一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811168480.7
(22)申请日 2018.10.08
(71)申请人 山东蔚蓝绿源生物科技有限公司
地址 251799 山东省滨州市惠民县何坊街
道办事处大济路以西、八里庄以南
(72)发明人 张云广　张棣信　张浩然　
(74)专利代理机构 北京一格知识产权代理事务
所(普通合伙) 11316
代理人 滑春生　赵永伟
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
C12N 1/02(2006.01)
A01P 3/00(2006.01)
C12R 1/07(2006.01)
(54)发明名称一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺(57)摘要本发明提供一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：生防菌分离筛选工艺，包括如下实验：（1）菌株分离实验；（2）菌株鉴定实验；（3）菌株适宜的生长温度实验；(4)芽孢菌株的耐热性实验；(5)菌株对真菌的抑制试验；(6)菌种产酶特性试验。

本发明采用生物防治的手段，减少农药的使用，解决白粉病对作物带来的危害，在生产实践中，很多作物都感染了白粉病，不过可能有个别株作物没有受到白粉病的侵害，这样可以从不受病害的作物上筛选出与病害作物上不同的菌株，然后进行发酵工艺优化，同时安排生防实验效果验证实验，
完成产品生产。

权利要求书1页 说明书3页CN 109294947 A 2019.02.01
C N 109294947
A
1.一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：生防菌分离筛选工艺，包括如下实验：（1）菌株分离实验；（2）菌株鉴定实验；（3）菌株适宜的生长温度实验；(4)芽孢菌株的耐热性实验；(5)菌株对真菌的抑制试验；(6)菌种产酶特性试验。

2.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于，生防菌发酵工艺，包括如下实验：（1）利用摇瓶对菌株的最适碳源、氮源、及无机盐分别进行实验，同时摸索菌株的最适生长温度及PH；（2）通过小罐对发酵；（3）进行中试，考察菌株的发酵性能。

3.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于：生防菌分离筛选工艺：从没有感染病害的作物叶面上筛选抗菌性能良好的枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于：生防菌分离筛选工艺：筛选指标包括碳源利用、氮源利用、抗菌性能、产酶特性和生长特性。

5.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于：步骤（2）菌株鉴定实验具体包括：①通过细菌的培养、形态学观察和生理生化等表型特征鉴定菌株特性；②采用16sRNA鉴定菌株的种类。

6.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于：还包括生防菌室内效果实验：包括菌株对指定致病细菌或真菌的抑制效果实验，通过抑菌效果好坏，考察该菌株的生防效果。

7.根据权利要求1所述的一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，其特征在于：还包括生防菌的大田效果实验：通过在大田养殖实地条件下，考察生防菌的生产及防治性能，考察生防菌实际的生防效果。

权　利　要　求　书1/1页CN 109294947 A
一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺
技术领域
[0001]本发明属于生物发酵技术领域，特别涉及一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺。

背景技术
[0002]减少农药污染，是农业生态环境保护工作的重要内容，也是自然保护工作的一个方面。

农作物大面积单一品种的种植，容易形成细菌病毒危害，造成作物减产，质量降低。

为了防治细菌病害，通常施用大量化学农药。

这虽然能起到暂时作用，但会带来一系列的环境问题。

例如农药污染使农产品质量下降；农药大量进入环境，破坏生态平衡；农药在杀死细菌的同时，连同害虫的天敌一并消灭，于是造成病虫害的再次猖獗。

多次使用同种化学农药，还会使细菌形成抗药性，从而给防治工作带来新的困难。

[0003]生防菌的优势在于不会破坏环境的生态平衡，通过竞争作用、分离抗菌肽物质、产生表面活性素、溶菌等多个方面来减少细菌及真菌对作物的影响，本项目所筛选的菌株主要针对草莓等作物的白粉病，通过生物防治的手段减少和降低白粉病的发病几率，尽可能的降低白粉病发生带来的危害。

[0004]白粉病系真菌性病害，解淀粉芽孢杆菌所产生的多种代谢产物对防治真菌有很好的效果，可以有效的防治白粉病的发生，从而减少药物的使用，减少环境及土地的污染。

发明内容
[0005]为了解决上述技术问题，本发明提供一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺。

[0006]本发明是通过如下技术方案实现的，本发明提供一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，包括以下步骤：生防菌分离筛选工艺，包括如下实验：（1）菌株分离实验；（2）菌株鉴定实验；（3）菌株适宜的生长温度实验；(4)芽孢菌株的耐热性实验；(5)菌株对真菌的抑制试验；(6)菌种产酶特性试验。

