋结构,标志着现代分子生物学的兴起。
2.从广义上来讲，应用到临床的分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物,目前，临床分子生物学检验的靶标主要以核酸(DNA或RNA）为主.第一章:核酸与分子标志物1.分子标志物：可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子,是生物标志物的一种类型。
核酸分子标志物是分子生物学检验的主要内容，包括基因突变、DNA多态性、基因组DNA片段、RNA和循环核酸等多种形式。
2.DNA的组成：是一种高分子化合物，其基本单位是脱氧核苷酸,每个核苷酸由磷酸、脱氧核糖和含氮碱基3部分组成。
3。
DNA与RNA的区别：2位脱氢。
4。
DNA的结构：①DNA一级结构：各种核苷酸单体沿多核苷酸链排列的顺序，表明该DNA分子的化学构成。
②DNA二级结构：双螺旋结构，DNA双螺旋的直径为2nm,一圈螺旋含10个碱基对,每一圈螺距为3.4nm，每个碱基的旋转角度为36度.维持DNA结构稳定的力量主要是碱基对之间的堆积力，碱基对之间的氢键也起着重要的作用.③DNA三级结构：DNA双螺旋进一步盘曲形成的更加复杂的结构。
5.核小体的形成(真核生物染色体包装过程)：在核小体中,DNA盘绕组蛋白八聚体核心,使DNA缩短为原来的1/7；6个核小体形成螺丝管，缩短为1/6；核小体彼此相连成串珠状染色质细丝，螺旋化形成染色质纤维，进一步折叠成染色单体.6.DNA双螺旋结构的变异：右手螺旋A—DNA、C-DNA、D-DNA、E—DNA、H—DNA、L—DNA、P-DNA，左手螺旋Z —DNA7.RNA主要分为三类：tRNA、rRNA、mRNA 还有一些小型RNA：反义RNA、微小RNA（microRNA，miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。
)8.真核mRNA与原核mRNA的区别(简答题)原核mRNA结构简单，为多顺反子,编码序列之间有间隔序列，原核生物mRNA中没有修饰碱基。
分子生物学检验技术课程教学大纲
《分子生物学检验技术》课程教学大纲一、课程说明课程编码03110452 课程总学时32周学时2 学分2课程性质专业必修课适用专业医学检验1、教学内容与学时安排（见下表）：教学内容与学时安排表2、课程教学目的与要求:本课程着重介绍分子诊断学的基础理论、技术方法和临床应用，及其有关的基本概念、原理和方法；并详细介绍了一些新近发展的重要技术及其应用，充分反映了分子诊断学的发展趋势。
包括三大内容：第一部分主要介绍：生物大分子（基因）的结构与功能、基因组的结构与功能、基因与基因组学等基本理论；第二部分培养学生的基本操作技能，掌握分子生物学常用技术（核酸的分离纯化技术、PCR，分子杂交、核酸序列分析等），基因重组技术。
第三部分应用介绍：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、复杂性疾病的分子诊断、生物信息学在分子诊断中的应用等。
3、本门课程与其它课程关系：分子诊断学是生命科学领域中最具有活力的前沿科学。
其理论、技术和方法不断地被应用于临床，在疾病的预防、预测、诊断、疗效的评价等诸方面发挥着愈来愈重要的作用，产生了一个新的学科方向——分子医学，分子诊断学是分子医学的重要组成，为疾病病因诊断提供信息和依据，是一门具有广阔前景、并逐渐走向独立的学科。
4、推荐教材及参考书：教材：《分子诊断学》（第二版），吕建新主编，中国医药科技出版社。
参考书：Harper’s Illustrated Biochemistry.《医学分子生物学》，冯作化主编，人民卫生出版社。
5、理论课程考核方法与要求：考核方法：闭卷考试，期末闭卷考试占90%,小论文或综述平时成绩共占10%。
要求：考核内容，掌握占70%,熟悉占20%,了解占10%。
6、实践教学内容安排：二、教学内容纲要模块1 绪论一、目的和要求（一）掌握：分子诊断学的定义和研究的主要内容（二）熟悉：分子诊断学的历史（三）了解：分子诊断学在医学中的应用二、教学内容（一）重点讲解：分子诊断学的定义及其研究范畴（二）一般介绍：分子诊断学发展的历史、特点及其展望；分子诊断学在医学中的应用模块2 基因与人类基因组计划一、目的和要求（一）掌握基因的概念和功能类别，基因组、DNA多态性和SNP的概念（二）熟悉人类基因组多样性（三）了解基因概念的发展和人类基因组计划二、教学内容（一）重点讲解：基因的概念，基因组的定义；人类基因组多样性（二）一般介绍：基因概念的发展；人类基因组计划模块3 基因组的结构与功能一、目的和要求（一）掌握真核生物基因组的结构与功能特点（二）熟悉原核生物和病毒基因组的结构与功能特点二、教学内容（一）重点讲解：原核生物、真核生物和病毒基因组的结构与功能特点模块4核酸分子杂交技术一、目的和要求（一）掌握：核酸分子杂交的基本原理；Southen/Northen印迹杂交（二）熟悉：核酸探针的设计（三）了解：其他杂交技术二、教学内容（一）重点讲解：核酸分子杂交的基本原理，核酸的变性、复性；Southen/Northen印迹杂交的特点及应用（二）一般介绍：核酸探针的纯化、检测、标记；其他杂交技术模块5分子克隆一、目的和要求（一）掌握：分子克隆的基本步骤（二）熟悉：分子克隆的工具酶和克隆载体（三）了解：表达载体和穿梭载体（一）重点讲解：分子克隆的工具酶（限制性核酸内切酶、DNA聚合酶）的作用特点；常用克隆载体（质粒、噬菌体）的特点；分子克隆技术的五大基本步骤（二）一般介绍：其他分子克隆的工具酶；其他克隆载体的特点；表达载体、穿梭载体的特点模块6生物芯片技术一、目的和要求（一）掌握：生物芯片、基因芯片和蛋白质芯片的概念及基因芯片的原理和分析步骤（二）熟悉：基因芯片的分析步骤和应用（二）了解：基因芯片的制作和蛋白质芯片二、教学内容（一）重点讲解：基因芯片的概念、原理和分析步骤；基因芯片的测定和应用（二）一般介绍：基因芯片的制作和蛋白质芯片模块7 DNA测序测定一、目的和要求（一）掌握：链末端终止法和化学降解法测序的基本原理（二）熟悉：主要测序技术的方法特点（三）了解：其他DNA测序技术和自动化测序二、教学内容（一）重点讲解：链末端终止法；化学降解法（二）一般介绍：其他DNA测序新技术的原理；自动化测序的原理模块8核酸扩增技术一、目的和要求（一）掌握：PCR的概念、基本原理和反应体系，实时荧光定量PCR的概念、基本原理（二）熟悉：PCR产物的检测方法；PCR的常见问题及体系优化；实时荧光定量PCR技术；常见PCR衍生技术（三）了解：PCR技术的发展变化；其他PCR衍生技术；PCR相关的扩增技术；临床PCR 实验室的标准化和质量控制（一）重点讲解：PCR的概念和基本原理；PCR反应体系的组成；PCR产物的检测方法; 