DC的制备方法

DC的制备方法
发布时间：2015-12-07 15:03 点击次数：665
【背景】
DC 是「Dendritic Cells」的缩写，中文全称为「树突状细胞」，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。

DC 是由2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家Ralph M. Steinman 于1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。

已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始T 细胞（Naïve T cells）增殖的APC，而其它种类的APC（如单核巨噬细胞，B 细胞等）仅能刺激已活化的或记忆性的T 细胞，因此DC 是机体适应性T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。

【培养原理】
因为DC 需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为 2 个步骤进行培养：
Step 1：从DC 的祖细胞（如单核细胞）诱导分化为未成熟DC（immature DC，iDC）；
Step 2：从iDC 诱导分化为成熟DC（mature DC，mDC）。

Step 1：
GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）：
GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。

GM-CSF 是最早被鉴定出对DC 培养有作用的细胞因子之一。

GM-CSF 在DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II 类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。

此外，GM-CSF 也可促进DC 的存活。

IL-4（白细胞介素-4）
IL-4 在由单核细胞诱导成DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC 方向分化。

若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。

同时，IL-4 还有降低细胞表面表达CD14 分子的能力。

CD14 表达水平的降低是单核细胞分化为DC 的重要标志。

GM-CSF 和IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC，此时的DC 具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。

细胞表面中度表达MHC I 类、II 类分子和B7 家族分子（CD80, CD86 等），但不表达或低表达CD14。

Step 2：
TNF-α/IL-1β/ IL-6（肿瘤坏死因子-α/白细胞介素-1β/白细胞介素-6）
TNF-α，IL-1β和IL-6 均为促炎症因子，在感染局部和肿瘤部位被诱导产生。

体外研究表明，这3 种细胞因子均可下调未成熟DC 的巨胞饮作用和表面Fc 受体的表达，使细胞内MHC II 类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面MHC I 类、II 类分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表达，使未成熟DC 分化为成熟DC，此时DC 的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强地激活T 细胞。

TNF-α/IL-1β/IL-6 三因子组合可在无牛血清培养条件下诱导DC 的完全成熟，从而制备出可以应用于临床的DC。

PGE2（prostaglandin E2，前列腺素E2）
PGE2 也是炎性介质，可由TNF-α，IL-1 和LPS（脂多糖）等炎症信号诱导产生。

在
TNF-α/IL-1β/IL-6 成熟诱导组合中添加PGE2，可进一步提高DC 的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力。

【注意事项】
1. DC 的来源：
DC 有多种来源，包括外周血单核细胞（Monocyte）、脐带血CD34+细胞、骨髓和胎肝等，但因外周血单核细胞最容易获取、数量也最多，所以临床上被广泛用作DC 的来源细胞。

2. DC 的成熟度：
我们知道，DC 有未成熟和成熟两种状态，即iDC 和mDC，而DC 的抗原递呈能力与其成熟状态密切相关。

iDC 的抗原摄取和加工能力较强，但抗原递呈能力很弱。

在体外培养时，iDC 去除细胞因子(即GM-CSF 和IL-4)后，会逆转为巨噬细胞，且即使在细胞因子的维持下，未成熟DC 的功能也不是激活T 细胞，而是抑制T 细胞的增殖。

mDC 则正好相反，其抗原摄取和加工能力很弱，但具有很强的抗原递呈能力。

因而可以激活T 细胞，引起免疫反应。

而且DC 成熟后即使在培养体系中去除细胞因子，仍能保持DC 的状态和功能，不会发生逆转。

因此可以看出，DC 必须完全成熟后才能用于免疫治疗。

3. DC 的无牛血清培养：
不能将iDC 诱导成为mDC，或仅能诱导一小部分iDC 成为mDC。

DC 最初都是在含有小牛血清（Fetal Calf Serum，FCS）的培养体系中获得的，但我们知道，如果想将DC 应用于临床治疗，则不能使用FCS。

然而如果不用FCS，DC 则无法培养成功。

科学家最先想到的是用10%的人自体血浆来替代10%的FCS，但实验结果表明，人单核细胞在含10%人自体血浆的培养液中培养，用GM-CSF 和IL-4 诱导7 天后，大多数单核细胞仍贴壁，半悬浮的iDC 数量非常少。

