疏水层析经验 感谢原创者
疏水吸附层析
疏水吸附层析疏水吸附层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）是一种基于水相和非极性相互作用的柱层析技术。
它广泛应用于生物制药领域，用于蛋白质和其他生物大分子的纯化和分离。
疏水吸附层析的原理是基于非极性物质（如蛋白质）在水相中寻找非极性环境的趋势。
在疏水吸附层析柱中，固定相通常是羟基丙基磺酸琼脂糖（hydroxypropyl sulfobutyl ether cellulose, HSC）。
这种材料具有疏水性，可与非极性物质发生相互作用。
在疏水吸附层析中，样品通常首先在高盐浓度的缓冲液中溶解，以保持蛋白质的稳定性。
然后，样品溶液被加载到疏水吸附柱中。
由于柱中固定相的疏水特性，非极性物质会在柱上发生吸附，而极性物质则会在柱上流经，被洗脱出来。
这样，非极性物质与样品中的其他成分被有效地分离。
在疏水吸附层析过程中，可以通过改变盐浓度和pH值来控制样品的吸附和洗脱。
较高的盐浓度有助于增强非极性物质与固定相之间的相互作用，从而增加吸附能力。
而较低的盐浓度和适当的pH值可以使非极性物质从柱上洗脱出来。
疏水吸附层析具有许多优点。
首先，它可以在较温和的条件下进行，使得对生物大分子的保护更好。
其次，疏水吸附层析可以在一次操作中实现高纯度的分离，从而减少了后续步骤的需求。
此外，疏水吸附层析也具有较高的样品加载能力和较高的分离效率。
疏水吸附层析在生物制药领域有广泛的应用。
例如，在制备重组蛋白质时，常常需要从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
疏水吸附层析可以通过与其他成分的选择性相互作用，将目标蛋白质有效地分离出来。
此外，疏水吸附层析还可以用于分离和纯化抗体、酶、疫苗等生物制品。
疏水吸附层析是一种有效的柱层析技术，可用于生物大分子的纯化和分离。
它利用水相和非极性相互作用的原理，通过调节盐浓度和pH值，实现非极性物质与其他成分的分离。
疏水吸附层析在生物制药领域具有广泛的应用前景，有助于提高生物制品的纯度和产量。
4 疏水层析
二、操作
1.制备层析柱 2.加样与洗脱
3.层析柱再生
三、应用
1．纯化鸡胗钙调蛋白[2]
2．纯化苯丙氨酸裂解酶
纯化钙调蛋白的流程图
纯化苯丙氨酸裂解酶
（二）吸附剂
根据基质的性质不同分为： 1.亲水性吸附剂：目前这类吸附剂主要是交联琼脂糖 （Sepharose）,配体有苯基和辛基化合物。二者耦合而成 特点：不耐压，一般仅用于常压层析系统 2.非亲水性吸附剂：这类吸附剂的基质有硅胶、树脂等， 配体为苯基、辛基和烷基等，二者通过共价键结合 特点：耐压，机械性能好。不仅适用于常压层析，特别适 用于高压层析（如HPLC等）
ห้องสมุดไป่ตู้
它也属于吸附层析一类
根据被分离组分分子表面的疏水残基与固定相的疏水
配基之间结合力差异进行的层析分离方法
一、基本原理
利用被分离组分分子表面的疏水补丁、（可逆）变性
后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分子表面的
疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作用强弱，依次用 从高至低离子强度洗脱液可将疏水作用由弱到强的组分分 离开
第四章 疏 水 层 析
疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析， 从作用机制来看，它属于吸附层析。“疏水 作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋
白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者
发表用疏水层析成功分离蛋白质的文献报道； 如钙调蛋白、苯丙氨酸裂解酶、凝集素等
疏水层析的概念
疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，
（一）疏水作用
蛋白质与固定相结合原理 蛋白质表面存在的疏水补丁
蛋白质发生（局部可逆性）变性时，原本隐藏于分子内 部的疏水残基暴露至分子表面
生物大分子分离纯化技术 之疏水作用层析(19页)
生物大分子分离纯化技术
五、实验方法 1.胶的溶涨 用缓冲液或去离子水将凝胶清洗， 去除其中的有机溶剂。 2.装柱 疏水层析使用短而粗的层析柱，一般高 度为5-15cm，而柱的直径则由样品量决定。 3.平衡 用3-5倍柱床体积的起始缓冲液冲洗、平 衡柱床。
生物大分子分离纯化技术
二、基本原理 疏水作用(疏水力)是浸在一种极性液体(如