实时荧光定量PCR的概念、原理和荧光示踪方法（二）一般介绍：PCR技术的发展变化和PCR相关的扩增技术；临床PCR实验室的标准化和质量控制模块9蛋白质组学研究技术一、目的和要求（一）掌握：蛋白质组学的基本概念；双向凝胶电泳技术的基本概念、原理（二）熟悉：蛋白质相互作用的研究技术（三）了解：生物质谱的基本原理；蛋白质的鉴定二、教学内容（一）重点讲解：蛋白质组学的基本概念；双向凝胶电泳技术的基本概念、原理及计算机图像分析；酵母双杂交技术的基本原理（二）一般介绍：生物质谱的基本原理，肽质量指纹图谱法与肽序列标签鉴定法的基本原理；其他蛋白质相互作用的研究技术模块10 感染性疾病的分子诊断一、目的和要求（一）掌握：基因病的概念和分类；基因病的分子诊断技术；感染性疾病的分子诊断策略; 感染性疾病的分子标志物（二）熟悉：HBV、HCV的基因检测；结核杆菌的基因检测（三）了解：细菌耐药基因的检测；其他感染性疾病病原体的基因检测二、教学内容（一）重点讲解：基因病的概念和分类；基因病的分子诊断技术；感染性疾病的分子诊断策略；HBV、HCV的基因检测；结核杆菌的基因检测（二）一般介绍：其他病毒的基因检测；其他细菌性疾病的分子诊断；细菌耐药基因的检测；衣原体、支原体、螺旋体、原虫的基因检测模块11 单基因遗传性疾病的分子诊断一、目的和要求（一）掌握：单基因疾病的概念，血红蛋白病的分子诊断（二）熟悉：血友病的分子诊断（三）了解：其他遗传性疾病的分子诊断二、教学内容（一）重点讲解：单基因疾病的概念，血红蛋白基因的特点；镰状细胞贫血病的分子诊断，地中海贫血的分子诊断；甲型血友病及其分子诊断（二）一般介绍：苯丙酮尿症等其他遗传性疾病的分子诊断；乙型血友病及其分子诊断模块12复杂基因疾病的分子诊断和分子诊断在移植配型中的应用一、目的和要求（一）掌握：肿瘤相关基因的分子诊断；分子诊断在移植配型中的应用（二）了解：其他多基因疾病的分子诊断二、教学内容（一）重点讲解：癌基因、抑癌基因、肿瘤耐药基因、糖尿病的分子诊断；分子诊断在移植配型中的应用（二）一般介绍：其他肿瘤标志物的分子诊断；家族性高脂血症、高血压支气管哮喘的分子诊断模块13线粒体疾病的分子生物学检验一、目的和要求（一）掌握：线粒体基因组及其表达系统；线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系（二）熟悉：线粒体基因组变异与疾病（三）了解：线粒体基因组与耳聋；线粒体与Leber遗传性视神经病变；线粒体与糖尿病二、教学内容（一）重点讲解：线粒体基因组及其表达系统；线粒体基因组与细胞核基因组的相互关系；线粒体基因组变异与疾病（二）一般介绍：线粒体基因组与耳聋；线粒体与Leber遗传性视神经病变；线粒体与糖尿病第十四章生物信息学在分子诊断中的应用一、目的与要求（一）掌握：生物信息学概论；生物信息数据库；核酸序列的分析（二）熟悉：计算机和互联网的基本知识；数据的获得（三）了解：蛋白质序列分析；二、教学内容（一）重点讲解：生物信息学概论；三大生物信息数据库及其检索工具；核酸序列的分析；引物设计（二）一般介绍：计算机和互联网的基本知识；蛋白质、核酸的结构、序列等数据的获得核酸序列的功能预测；蛋白质序列分析、结构功能预测及进化分析《分子生物学检验技术》实验教学大纲。
分子生物学检验完整版
分子生物学检验完整版分子生物学检验是一门在生命科学领域中具有重要地位的学科，它通过对生物大分子，如核酸和蛋白质的研究和分析，为疾病诊断、遗传咨询、法医学鉴定、农业和畜牧业的改良等众多领域提供了关键的技术支持和科学依据。
首先，让我们来了解一下分子生物学检验的基本原理。
其核心在于利用分子生物学的技术手段，对生物样本中的核酸（DNA 和 RNA）和蛋白质进行检测和分析。
DNA 是遗传信息的携带者，它的序列和结构变化能够反映出个体的遗传特征、疾病易感性以及疾病的发生发展过程。
RNA 则在基因表达调控中起着重要作用，对 RNA 的分析可以帮助我们了解基因的活性和表达水平。
而蛋白质作为生命活动的执行者，其种类、数量和结构的变化也与各种生理和病理过程密切相关。
在实际应用中，分子生物学检验涵盖了众多技术方法。
其中，聚合酶链式反应（PCR）技术是最为常见和重要的之一。
PCR 能够在体外快速扩增特定的 DNA 片段，使其数量达到可检测的水平。
通过设计针对特定基因或序列的引物，PCR 可以用于检测病原体的存在、基因突变的鉴定以及基因分型等。
实时荧光定量 PCR 技术则在 PCR 的基础上，实现了对扩增产物的实时定量监测，大大提高了检测的准确性和灵敏度。
另一个重要的技术是核酸杂交。
它基于核酸分子碱基互补配对的原理，通过将待测核酸与已知序列的探针进行杂交，从而检测待测样本中是否存在特定的核酸序列。
这种技术在基因诊断、病毒检测以及遗传性疾病的筛查中发挥着重要作用。
除了核酸检测，蛋白质的分析也是分子生物学检验的重要组成部分。
蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术可以检测特定蛋白质的表达水平和分子量。
酶联免疫吸附测定（ELISA）则能够对蛋白质进行定量分析，广泛应用于疾病标志物的检测和药物研发等领域。
在疾病诊断方面，分子生物学检验展现出了巨大的优势。
例如，对于传染病的诊断，它可以快速准确地检测出病原体的核酸，如新型冠状病毒的核酸检测，为疫情防控提供了有力的支持。
分子生物学检验技术-基因病的分子诊断
携带p53基因突变的人经常是李-佛美尼综合症的患者； APC基因是与大肠直肠癌发生有关的肿瘤抑制基因； BRCA1和BRCA2基因的突变则和乳癌相关；
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Rb
正常细胞中具有活性的RB蛋白（pRB）在细胞中保持着低磷酸化或无磷 酸化的状态，它与细胞周期调节因子E2F结合，抑制E2F的活性从而抑 制G1期到S期的进行，也就抑制了转录活性。 RB蛋白的失活途径有以下几种：
RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内;
蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信号传 递蛋白与信号传递至核内有关;
核内转录因子;
MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子；
细胞周期有关的蛋白;
3. 血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显着增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主， 但也存在着血管内溶血；
4. 血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高； 5. 红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15 天[正常为(28±5)天]； 6. 血红蛋白电泳显示HbS占80%以上，HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如；
32
癌症的特点
几乎癌组织都是克隆性增殖; 患者的所有癌细胞都起源于单一
的癌细胞; 大多数癌症不能用单基因遗传方
式解释; 某些类型的癌症，亲属发生同类