[0007]作为优选，生防菌发酵工艺，包括如下实验：（1）利用摇瓶对菌株的最适碳源、氮源、及无机盐分别进行实验，同时摸索菌株的最适生长温度及PH；（2）通过小罐对发酵；（3）进行中试，考察菌株的发酵性能。

[0008]作为优选，生防菌分离筛选工艺：从没有感染病害的作物叶面上筛选抗菌性能良好的枯草芽孢杆菌。

[0009]作为优选，生防菌分离筛选工艺：筛选指标包括碳源利用、氮源利用、抗菌性能、产酶特性和生长特性。

[0010]作为优选，步骤（2）菌株鉴定实验具体包括：①通过细菌的培养、形态学观察和生理生化等表型特征鉴定菌株特性；②采用16sRNA鉴定菌株的种类。

[0011]作为优选，还包括生防菌室内效果实验：包括菌株对指定致病细菌或真菌的抑制效果实验，通过抑菌效果好坏，考察该菌株的生防效果。

[0012]作为优选，还包括生防菌的大田效果实验：通过在大田养殖实地条件下，考察生防菌的生产及防治性能，考察生防菌实际的生防效果。

[0013]本发明的有益效果是：
本发明采用生物防治的手段，减少农药的使用，解决白粉病对作物带来的危害，在生产实践中，很多作物都感染了白粉病，不过可能有个别株作物没有受到白粉病的侵害，这样可以从不受病害的作物上筛选出与病害作物上不同的菌株，然后进行发酵工艺优化，同时安排生防实验效果验证实验，完成产品生产。

具体实施方式
[0014]应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。

除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0015]正如背景技术部分所介绍的，生防菌的优势在于不会破坏环境的生态平衡，通过竞争作用、分离抗菌肽物质、产生表面活性素、溶菌等多个方面来减少细菌及真菌对作物的影响，本项目所筛选的菌株主要针对草莓等作物的白粉病，通过生物防治的手段减少和降低白粉病的发病几率，尽可能的降低白粉病发生带来的危害。

白粉病系真菌性病害，解淀粉芽孢杆菌所产生的多种代谢产物对防治真菌有很好的效果，可以有效的防治白粉病的发生，从而减少药物的使用，减少环境及土地的污染。

[0016]本发明提供一种针对白粉病的解淀粉芽孢杆菌的分离筛选及发酵工艺，包括以下步骤：生防菌分离筛选工艺，包括如下实验：（1）菌株分离实验；（2）菌株鉴定实验；（3）菌株适宜的生长温度实验；(4)芽孢菌株的耐热性实验；(5)菌株对真菌的抑制试验；(6)菌种产酶特性试验。

[0017]生防菌发酵工艺，包括如下实验：（1）利用摇瓶对菌株的最适碳源、氮源、及无机盐分别进行实验，同时摸索菌株的最适生长温度及PH；（2）通过小罐对发酵；（3）进行中试，考察菌株的发酵性能。

[0018]生防菌分离筛选工艺：从没有感染病害的作物叶面上筛选抗菌性能良好的枯草芽孢杆菌。

[0019]生防菌分离筛选工艺：筛选指标包括碳源利用、氮源利用、抗菌性能、产酶特性和生长特性。

[0020]步骤（2）菌株鉴定实验具体包括：①通过细菌的培养、形态学观察和生理生化等表型特征鉴定菌株特性；②采用16sRNA鉴定菌株的种类。

[0021]还包括生防菌室内效果实验：包括菌株对指定致病细菌或真菌的抑制效果实验，通过抑菌效果好坏，考察该菌株的生防效果。

[0022]还包括生防菌的大田效果实验：通过在大田养殖实地条件下，考察生防菌的生产及防治性能，考察生防菌实际的生防效果。

[0023]生防菌的室内效果实验：
本实验以黄瓜为实验对象，取大棚的新鲜幼花（顶花），选择大小基本一致者，以10g/L 的次氯酸钠溶液浸3min，立即用大量自来水冲至无氯气味为止，黄瓜灰霉病菌在PDA上培养3小时后洗下孢子，浸渍过1小时，室温下自然风干12小时，然后喷布生防液，放置28℃恒温
箱中并保湿，5D后观察发病情况。

[0024]（3）生防菌的大田效果实验：
用清水作为对照，将发酵液稀释100倍，在小区进行喷雾，以10㎡小区为例，每小区喷雾量为750ml/㎡，先将病果摘除，确保初始发病率为零，然后进行喷雾，于5天后观察发病情况。

[0025]当然，上述说明也并不仅限于上述举例，本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述；以上实施例仅用于说明本发明的技术方案并非是对本发明的限制，参照优选的实施方式对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换都不脱离本发明的宗旨，也应属于本发明的权利要求保护范围。