水)中的非极性物质为避开水而被迫相聚的自然 趋势。蛋白质分子中有许多非极性的氨基酸， 如色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸等。暴 露于球形蛋白质表面的非极性氨基酸侧链可以 密集在一起形成疏水区域。
生物大分子分离纯化技术
疏水作用层析是以介质疏水基团和蛋白质表面 疏水区域的亲和作用为基础，利用在载体的表面偶 联疏水性基团为固定相，根据这些疏水性基团与蛋 白质分子疏水区之间相互作用的差别，对蛋白质类 生物大分子进行分离纯化。
生物大分子分离纯化技术
4.加样 上样总量一般在200-500mg。因疏水作用层
析的操作在高盐条件下进行，因此，在加样前 不需特殊处理，只要加入适当的盐并调整好pH 值。但若样品中有盐酸胍和尿素类物质时则应 去除，以防影响吸附。
生物大分子分离纯化技术
5.洗脱 疏水层析的洗脱过程是一个不断降低盐浓度
生物大分子分离纯化技术
三、介质 在疏水层析中，介质(又称吸附剂)一般由
载体(基质)和配体(疏水性基团)两部分构成。 其中基质有亲水性和非亲水性之分，而配体为 大小不等的疏水侧链(烷基或芳香基)，它们对 疏水性物质有一定的吸附力。
生物大分子分离纯化技术
四、影响疏水性吸附的因素 1.配体的类型
疏水性吸附剂的吸附作用与配体的密度成正比，配体密 度过小则疏水作用不足，但密度过大则洗脱困难。增加碳氢 链长度，其疏水性增强，(例如苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏 水性低)，只有少数疏水性强的蛋白质可被吸附，但由于疏 水作用太强，需用极端方法洗脱，可能导致蛋白质变性。
疏水层析
特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离，样 特点：利用样品与介质疏水性大小进行分离， 品不必脱盐。 品不必脱盐。 原理：1.疏水作用，Pr与疏水固定相结合。 原理：1.疏水作用，Pr与疏水固定相结合。 疏水作用 与疏水固定相结合 Pr表面的疏水补丁 表面的疏水补丁。 （1）Pr表面的疏水补丁。 Pr局部变性 暴露疏残基。 局部变性， （2）Pr局部变性，暴露疏残基。 （3）高盐浓度下 1mol/L(NH4)2SO4,2mol/LNaCl, Pr表面疏水表面与固定相结合。 Pr表面疏水表面与固定相结合。 表面疏水表面与固定相结合
原理：2.吸附剂： 原理：2.吸附剂： 吸附剂 配体：苯基C6 辛基C8 烷基C18 C6， C8， 配体：苯基C6，辛基C8，烷基C18 介质：硅胶、树脂如phenyl、 介质：硅胶、树脂如phenyl phenyl、 sepharose FF 、 sepharose CL-4B CL-
洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出； Pr先流出 洗脱：盐浓度高，疏水弱的Pr先流出； 盐浓度低，疏水强的Pr后流出。 Pr后流出 盐浓度低，疏水强的Pr后流出。
特点：基质结合配体密度大、疏水性强， Pr类 特点：基质结合配体密度大、疏水性强，对Pr类 吸附性强，不容易洗脱下来,需加有机相(降低极 吸附性强，不容易洗脱下来,需加有机相( 性),使Pr易变性。 ),使Pr易变性。 易变性
吸ห้องสมุดไป่ตู้剂
疏水层析 吸附层析 亲水性或疏水性基质 颗粒状极性与非极性吸附剂 疏水性基团（配体） 固定相 +疏水性基团（配体） 极性物： 洗脱剂由 极性物：盐梯度 流动相 高盐→低盐
极性大→小 极性大→小
非极性：有机溶剂 非极性：
极性小→大 极性小→大
疏水作用层析
疏水作用层析1. 疏水层析的原理：疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography，HIC）是根据分子表面疏水性差别来分离蛋白质和多肽等生物大分子的一种较为常用的方法。
由于蛋白质是一类有序三维结构的活性大分子，但其空间排列很容易受到外界环境的影响，极易从有序的结构变成无序结构。
当立体结构发生变化时，常常失去原有的活性，即蛋白质的失活。
使用适度疏水性的分离介质，在含盐的水溶液体系中，借助于分离介质与蛋白质分子之间的疏水作用达到吸附活性蛋白分子的目的，这种层析技术称为疏水作用层析。
蛋白质的一级结构中有很多非极性氨基酸，这些氨基酸在三级结构上由于疏水相互作用会被尽量包在分子内部，但是仍不可避免地有一些非极性侧链暴露在表面，这些非极性的表面是它和疏水层析介质作用的结合部位。
因为蛋白质分子的疏水性不同，它们和疏水层析介质的作用力强弱也不同，所以非极性表面的大小和含量决定了蛋白质分子的疏水性强弱。
疏水层析就是利用各种蛋白质分子和疏水功能基团之间作用力的差异对蛋白质进行分离、纯化的一种技术。