肿瘤的风险会增加，但不表现孟 德尔遗传; 许多癌症与环境的物理化学因子 或生物因子有关;
造成癌症的因素
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
斑点杂交结果
βΑ/βΑ
分子生物学检验技术第1章
贰
二、基因变异与单基因病
多基因病的发病机制十分复杂，遗传因素和环境因素共同起作用。
01
这些病的发病有一定遗传基础，常表现出家族倾向，但却又不符合一般的遗传方式。
02
三、基因变异与多基因病
02
多基因病的发生涉及诸多因素，某一因素的变异不足以解释多基因病的发病机制。
01
参与多基因病发生的基因被称为疾病相关基因。
01
生物芯片必将在基因功能研究、基因诊断、药物筛选和个体化药物治疗等方面扮演重要角色，具有重大的应用潜力。
02
二、生物芯片
三、蛋白质组学
当今的研究重点已经开始从揭示生命的遗传信息过渡到对生命活动的直接执行者——蛋白质进行整体水平的研究，蛋白质组学正成为目前揭示生命规律的新的重大热点领域。
三、基因变异与多基因病
线粒体DNA突变使线粒体功能发生障碍，直接影响人体组织和细胞的各种生物学功能，导致线粒体 遗传病。
01
它具有母系遗传、基因突变具阈值效应以及多系统受累等遗传学特征。
02
四、线粒体基因变异与线粒体遗传病
肿瘤的发生是由多种致癌因素综合作用的结果。
癌基因包括病毒癌基因和细胞癌基因,它们具有潜在诱导细胞恶性转化的特征。
编者（以姓氏笔画为序）
卫生部“十一五”规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材
唐冬生（佛山科学技术学院） 钱 晖（江苏大学） 倪培华（上海交通大学） 黄迪南（广东医学院） 彭 颖（温州医学院） 樊绮诗（上海交通大学）
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编者（以姓氏笔画为序）
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卫生部“十一五”规划教材 全国高等医药教材建设研究会规划教材
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分子生物学检测及动物试验标准版
五、放射性自显影
用放射性同位素标记dNTP（2’-单脱氧核 苷酸），测定核酸序列是应用最早。
放射性试剂
a-32p 有强放射性和散射性，少用 a-35S 标记dATP，高自显影条带分辨率
Northern 印迹杂交 (Northern blotting)
一、原理：
是将RNA样品通过琼脂凝胶电泳进行分离 ， 再转移到固相支持物上，用带标记物的探针对 固相膜上的RNA进行杂交，常用于RNA病毒核 酸的检测。
⑦引物的5’端：引物的5’端限定着PCR产物的 长度，它对扩增特异性影响不大，因此可以被修 饰。引物的5’端的修饰包括加酶切位点，标记生 物素、荧光素、地高辛等，引入蛋白质结合DNA 序列，引入突变位点等。
⑧引物的特异性：引物与非特异性扩增序列的 同源性不要超过90%或有8个互补碱基同源。
(2)耐热Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：这是在耐热细菌体 内提取的一种DNA聚合酶，可保证在95℃ ，30分钟 以上不会变性失活。0.5-5U/100μL。
①引物长度：15—30个碱基为宜，引物过短会使 特异性降低，引物越长，扩增的特异性越好，但敏感 性相应下降。
②G+C含量：在40%-60%为宜，引物Tm值可用公 式计算：Tm=4（G+C）+2（A+T）
③碱基分布的随机性。应尽量避免具有多聚嘌呤 或嘧啶核苷酸的序列，尤其3’端不应超过3个连续的G 或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
DNA探 针与 RNA探针相比 ，不易降解 ， 一 般能抑 制 DNA酶活性；
DNA探针标记方法较成熟，制备方法简便。
DNA探针一般长度在几百碱基对，可以是双链DNA， 也可是单链DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分 序列。
分子生物学检验技术教学大纲
分子生物学检验技术教学大纲一、课程信息•课程名称：分子生物学检验技术•课程代码：MBT101•学时数：3学分•上课方式：理论课+实验课•先修课程：细胞生物学、生物化学二、课程目标•了解分子生物学检验技术的基本原理和现状•掌握常用的分子生物学检验技术的操作步骤和应用•培养学生的实验操作能力和科学研究思维•强化学生实验安全意识和规范操作习惯三、教学内容1. 分子生物学基础•DNA与RNA的结构与功能•DNA复制、转录和翻译的基本原理•基因表达调控的机制和方法2. 分子生物学检验技术•DNA分离和纯化的方法•聚合酶链式反应（PCR）技术•DNA序列测定技术•基因克隆技术•基因组学与转录组学技术3. 实验操作与数据分析•实验前的准备与实验室安全•常用实验器材和试剂的使用和保养•分子生物学实验的基本步骤与操作技巧•数据分析与结果解读4. 应用与展望•分子生物学检验技术在医学、农业、环境保护等领域的应用•分子生物学的发展趋势与新技术的展望•科研论文阅读和文献检索技巧的培养四、教学方法•理论授课：通过课堂讲解、案例分析等方式，系统讲授分子生物学检验技术的基本原理和操作方法。
•实验操作：在实验室进行分子生物学实验，培养学生的实验操作能力和科学研究思维。
•讨论与互动：鼓励学生积极参与课堂讨论、小组讨论和问题解答，提高学生的思维能力和动手能力。
•个人学习：要求学生课后认真复习课堂内容，加强自主学习，提高对分子生物学检验技术的理解和掌握能力。
五、教材与参考书目•主教材：《分子生物学与生物技术基础》•参考书：《分子生物学实验基础》、《PCR原理与应用》、《分子生物学实验指南》六、评分标准•平时成绩：包括课堂讨论和实验操作的成绩，占总成绩的30%。
•期中考试：涵盖课程内容的理论考试，占总成绩的30%。
•期末考试：涵盖课程内容的理论和实验考试，占总成绩的40%。
七、参考实验项目•DNA提取与纯化实验•PCR实验•DNA测序实验•基因克隆实验•基因组DNA提取和测定实验八、实验室安全注意事项1.实验室内严禁吃东西，禁止饮料和咖啡进入实验室。
分子生物学检验技术