后来经过不断摸索发现，在无血清培养基中添加1%人自体血清对于从单核细胞诱导成为iDC 效果最好。

更为困难的步骤是如何在无牛血清培养体
系中将iDC 诱导成为mDC。

TNF-α和IL-1β 在含牛血清培养体系中均是很好的DC 成熟诱导剂，而在无牛血清培养体系中，两者均无效或效果微弱，即在无牛血清清培养体系，TNF-α和IL-1
后来的研究表明，用单核细胞条件培养基（Monocyte-conditioned medium，MCM），即单核细胞在包被有免疫球蛋白的细菌平皿上无牛血清培养24 小时后得到的培养上清，可在无牛血清培养体系中诱导DC 的完全成熟。

因此认为，1%人自体血浆+ MCM 可能成为临床上获得成熟DC 的标准方法。

但每次制备的MCM 的一致性很难保证，导致每批MCM 必须经过测试后才能确定最适用量，这给临床应用带来阻力和不稳定性。

所以，人们一直想寻找到能够替代MCM 的化学成分明确的成熟诱导组合。

1997 年，德国美因茨大学（Mainz University）的Jonuleit 等取得了突破性进展，他们发现TNF-α，IL-1β 和IL-6 三种细胞因子的组合可完全替代MCM，在无牛血清培养体系中能够将iDC 诱导成完全成熟的DC。

4. PGE2 与DC：
德国美因茨大学的Jonuleit 在证明TNF-α，IL-1β 和IL-6 三种促炎症因子的组合可完全替代MCM，在无牛血清培养体系中能够将iDC 完全诱导成熟的同时，也发现另一种炎症介质，即PGE2 可进一步提高DC 的产量、成熟度、迁移能力和免疫激活能力，也就是说在TNF-α，IL-1β 和IL-6 之外添加PGE2 可获得更为成熟和高效的DC，这样会提高临床上DC 的治疗效果。

PGE2 常被加入DC 成熟诱导组合中最重要的原因是其可提高成熟DC 的迁移能力，这样可使DC 更容易到达淋巴结，从而引起免疫反应、治疗肿瘤。

但我们也应该注意以下几点：
1）PGE2 不能添加到DC 诱导分化的Step 1 中，如加入，DC 的分化将会被抑制；
2）我们知道，能诱导机体产生Th1 反应的DC（很多文献中称为DC1）有助于多种肿瘤，如黑色瘤和恶性胶质瘤等的治疗。

实验研究表明，在成熟诱导因子(TNF-α/IL-1β)中加入PGE2 倾向于将iDC 诱导成为成熟的DC2，而非DC1，该DC 会诱导产生Th2 反应。

所以很多人在试图寻找能够诱导DC1 的最佳成熟诱导组合，如TNF-α/IL-1β/IFN-α/IFN-γ/poly-I:C，TNF-α/IL-1β/IFN-γ/PGE2(低浓度)/R848(TLR7/8 激动剂)和
IFN-γ/LPS 序贯组合等，但这些新组合都未得到临床上的充分验证，也就没有真正用于临床级别DC 的制备。

3）其实，各家的研究结果不尽相同。

比如，TNF-α/IL-1β/IL-6/PGE2 组合的创立者
---德国美因茨大学的Jonuleit 在研究时就发现，添加PGE2 诱导成熟的DC 在刺激T 细胞时可显著提高其分泌的IFN-γ 产量，而对IL-4 和IL-10 的分泌无影响，提示添加PGE2 诱导成熟的DC 具有诱导Th1 反应的倾向。

总之，培养体系中是否加入小牛血清，以及所使用的无血清培养基种类不同等诸多因素都可能导致添加PGE2 诱导成熟的DC 在性质上的差异，因此临床上制备DC 时最好能够做充分的前期研究，然后确定用于治疗某种肿瘤最好的制备方法。

【DC 的制备】
1. 外周血单个核细胞的采集
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。

1.3 无血清培养液洗涤2 次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。

2. (可选步骤) 肿瘤抗原的制备
用于负载DC 的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。

用TSA 或TAA 负载的DC 具有很好的靶向性，但该方法具有已确定的肿瘤特异性抗原或抗原肽种类少和单一抗原的免疫攻击经常无法杀伤肿瘤细胞等缺陷。

而用肿瘤全细胞抗原负载DC 可克服这些缺陷，因为此时无需知道哪些抗原是肿瘤细胞的TSA 或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC 可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆，从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。

肿瘤细胞全抗原负载DC 的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC 融合等。

目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。

反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；
2.2 无菌生理盐水洗3 次；
2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640 培养基，充分研磨；
2.4 200 目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
2.5 用RPMI 1640 培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml 无菌冻存管中；
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min 后取出，再迅速放入37oC 水浴中解冻10 min。