蛋白质可以看成是一种有亲水性外壳包裹着疏水性核心的四级结构的复杂体系。
蛋白质表面存在一些非极性的疏水基团，这些基团多为非极性的氨基酸残基。
由于各种基团疏水性的差别、疏水基团暴露数量的不同、疏水区与亲水区在数量、大小和分布的不同等因素，使各种蛋白质之间存在较大的差异，同时，对于同一种蛋白质在不同的溶液中，使疏水基团暴露的程度也呈现出一定的差异。
由于这种差异，致使各种蛋白质分子与同一种分离介质疏水基团的相互作用不同，吸附能力不同，可以达到分离的目的。
如果在水溶液中加入中性盐，使溶液处于高盐浓度时，可以破坏蛋白质分子表面水分子的有序排列，使大分子与分离介质的功能基团之间产生疏水作用。
同时，由于高盐的存在，使蛋白质分子的疏水基团暴露增多，增加了大分子的疏水性，增强了蛋白质分子与分离介质功能基团之间的疏水作用，相互结合力增强。
疏水作用层析法蛋白质纯化实验原理及步骤
疏水作用层析法(蛋白质纯化实验)原理及步骤原理在疏水层析的主要支持介质上含有大小不等的疏水侧链，烷基或芳香基，可是绝大多数情况起作用的是苯基或辛基。
当碳氢链长度增加，即变得更疏水时，疏水强的少量蛋白质被吸附。
这时疏水相互作用太强，需用极端方法洗脱，可能会导致蛋白质变性。
苯基琼脂糖比辛基琼脂糖疏水性低，是疏水纯化中效果不错的常用介质，尤其是试用于纯化开始时。
疏水相互作用介质苯基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-C6H5辛基琼脂糖-0-CH2-CH0H-CH2-0-(CH2)7-CH3溶液盐浓度增加时疏水作用变得更强。
因此，大多数疏水层析程序都是高盐时上样，降低盐浓度时洗脱。
所以在硫酸镂沉淀或离子交换层析后可以方便地直接进行疏水层析纯化。
温和的洗脱条件及高蛋白质结合容置(10~100mg∕m1)使疏水层析在蛋白质纯化中成为很有价值的方法，也是更换缓冲液的方法之一。
材料与仪器蛋白质样品液苯基琼脂糖C1-4BNaC1硫酸铉磷酸钠盐层析柱步骤下述方案设定样品是在75%硫酸镂沉淀后溶在50%硫酸镂溶液的情况。
1.装填5m1苯基琼脂糖C1-4B进入柱内；2.10倍柱床体积层析缓冲液(20mmo1∕1,PH7.0磷酸钠盐，50%硫酸钱)洗柱；3.调整样品液符合要求，即在pH7.0磷酸钠缓冲液中含50%硫酸镂。
上样总蛋白量200-500mg；4.3倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至A280值回到基线；5.用分步梯度法洗脱。
每步依次分别采用两倍体积各含40%、30%、20%、10%或0%硫酸镂的pH7.0磷酸钠缓冲液洗脱；6.再依次用5倍体积水、5倍体积1mo1/1NaC1和5倍体积水洗柱，使其获得再生。
疏水吸附层析
疏水吸附层析疏水吸附层析是一种常用的色谱技术，它通过利用物质在水和非极性溶剂之间的亲疏水性差异，实现物质的分离和富集。
本文将从定义、原理、应用和发展等方面，对疏水吸附层析进行详细介绍。
一、定义疏水吸附层析是一种液相色谱技术，它利用疏水吸附剂选择性吸附待分离物质，并通过调节溶剂极性来实现物质的分离。
疏水吸附剂一般是非极性的固体材料，如疏水性聚合物、硅胶等。
二、原理疏水吸附层析的原理是基于物质在水和非极性溶剂之间的亲疏水性差异。
在疏水吸附剂中，水相中的物质会与疏水吸附剂发生亲和作用，而非极性溶剂中的物质则与疏水吸附剂发生排斥作用。
通过调节溶剂极性，可以改变物质与疏水吸附剂的相互作用，从而实现分离和富集。
三、应用疏水吸附层析广泛应用于生物医药、食品安全、环境监测等领域。
在生物医药领域，疏水吸附层析可用于蛋白质纯化、抗体富集等。
在食品安全领域，疏水吸附层析可用于农药残留的检测和分离。
在环境监测领域，疏水吸附层析可用于有机物的富集和分离。
四、发展疏水吸附层析技术在过去几十年中得到了广泛的发展和应用。
随着新材料、新方法的不断涌现，疏水吸附层析技术的分离效果和选择性得到了显著提高。
例如，疏水性纳米材料的引入使得疏水吸附层析在纳米材料分离和纳米颗粒富集方面取得了重要进展。
疏水吸附层析作为一种简单、高效的分离技术，具有操作简单、成本低、分离效果好等优点。
它不仅能够实现物质的分离和富集，还能够提高分析灵敏度和减少干扰物质的影响。
因此，疏水吸附层析在实际应用中具有广阔的前景。
疏水吸附层析是一种重要的分离技术，在生物医药、食品安全、环境监测等领域具有广泛的应用。
随着新材料和新方法的不断涌现，疏水吸附层析技术将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和实际应用提供有力支持。
疏水层析原理
疏水层析原理
疏水层析原理，也称为非极性层析原理，是一种分离和纯化化合物的常用方法。