1、分子生物学检验技术：是以核酸或蛋白质为分析材料,通过分析基因的结构、表达的变化和由此而导致的基因功能的改变,为疾病的研究和诊断提供更准确、更科学的信息和依据的一门学科.2、请说明分子生物学检验技术在临床试验诊断中的应用.(1)感染性微生物的检测.如：用PC被术进行甲型肝炎病毒的检测、乙型肝炎病毒的检测和解月尿月尿原体的检测等.(2)基因突变的检测.如：用PCt限制性片段长度多态性(RFLP成术检测地中海贫血基因突变.(3)法医学检测.如：用PC蹶卫星检测技术进行亲子关系的鉴定和个体识别.(4)基因异常表达的检测.如：用cDN黑达的芯片技术进行基因异常表达的检测.(5)基因定位.如：用原位杂交技术进行组织与细胞中基因表达的定位.3、基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质.4、基因：是基因组中一个功能单位,是贮存有功能的蛋白质多肽链信息或RN府列信息及表达这些信息所必需的全部核昔酸序列.5、原核生物：是细菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、放线菌和蓝绿藻等原始生物的总称,是最简单的细胞生物体.6、操纵子结构：是原核生物基因组的功能单位.7、质粒：是指细菌细胞染色体外,能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子.8、转座因子：又称为转座元件,是一类在细菌染色体、质粒和噬菌体之间自行移动并具有转位特性的独立的DN便列.9、原核生物基因组的结构特征：(1)原核生物基因组通常仅由一个DN盼子构成,基因组中只有一个复制起点,具有类核结构.(2)具有操纵子结构,模板mRNA多顺反子mRNA编码区远远大于真核生物基因组,但又远远小于病毒基因组.在基因组中存在多功能的识别区域,如复制起始区、转录启动区和终止区等,这些区域常常含有反向重复序列.(3)结构基因通常为单拷贝基因,编码顺序一般不重叠.(4)具有编码同工酶的基因.(5)含有可移动的DN便列.10、病毒基因组的结构特点：(1)与细菌和真核生物基因组相比,病毒基因组结构简单, 基因数少,所含信息量也少.(2)病毒基因组的核酸类型较多,有双链DNA单链DNA双链RNAa单链RNA有环状分子,也有线性分子.但无论是哪种核酸类型,一种病毒颗粒中核酸成分只能为一种,或DNA 或RNA(3)基因组中有基因重叠现象,这种结构的意义在于使较小的基因组能携带较多的遗传信息.(4)基因组中具有操纵子结构.(5)病毒基因可连续也可间断.(6)基因组中重复序列少.(7)基因组中非编码区少.(8)病毒基因组是单倍体.(9)病毒基因组核酸序列中功能相关的蛋白质基因往往丛集在基因组的一个或几个特定部位, 形成一个功能单位或转录单元.(10)病毒基因组含有不规那么的结构基因.11、真核生物基因组的结构特点：(1)真核生物根本上不存在操纵子结构, 一个结构基因转录生成一条mRNA即mRNA单顺反子,许多蛋白是由相同或不同的亚基构成,因此涉及多个基因的协调表达.(2)基因组中非编码的区域多于编码区域,并且,编码蛋白质的基因一般是不连续的断裂基因,即有外显子和内含子,在转录后经剪切成成熟mRNA,才能译成蛋白质.(3)基因组DNAT重度、中度和低度三种重复序列.( 4)基因组DNAI有多基因家族与假基因.(5)基因组DNA吉构存在不同程度的差异,即基因多态性.(6)基因组DN的有基因重叠现象.(7)真核细胞的染色体末端存在一种由DNAt段和蛋白质组成的独特结构,即端粒.它能维持染色体的稳定性.12、乙型肝炎病毒(HBV基因组白结构：HB谨因组的长度为3.2kb ,是带有局部单链区的环状双链DN粉子,是目前已知感染人类最小的DNAT毒.HBV勺两条链长度不等,长的链为负链,用“ L (-) 〞表示,其长度是固定的,携带有病毒全部的编码信息；短的为正链,用“ S(+)〞表示,正链在不同的分子中长度不等,一般长约1.6-2.8kb,大约是负链的50%-100%并且短链的5'端位置是固定的,而3'端的位置是可变的.在负链的5'端有一低分子量的蛋白质,在正链的末端那么有一段短RNA它们是引导DN给成的弓|物.两条链的5'端有约250-300bp 可互补结合,所以也称为黏性末端, 这种互补结合是DN牌持双链环状的根底.止匕外,这局部核昔酸序列也是HB塌常整合到肝细胞染色体DN仲得序列.在黏性末端的两侧还各有11个核昔酸构成的顺向重复序列, 分另I」称为DR休口DR2, DR傕负链5'端,DR在正链5'端,中间相隔223个核昔酸.DFE域是DN微环及病毒复制的关键区域.HB谨因组已经确定在负链DN般昔酸序列为模板转录的RNAt含有4个公认的开放阅读框,分别成为S、C、P、X区.13、丙型肝炎病毒基因组(HCV灯结构：呈球形颗粒,直径约50nm,有一脂质包膜.基因组为单链正链RN病毒,链长约9.5kb,整个基因组只有一个ORF编码3011或3010个氨基酸.5'端和3'端分别有短的非编码区〔UTR〕 o 5'端UTR 由324-341个核昔酸组成,可能在病毒的复制和译过程中起重要的调节作用.5'端UTR勺核昔酸序列保守性强,可用于基因检测诊断.3'端UT曲27-55个核昔酸组成,其长度取决于病毒的来源,由病毒固有顺序与各种长度的“多U序列〞组成,是HCV勺独特2^构.HC遨因产物均来自一个大的多蛋白前体,经宿主与病毒编码的蛋白酶的联合作用,在翻译中或译后被加工成为结构蛋白及非结构蛋白. 结构蛋白包括两种：核心蛋白和包膜糖蛋白.非结构蛋白包括四种：NS2 NS3 NS4 NS514、人类免疫缺陷病毒基因组〔HIV〕的结构：〔主要有两型：HIV-1和HIV-2.两型病毒的核昔酸序列差异超过40%世界范围的AIDS大多由HIV-1所致,HIV-2只在西非呈地区性流行.〕HIV基因组由2条相同的正链RNA&5'端通过氢键互相连接在一起形成二聚体,其单链RN的有9749个核昔酸. HIV基因组共有9个基因,其中3个是结构基因,6个是调控基因.在病毒基因组的5'端和3'端各有相同的一段核昔酸序列,称为长末端重复序列〔LTR〕.LT珅含有启动子、增强TAT峙列等,它们对病毒基因组转录的调控起关键作用.15、质粒的一般性质：质粒作为一个完整的复制子,在转化菌细胞后能自主复制, 并对细菌的一些代谢活动和抗药性表现具有一定的作用. 在质粒只有在宿主细胞内才能完成自我复制,一旦离开宿主细胞就无法复制和扩增,相反,宿主细胞失去了质粒依旧能存活.质粒也是一种游离基因,既可整合到细菌染色体中,又可在游离由来.质粒具有不相容性.16、基因结构异常：广义上是指染色体畸变和基因突变,狭义上一般是指基因突变.17、基因结构异常的类型：通常分为单基因病和多基因病.单基因病包括：三联体重复、血红蛋白病、苯丙酮尿症和遗传性原发痛风.多基因病包括：原发性高血压、糖尿病和实体瘤. 18、端粒：真核细胞染色体末端存在着一种由DNAt段和蛋白质组成的独特结构,即为端粒.它对维持染色体的稳定性具有重要作用.19、端粒的主要作用：(1)维持染色体的稳定性,预防染色体重组及末端被降解.(2)保证细胞在有丝分裂时染色体准确的别离,在减数分裂是保证染色体的成对及运动.(3)端粒在细胞生长中有很大的作用,具与肿瘤和衰老有关.20、人类基因组：包括细胞核内的核基因组和细胞质内的线粒体基因组.核基因组由3,16 x 10 9 bp组成,线粒体基因组由16569bp组成.21、核酸：是以核昔酸为根本组成单位的生物信息大分子.(天然存在的核酸有两类,即DN刷RNA )22、核酸别离纯化应遵循的原那么：一是保证核酸一级结构的完整性,由于完整的一级结构是核酸结构和功能研究的根本要求；二是尽量排除其他分子的污染, 保证核酸样品的纯度. 23、简述核酸别离纯化技术路线的设计：(1)核酸的释放：①细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA勺提取；②非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法.