反复3-5 次；
注：也可以-80oC/37oC 反复冻融3-5 次。

2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；
m 滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体； 2.8 收集上清，0.22
2.9 -80oC 保存备用。

3. DC 细胞的培养及鉴定
3.1 步骤1 中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；
3.2 37℃，5% CO2 培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁；
3.3 洗去悬浮细胞，在贴壁细胞中加入含重组人GM-CSF(500-1,000U/ml)和重组人IL-4 (500U/ml)的无血清培养液，37℃，5% CO2 培养箱中培养，诱导单核细胞向DC 细胞分化；
3.4 每2-3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
3.5 (可选步骤) 在培养的第5d，加入步骤2 中获得的肿瘤抗原50 μg/ml，对DC 进行抗原负载；
注：若不对DC 进行抗原负载，该步省略。

3.6 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(10ng/ml)，IL-1β(10ng/ml)，IL-6(1000U/ml)和PGE2(1μg/ml)，诱导DC 细胞成熟；
3.7 在培养的第7d 或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；
3.8 DC 的质检：
3.8.1 活细胞比例：台盼蓝染色验证活细胞应在90%以上；
3.8.2 形态学观察：>90%细胞半悬浮，细胞有多个树突样突起；
3.8.3 细胞表型分析(见下图)：流式细胞术检测DC 细胞表面CD14、HLA-DR、CD40、CD80、CD83 和CD86 等分子的表达，成熟的DC 不表达CD14，而高表达其他分子。

CD83 是成熟DC 的特异性标志，在单核细胞和不成熟DC 表面不表达或低表达。

3.8.4 无菌检测：收获细胞前取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，均应为阴性；
3.8.5 内毒素检测：收获细胞前取少量培养物，回输前，用鲎试剂检测内毒素含量，标准：内毒素<0.5 EU/ml。

【DC 培养试剂推荐】
生产商产品名称产品编号产品规格使用浓度
PeproTech 重组人GM-CSF
(Animal Free)
AF-300-035mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg50-100ng/ml
PeproTech 重组人IL-4 (Animal
Free)
AF-200-045mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg100ng/ml
PeproTech 重组人TNF-a
(Animal Free)
AF-300-01A10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg10ng/ml
PeproTech 重组人IL1-b (Animal
Free)
AF-200-01B2mg/10mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg10ng/ml
PeproTech 重组人IL-6 (Animal
Free)
AF-200-065mg/20mg/50mg/100mg/250mg/500mg/1mg100ng/ml
PeproTech
(BioGems)
PGE2 (前列腺素E2)363246410mg/50mg1mg/ml
注：Animal Free 意为无动物成分。

无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动物源性物质，
尤其是牛的病原体和蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。

这样可避免动物病原
体（如疯牛病，克雅氏病等）的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细
胞培养过程中最好使用无动物成分的重组细胞因子。

【DC 鉴定试剂推荐】
注：用于DC 鉴定的表面标志物的表达在流式图上均呈现单个峰，且多数情况下不能与阴性峰完全区分开来。

为避免多色分析时补偿调节不好导致结果的不准确性，建议最好用单标，最多用双标来做DC 表面标志的分析，而且必须使用同型对照，而非空白细胞对照来排除背景染色。

【参考文献】
[1] Steinman RM, Cohn ZA. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 1973; 137 (5): 1142–62.
[2] Bender A, Sapp M, et. al. Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood. J Immunol Methods. 1996; 196(2):121-35.
[3] Romani N, Reider D, et. al. Generation of mature dendritic cells from human blood. An improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol Methods. 1996; 196(2):137-51.
[4] Jonuleit H, Kühn U, et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur J Immunol. 1997; 27(12):3135-42.
[5] Datta J, Terhune JH, et al. Optimizing dendritic cell-based approaches for cancer immunotherapy. Yale J Biol Med. 2014; 87(4):491-518.
[6] de Jong EC, Vieira PL, et al. Microbial compounds selectively induce Th1 cell-promoting or Th2 cell-promoting dendritic cells in vitro with diverse th cell-polarizing signals. J Immunol. 2002 Feb 15;168(4):1704-9.
[7] 张志伟，宋鑫。

DC-CIK 细胞临床制备规范化研究。

中国肿瘤，2011；20(2)：85-88。

/news/2778251.htm。