(2)核酸的别离与纯化：①除去蛋白质、多糖、脂类等大分子物质；②除去非目的核酸组分；③除去实验溶液和试剂.(3)核酸的浓缩、沉淀于洗涤：①浓缩：提升样品浓度；②沉淀：常用的浓缩方法,如醋酸钠、醋酸镂等；③洗涤：除去共沉淀的盐,常用70%-75%勺乙醇.24、简述酚抽提法别离纯化基因组DNA勺方法,并绘制出流程示意图：(1)将分散好的真核生物组织、细胞在含EDTA SD极无DNA 酶裂解缓冲溶液裂解细胞,破坏细胞膜、核膜, EDTA1后抑制细胞中DNAS的活性,使DN盼子完整地以可溶形式存在于溶液中.SDSfc要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质, 并使它们沉淀,同时还有降解DNAS的作用.再经蛋白酶KM 理后,用PH8.0的Tris饱和酚抽提DNA重复抽提至一定纯度后,得到的DN能液经乙醇沉淀进一步纯化,此法可获得100-200kb 的DN时段.(2)书本82页25、简述低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法如何回收基因组DNA 有何优点：本方法是从低熔点琼脂糖凝胶中切由含待回收的DNA!胶块,利用其纯度高、熔点低及凝固温度低的特点, 对DNAt段回收的方法.该法对高分子量的DN特别有用,也能有效的别离小分子量的DN席段.26、质粒DNA屯化的主要方法与原理：(1) cscl-EB法：是一种沉降平衡离心法.经超速离心,离心介质cscl形成一连续的密度梯度,在过量E的在的条件下,各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开.该法主要用于纯化容易由现切口的极大质粒DN/W具有某些特殊用途的闭环质粒DNA(2)聚乙二醇沉淀法：是一种分级沉淀法.质粒DNA勺粗制品首先用LiCl沉淀大分子RNA并用RNasel化小分子RNA 然后在高盐条件下,用PE诞择性地沉淀大的质粒DNA沉淀的质粒DNAS一步用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀. PEGE淀法简单、经济、试用广泛,尤其对碱裂解法提取的质粒纯化效果好,适用于分子克隆中所有常规的酶学反响,也能用于高效的哺乳动物细胞学的转染.但不能有效别离带切口的环状质粒DNAf闭环质粒DNA(3)柱层析法：柱层析法纯化质粒DNA勺关键是用于填充层析柱的树脂.树脂可分两类：一类是利用疏水的相互作用纯化质粒DN 群品；另一类是通过离子交换与吸附的相互作用进行纯化.以硅基质作为填充材料的柱层析作用原理是：在多盐条件下,依靠DNAJ 硅基质的可逆性结合进行纯化.多盐造成磷酸二酯骨架的脱水, 通过暴露的磷酸盐残基, 是DNA吸附到硅基质上.以50%勺乙醇溶液洗去RN/W糖类等生物大分子后,参加TEg冲液或水溶液使DN份子重新水合,并通过离心洗脱由来.DNAJ硅基质的吸附作用与DNA勺碱基组成和拓扑结构无关,因此可用于环形质粒DN厌口线性DNA勺纯化.由于v 100-200bp的DN份子与硅基质的吸附力很弱,因此柱层析不能用于小分子DNAt段的纯化.27、简述RNA1取的关键步骤：91页28、DNAt组：不同来源的DNAS过磷酸二酯键连接而重新组合成新的DN册子的过程,称为DNAt组.29、DNAt组技术(分子克隆或基因工程)：用人工手段对DNA0行改造和重新组合的技术.包括对DN册子的精细切割、局部序列的去除、新序列的参加和连接、DN册子扩增、转入细胞的复制繁殖、筛选、克隆、鉴定和序列测定等等, 是基因工程技术的核心. 30、克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合.31、DN威隆：是指应用DNAt组技术,在体外对DNA0行重组,构建成具有自主复制水平的重组DN粉子,再导入宿主细胞,然后从单个细胞开始大量扩增,最终获得大量同一的DN盼子.32、限制性内切酶：是存在于细菌体内,能识别和水解双链DN册子内特定序列的核昔酸水解酶类.33、DNA4接酶：催化双链DN域RN仲并列的5'-磷酸和3'-羟基之间形成磷酸二酯键的酶.34、载体：时携带靶DNA〔目的DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具.35、作为载体应具备的条件：①在宿主细胞中具有自主复制水平或能整合到宿主染色体上与染色体基因组一同复制的水平；②有适宜的限制性酶切位点供外源DNAt段插入；③分子量不宜过大,以便于容纳较大的外源DNAt段并获得较高的拷贝数,也有利于体外重组操作；④具有适宜的筛选标记, 以便于区分阳性重组体和阴性重组体,常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的水平等；⑤配备与宿主相适应的调控元件,如启动子、增强子和前导序列等.36、用作克隆载体的理想质粒应具备的特点：①具有松弛复制子,复制子是质粒自我增殖所必不可少的根本条件,并可协助维持使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝；②在复制子外存在数个单一的酶切位点,以便目的DNAt段插入；③具有插入失活的筛选标志,理想的质粒载体应具有两种抗生素抗性标志；④分子量相对较小和较高的拷贝数.*37、重组DNA勺步骤：：①获得目的基因；②与克隆载体连接,形成新的重组DN册子；③用重组DN盼子转化或感染宿主细胞,并能在宿主细胞中复制和遗传；④对重组子的筛选和鉴定；⑤DN 便列测定.38、原核生物表达体系对外源目的基因的要求：要求真核生物的目的基因不应具有5'端非编码区以及内含子结构.39、原核生物表达载体的特点：①含大肠杆菌适宜的选择标志；②具有能调控转录、生产大量mRNA启动子；③含适当的译调控序列；④含合理设计的多接头克隆位点,以保证目的基因按一定的方向与载体正确连接.40、真核生物基因在原核细胞中的表达类型：包括融合型表达蛋白、非融合型表达蛋白和分泌型表达蛋白.41、醉母重组表达蛋白的别离与纯化：包括醉母细胞内表达的蛋白和分泌型蛋白的别离与与纯化.(1)醉母细胞内表达的重组蛋白的别离与纯化：这种蛋白质的别离与纯化过程比拟简单,以. -蛋白酶抑制剂的纯化为例：收集醉母细胞一玻璃珠破碎一离心取上清液一DEAE Sepharose柱层析-梯度洗脱-收集活性局部-浓缩-葡聚糖凝胶G7就层析一收集、浓缩一SDS-PAG陞度鉴定.(2)醉母表达分泌型重组蛋白的别离与纯化：以醉母表达干扰素纯化为例：发醉液用0.45um孔径滤膜过滤浓缩- DEAE-Trisacryl柱层析一梯度洗脱一收集干扰素局部一SephadexG7施层析一洗脱-收集干扰素-稀释-层析聚焦缓冲液洗脱-电泳鉴定.42、RNAi (小干扰RNA的作用机制与设计原那么：(1)作用机制：①起始阶段：外源的DsRNAI过导入或者转基因、病毒感染、转座子活化及特异重复序列或其他未知方式进入细胞,被Dicer酶识别并将dsRNAU割成21-23个核昔酸的由正反义链组成的小分子干扰RNA( siRNA);②效应阶段：siRNAs的双链结构需被解螺旋后组装到RN麟导的沉默复合物中,该复合物中解旋酶活性将siRNA双链解开,并定位到siRNA的反义链互补的靶mRNA录本上,在距离siRNA3' 12个碱基的位置切割mRNA③倍增阶段：仅需少量siRNA即可弓|起强烈的同源基因表达抑制.(2)设计原那么：①siRNA中G+毓基含量：一般为30%-70% 50%t siRNA产生的沉默效应较高,但过高的G+碱基含量会降消沉默活性；②siRNA的作用位点：一般选择2-4个不同序列针对目的DNA 3'端非编码区域可以作为目的序列,预防选择起始密码下游500-100个碱基处、终止密石^上游100碱基处及5'端非编码区域,由于此区域中含有阻止靶向识别的蛋白质结合位点；③ siRNA序列：预防连续四个以上腺喋吟及3个鸟喋吟或胞喀陡核昔酸的序列；④ siRNA碱基数：选择以A或G肝始的21-23碱基大小的目的mRNA⑤环碱基数：一般为9个碱基,其序列为TTCAAGAGA⑥对照系统：将以设计的siRNA碱基序列随机排列,以保证与其他基因无同源性, 才可作为实验的对照系统.43、核酸分子技术杂交：单链的核酸分子在适宜的条件下, 与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称作核酸分子杂交.44、探针：是用放射性核素或非放射性物质标记的一段单链或双链核甘酸,可依碱基配对规律与具有互补序列的待测核酸进行杂交,以探测它们的同源程度.45、变性：在一定条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,DN份子成为单链,形成无规那么线团,这一过程称作变性.46、融解温度：DNA勺变性会在一个狭窄的温度范围内发生, 这一温度范围的中点被称为溶解温度.47、复性：变性DNAR要消除变性条件,,具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链,这一过程称之为复性.48、杂交：将一种核酸单链标记成为探针,再与另一种核酸单链进行碱基互补配对,可以形成异源核酸分子的双链结构,这一过程称作杂交.49、核酸分子杂交原理：互补的DN库链能够在一定条件下结合成双链,即能够进行杂交.这种结合是特异的,即严格根据碱基互补的原那么进行,它不仅能在DN刷DN应间进行,也能在DN/WRN彷间进行.因此,当用一段基因的核酸序列作由探针,与变性后的单链基因组DNAS触时,如果两者的碱基完全配对,它们即互补地结合成双链,从而说明被测基因组DN却含有的基因序列.50、杂交核酸分子的种类：液相杂交、固相杂交、原位杂交和基因芯片技术.51、原位杂交：是应用核酸探针与组织或细胞中的核酸按碱基互补配对原那么进行特异性结合形成杂交体, 然后应用组织化学或免疫组织化学法在显微镜下进行细胞内定位的检测技术.52、试述Southern印记杂交的根本操作步骤：149页53、简述核酸分子杂交过程：包括核酸分子与固相介质的结合、杂交和杂交后信号的检测3个过程.而杂交又可分为预杂交、杂交和洗脱三个步骤.54、聚合酶链反响(PCR : 一种在体外特异性地复制序列的DN盾段的重要技术.55、PC反响原理及反响过程：(1)原理：PC或术的根本原理类似于DNA勺天然复制过程, 具特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物.(2)反响过程：PC他变性--退火--延伸三个根本反响步骤构成：①变性：将被复制片段的DNAfc94C-95 c条件下加热, 使DN徼螺旋的氢键断裂,形成单链分子作为反响的模板；②退火：将温度降至寡核昔酸(引物)的融点温度以下55 C 左右,使引物能与模板互补结合形成杂交链；③延伸：将温度升至72c左右,反响体系根据模板链的序列以互补的方式依次把dNT助口至引物的3'端,TaqDN麋合酶使杂交双链不断延伸,直至形成新的DN版链.56、PC反响条件为：温度、时间和循环次数.57、PCR勺特点：特异性强.对标本的纯度要求低.灵敏度局.58、PC反响的特异性决定因素为：①引物与模板DN特异正确的结合；②碱基配对原那么；③Taq DN课合酶合成反响的忠实性；④靶基因的特异性与保守性.59、PC反响的成分主要是：模板、引物、(脱氧核昔三磷酸)dNTP TaqDN麋合酶和缓冲液等.60、荧光定量PCR勺原理和方法：176页61、PC*物的检测：185页62、PC引物的设计原那么是什么？如何设计引物？(1)原那么：①用于PC双应的引物需要有两条被扩增目的基因的两端,并分别与模板正负链序列互补；②引物长度一般以18-25个核昔酸为宜；③两条引物之间〔尤其在3'端〕的序列不能有互补,以免形成引物二聚体；④引物的碱基组成应平衡,预防由现喋吟、喀陡碱基堆积.⑤PCIT增中得退火温度是根据引物的TM固决定的,两条引物的TM直不能差异太大；⑥根据需要,可以在合成引物时于其5'端加修饰成分.〔2〕设计引物最好用电脑软件进行分析,有助于综合考虑上述各因素.63、微卫星：又称短串联重复〔STR ,人类基因组中存在6-12个核昔酸重复序列,它们可以以正向或反向方式串联, 并分布于基因的多个位点上,存在的重复序列数目不同,其中2-6个核昔酸组成的重复序列称为微卫星.。
分子生物学检验
第二章临床分子生物学检验标志物1. 分子生物标志物：指可以反映机体生理，病理状态的核酸、蛋白质、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。
2. 中心法则：指遗传信息从DNA传递给RNA，再从RNA传递给蛋白质，即完成遗传信息的转录和翻译的过程。
也可以从DNA传递给DNA，即完成DNA的复制过程。
这是所有有细胞结构的生物所遵循的法则。
在某些病毒中的RNA自我复制(如烟草花叶病毒等)和在某些病毒中能以RNA为模板逆转录成DNA的过程(某些致癌病毒)是对中心法则的补充。
3. 基因组：是一个细胞或一种生物体的整套遗传物质，包括基因和非编码DNA。
4. 原核生物基因组特征：1）原核生物基因组较小：大小一般在106—107碱基对之间；2）原核生物的类核结构：原核生物基因组DNA位于细胞中央的核区，没有核膜将其与细胞质隔开在蛋白质的协助下，以一定的形式盘曲，折叠包装起来，形成类核；3）原核生物的操纵子结构：原核生物的结构基因大多数按功能相关性成簇地串联排列于染色体上。
结构基因同其上游的调控区以及下游的转录终止信号，共同组成了一个基因表达单位，即操纵子结构；4）原核生物的结构基因：原核生物的结构基因中无内含子成分，多数是单拷贝基因，基因与基因之间有重复序列存在；5）具有编码同工酶的基因：这类基因表达产物的功能相同，但基因结构不完全相同；6）含有可移动DNA序列：可移动的DNA序列通过不同的转移方式发生基因重组，改变生物体的遗传性状，使生物体更适应环境的变化；5. 质粒：指细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状分子；6. 人类基因组包括细胞核内的核基因组（3X109bp）和细胞质内的线粒体基因组（16569bp），人类基因组中存在大量的非编码序列和重复序列；7. 小卫星DNA：由10—100bp组成的重复单位重复几十到几百甚至几千次，形成的1—5bp 的短DNA，又称可变数目串联重复；8. 微卫星DNA：核心序列为1—6bp，可以重复上百次，又称短串联重复；9. 多基因家族：指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因，在多基因家族中，某些成员并不产生有功能的基因产物，这些基因称为假基因；10. 多态性：当某种变异相对常见，在群体中的频率高于1%时，则称为多态性，频率低于1%的变异称为突变；（错义突变，无义突变，RNA加工突变）；11. 多态性类型：限制性片段长度多态性；小卫星和微卫星多态性；单核苷酸多态性（主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性）；拷贝数多态性（指基因组中较大的片段（200bp—2Mb）发生了拷贝数的变化）；12. DNA甲基化：（1）定义：指生物体在DNA甲基转移酶的催化下，以S—腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程；（2）作用位点：腺嘌呤的N—6，胞嘌呤的N—4，鸟嘌呤的N—7，胞嘧啶的C—5；（3）作用机理：13. 微小RNA：是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸，在细胞内主要发挥基因转录后水平调控作用；14. 长链非编码RNA：长度大于200bp的非编码RNA；第四章：核酸杂交技术1. 融解温度（Tm）：DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的中点被称为融解温度；Tm值的大小取决于核酸分子的G-C含量。
细菌感染分子生物学检验课件
个性化治疗：根据 个体基因和健康状 况进行个性化治疗，
提高治疗效果
谢谢
02
细菌感染分子生物学检验可以区分不同类型的细菌感染，为治疗提供依据。
03
细菌感染分子生物学检验可以监测细菌耐药性，为抗生素治疗提供指导。
04
细菌感染分子生物学检验可以辅助诊断免疫缺陷病，为免疫治疗提供依据。
病原体研究
细菌分类：通过分子生物学方法对细 01 菌进行分类和鉴定
耐药性研究：研究细菌对抗生素的耐 0 2 药性机制，为临床治疗提供指导
04
代谢组学：研 究代谢物的种 类、含量和变
化规律
02
转录组学：研 究基因表达和
调控机制
05
系统生物学： 研究生物系统 的结构和功能
关系
03
蛋白质组学： 研究蛋白质的 结构、功能和
相互作用
06
合成生物学： 设计和构建新 的生物系统或
生物部件
3
细菌感染分子生 物学检验的应用
临床诊断
01
细菌感染分子生物学检验可以用于快速诊断细菌感染，提高诊断准确性。
于检测细菌的基因序列
和表达情况
基因测序技术：如二代 3 测序、三代测序等，用 于检测细菌的基因组序 列
生物信息学方法：如序
4
列比对、基因注释等，
用于分析细菌的基因功
能和进化关系
比较与优势
传统检测方法：培养法、免疫学检测法等，耗时 长，灵敏度低
分子生物学检验方法：PCR、基因芯片等，快速、 灵敏度高，可检测多种细菌
RNA片段
03
qPCR技术：实时 荧光定量PCR，
用于定量检测 DNA或RNA片段
04
NASBA技术：核 酸序列扩增技术， 用于扩增RNA片
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1病原生物基因组在医学上有何应用？详见书P3a菌种鉴定b确定病毒感染和病毒载量c病毒分析d细菌耐药监测和分子流行病学调查2什么是原癌基因，原癌基因有什么特性，原癌基因可以分为哪些种类以及原癌基因常见的激活机制有哪些？原癌基因是指人类或其他动物细胞(以及致癌病毒)固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。
特性：进化上高度保守，负责调控正常细胞生命活动，可以转化为癌基因。
功能分类：生长因子，生长因子受体，信号转导蛋白，核调节蛋白，细胞周期调节蛋白，抑制凋亡蛋白激活机制：插入激活，基因重排，基因点突变，基因扩增，基因转录改变3试述Down综合征（21三体综合征）的主要临床特征及核型。
临床特征：生长发育障碍，智力低。
呆滞面容，又称伸舌样痴呆。
40%患者有先天性心脏畸形。
肌张力低，50%患者有贯通手，男患者无生育能力，女患者少数有生育能力，遗传风险高。
核型：92.5%患者游离型：核型为47，XX(XY),+212.5%患者为嵌合型：46，XX(XY)/47，XX(XY),+215%患者为易位型：46，XX(XY),-14，+t(14q21q)4简述淋球菌感染的主要传统实验室诊断方法及其主要特点，对比分析分子生物学方法的优势1直接涂片染镜检：敏感度和特异性差，不能用于确诊。
2分离培养法：诊断NG感染的金标准，但是其对标本和培养及营养要求高，培养周期长，出报告慢，难以满足临床要求。
3免疫学法：分泌物标本中的非特异性反应严重以及抗体法间的稳定性和条件限制，推广受限。
分子生物学的优点：敏感，特异，可直接从了临床标本中检出含量很低的病原菌，适应于快速检测5、在单基因遗传病的分子生物学检验中，点突变检测常用方法有哪些？1异源双链分析法（HA）2突变体富集PCR法3变性梯度凝胶电泳法4化学切割错配法5等位基因特异性寡核苷酸分析法6DNA芯片技术7连接酶链反应8等位基因特异性扩增法9RNA酶A切割法10染色体原位杂交11荧光原位杂交技术6、简述白假丝酵母菌的分子生物学检验方法白假丝酵母菌分子生物学检验主要包括白假丝酵母菌特异性核酸（DNA RNA）的检测、基因分型和耐药基因分析等。
1PCR技术：选择高度特异性的天冬氨酸蛋白酶基因设计引物PCR—斑点杂交技术：正向杂交和反向杂交，后者可一次检测多种真菌DNA指纹技术：RFLPRAPD电泳核型分析AP—PCR技术：定义方法简便，快速，特别适合临床应用DNA序列分析：可测定rDNA序列也适用于基因突变引起的耐药基因芯片技术：适用于病原体的耐药研究7、F VIII基因倒位导致血友病A，DMD基因外显子缺失导致与杜氏肌营养不良，珠蛋白基因突变导致与珠蛋白合成障碍性贫血。
（第11章，P197，P203，P207。
窝觉得大家把题目读三遍就可以了）答：F VIII基因倒位是导致的血友病A的主要原因（占50%）其它基因突变，如点突变，缺失，插入也会导致血友病A。
同理DMD基因外显子缺失是迪谢内肌营养不良（杜氏肌营养不良）发生的主要原因（60%-70%）。
珠蛋白合成障碍性贫血有六种，主要的两种是α珠蛋白生成障碍性贫血和β珠蛋白生成障碍性贫血，基因突变是主要发病原因。
8、基因多态性有哪些的临床应用？（P4）答：1、基因定位和遗传病相关性分析；2、疾病诊断和遗传咨询；3、多基因病的研究；4、器官移植配型和个体识别9.第一代测序技术特点。
（p83）答：优点：高读长，准确率一次性达标率高，能很好处理重复序列和多聚序列，易小型化。
缺点：通量低，单个样本制备成本相对较高，难以做大量的平行测序,小规模进行。
10. 慢粒融合基因。
急性早幼粒融合基因。
答案：（一）慢粒融合基因（p229）BCR-ABL融合基因：BCR-ABL为t（9；22）(q34;q11)染色体易位所产生的融合基因，可见于25%-40%的成人ALL和4%-6%的儿童ALL，更是CML的重要分子基础（95%），Ph1染色体异常即为t(9；22（q34;q11）易位。
(二)急性早幼粒融合基因（p230）（10-529）PML-RARa融合基因：多数急性早幼粒细胞白血病（APL）有染色体t(15;17)(q22；q21)的易位，位于15q22的早幼力粒细胞白血病(PML)基因的17q21的维A酸受体a(RARa)基因融合成PML/RARa。
98%的AML-M3亚型发生该融合基因。
11华法林用药监测常用何种基因多态性，它有何特点。
P264 监测CYP2C9基因多态性，其特点为：CYP2C9约占CYP450总量的20%，参与约12%临床药物的代谢，尤其与磺酰脲类降糖药甲糖宁的代谢特异性有关。
（不肯定，参照P262）12在细胞增殖周期中，染色体的形态最典型和清晰的阶段。
P243 （填空题）有丝分裂中期13单基因遗传病间接诊断是在家系中进行？P192 （填空题）连锁分析和关联分析14染色体异常？原癌基因、核酸分子标志物、病毒感染的完整性检出策略、线粒体基因突变性糖尿病、PCR-RFLP、AP-PCR技术、抑癌基因、准病毒株、核型分析、连锁染色体异常：在受到环境，物理，化学，生物，自身遗传和母亲年龄等因素影响，导致人体染色体数目和结构的异常改变。
原癌基因：是指人类或其他动物细胞固有的一类基因，能诱导细胞正常转化并使之获得新生物特征的基因总称。
核酸分子标志物：是分子生物学检验的主要内容，包括基因突变，DNA多态性，基因组DNA片段，RNA和循环核酸等多种形式。
病毒感染的完整性检出策略：通过分子生物学检验技术对病毒的存在与否作出明确的判断，同时能够诊断出带菌者和潜在性感染者，并能对病毒进行拷贝数测定，基因分型检测及亚型和耐药性鉴定。
线粒体基因突变性糖尿病：（p240）tRNAleu(UUR)A3243G是国际上唯一公认的线粒体糖尿病致病突变，是国内外报道的最多，发病率较高的单基因糖尿病突变位点。
（课本上找不到）PCR--PFLP:：是对PCR产物作限制性片段的长度多态性分析，是根据PCR产物突变序列是否位于限制性内切酶的酶切位点内设计的。
AP-PCR技术：AP-PCR技术是在对所扩增的基因序列一无所知的情况下随意设计或选择一个非特异性引物，在PCR反应体系中，首先使引物与模板DNA中许多序列通过错配而复性。
抑癌基因：又称肿瘤抑制基因，为一类可编码对肿瘤形成起阻抑作用蛋白质的基因，正常情况下负责控制细胞的生长和增殖。
准病毒株：即准种，是指HCV感染后，在感染者体内形成以一个优势株为主的相关突变株病毒群。
核型分析：人类的染色体数目和形态的相对恒定，将细胞的染色体按相应的生物固有的染色体形态特征和规定，进行配对，编码和分组的分析过程。
连锁：在疾病家系中，同一染色体上相邻的两个位点因其位置十分靠近，在遗传时两者分离的概率很低。
15HBV感染的病原学诊断目前主要依靠？答：免疫学方法检测HBV的血清学标志物和分子生物学检测HBV核酸。
P14116甲型分亚型的标准？P148 (书上未找到甲型)丙型肝炎5’UTR区的序列最为保守，种系变化程度及进化率都很低，可用于区分主要基因型。
NS5b区变异交大，易于区分不同病毒株，常被选作亚型区分依据。
17淋病奈瑟菌的分子生物学检验最常用的检测目标是？P172 核酸的检测：1.PCR，2实时荧光定量PCR，3.连接酶链反应（LCR），4.链替代扩增技术(SDA)；耐药性检测：1.DNA测序，2.PCR-SSCP，3.PCR-RFLP，4.基因芯片技术18最常用的检测大肠杆菌O157：H7致病基因的方法是？主要检测的靶基因包括？P174 PCR是最常用的检测方法；主要检测的靶基因包括：stx1、stx2、eae 、ehxA 、saa19胎植入前诊断分子生物学技术主要包括？p2691 单细胞PCR技术（步骤包括模板制备、单细胞基因扩增及产物分析）2荧光原位杂交技术（FISH）20.真菌分子生物学检验常用？p1791.PCR技术2.PCR斑点杂交技术3.DNA指纹技术4.AP-PCR技术5.DNA序列分析6.基因芯片技术21 衣原体的特点。
衣原体能够通过细菌滤器、无肽聚糖、对r-干扰素敏感、基因组小、发育周期独断、专性活细胞内寄生的特殊原核细胞型微生物。
它广泛寄生于人，哺乳动物及禽类，少数致病。
它具有特征意义的特包涵体形态，细胞内定位，染色性。
22多发性骨髓瘤患者最常见的肿瘤标志物。
β2-微球蛋白（β2-MG）23目前c-erb B-2/HER2用于哪种肿瘤的诊断？答：乳腺癌24常见原癌基因有？抑癌基因有？答：常见原癌基因有：sis、int-2、erb、ras 等常见抑癌基因有：APC、P53、Rb 等具体见P21225何种常见遗传病可通过染色体检查而确诊？答：Donwn综合征（21三体综合征）具体见P24726根据乙肝表面抗原的抗原性差异，可以将乙肝病毒分为几个血清型？P143答：可以分为10个血清型，其中主要血清型有adr adw ayw ayr27STRs作为首选的群体遗传学和法医学研究的遗传标志物，其位点分析不可以应用于哪个方面p285答：1、同卵双生子的区分2、妊娠期胎儿父权的认定3、微量组织来源的鉴定28对于基因背景未知的点突变，通常不采用何种检测方法？P191答：不采用直接检测基因点突变的方法，如等位基因特异性寡核苷酸探针杂交、等位基因特异性PCR、PCR-限制性片段长度多态性分析、基因芯片、PCR-ELISA等技术。
29单基因遗传病主要遗传方式涉及几对等位基因，其传递呈典型的孟德尔式遗传一对30分子生物学检测技术中，需要结合电泳技术的有？蛋白质组学技术（双向凝胶电泳）31常用于结核分枝杆菌感染检测的分子生物学检测技术中，采用杂交保护试验原理的技术是？扩增结核分枝杆菌直接试验32.弓形虫DNA的主要形式是？三种形式：染色体DNA、线粒体DNA和胞质DNA33.采用PCR扩增TP的耐药菌株23srRNA基因，经测序发现A2058位点的碱基突变，用何种分析发现有酶切图谱的变化？PCR-RFLP（PCR--限制性酶切片段多态性分析）34.在医院细菌感染的常用分子学技术中，被认为是菌株分子分型金标准的是？脉冲场凝胶电泳（PFGE）35、高危型人乳头瘤病毒约几种？答：高危型HPV约20种，最经典的有13种（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73、82等）。
36、点突变涉及基因的？答：单个碱基（点突变也称为碱基置换，是指单个碱基的改变。
）37、PCR技术是新型隐球菌分子生物学检验最常用的方法，其中FQ-PCR和巢式PCR应用较多，常扩增的目的片段是？答：rDNA的复合体38.采用PCR、实时荧光定量PCR技术、巢式PCR和竞争性PCR检测肺炎衣原体DNA一般选择哪部分为靶序列设计引物？答：肺炎衣原体种特异性抗原MOMP基因39.镰状细胞贫血的分子机制。