该原理利用化合物在疏水性固定相（如疏水性硅胶）和溶剂中的亲水性差异来进行选择性分离。
在疏水层析中，化合物混合物首先通过一个填充有疏水性固定相的柱子（如硅胶柱）；然后用一个选择性的溶剂进行洗脱，使得各种化合物可以以不同的速度从柱中流出。
疏水性固定相作为分离介质，最主要的特点是表面疏水性强，与非极性或疏水性化合物具有较好的相互作用能力。
这种相互作用可以通过范德华力、氢键等进行，使得疏水性化合物被相互作用力留在柱上。
而亲水性化合物则更容易与溶剂发生作用而从柱中洗脱。
在进行疏水层析时，溶剂的选择是非常重要的。
选择的溶剂应该足够强大，可以与疏水性化合物发生相互作用，从而实现其分离。
常用的溶剂包括乙腈、甲酸乙酯、异丙醇等。
总之，疏水层析原理是通过利用化合物在疏水性固定相和溶剂中的亲水性差异，实现化合物的选择性分离。
这种方法在分析化学和生物化学等领域中广泛应用，能够有效地纯化和分离化合物。
第七章 层析分离技术(6)疏水作用层析
2. 流动相组成
4）降低蛋白质疏水作用的物质
除了促溶盐类和表面活性剂以外，乙二醇和 丙三醇等含羟基的物质也具有影响水化的作 用，降低蛋白质的疏水性作用，经常用作洗 脱促进剂。 这类物质适合用于疏水性吸附很强、紧靠降 低盐浓度难以洗脱的高疏水性蛋白质的洗脱。 但是它们的存在可能会破坏蛋白质大分子的 空间结构，所以在HIC过程中应尽量避免使 用此类试剂。
2. 流动相组成
2）pH
Hjerten等人研究了流动相pH的变化对若 干蛋白质的影响，发现在pH5～8.5范围 内pH的改变对蛋白质保留值的影响较小， 超出此范围会有较大的影响。
2. 流动相组成
3）表面活性剂
表面活性剂可与吸附剂及蛋白质的疏水部位结 合，从而减弱蛋白质的疏水性吸附。根据这一 原理，难溶于水的膜蛋白可添加一定的表面活 性剂使其溶解，利用HIC法进行洗脱分离。 选择表面活性剂的种类和浓度应当适当，浓度 过小，膜蛋白不能充分溶解，浓度过大，抑制 蛋白质的吸附。一般使用较温和的表面活性剂， 如：Tween（吐温）-20、40、60、80和Span （司盘）-20、40、60、80等。
7.6 疏水作用层析
疏水作用色谱的应用实例
kDa
116.0 66.2 45.0 35.0 25.0
M
1
2
3
2
3
Fig. 15 The Results of Purification of Recombinant Protein from E.coli(pET-ES) by HIC 1—Crude Protein; 2-- Break through from HIC; 3-- Elutriant from HIC
疏水层析
生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A)B)高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基；◦ 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
04第四章 疏水层析
3.装柱 将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于 乙醇溶液中,浸泡一段时间; 采用离心(或过滤)方法,弃上清液,收集沉淀物; 并以50%(m/V)浓度悬浮于样品缓冲液中; 尔后,按常规方法装入层析柱,经洗涤,平衡完毕, 即可加样.
二,加样与洗脱
加样前,在样品溶液中要补加适量的盐类.
反相层析: 与基质结合的配体密度大 疏水性强 密度大,疏水性强 密度大 疏水性强,对蛋白 质类物质具有较大的吸附力; 欲将吸附物解析下来,须用含有机溶剂 机溶剂的流动 机溶剂 相(降低极性)洗脱,方可见效. 洗脱液的极性 极性降低,常常会引起大分子活性物 极性 质变性, 因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量 的肽类 辅基 肽类和辅基 肽类 辅基等物质.
1.亲水性吸附剂 基质主要是: 交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) 配体是: 苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的 苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂
2.非亲水性吸附剂 基质有: 硅胶,树脂(苯乙烯,二乙烯聚合物)等 配体为:苯基,辛基,烷基(C4,C8,C18)等. 二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂.
亲水性强的蛋白质 蛋白质与疏水性固定相结合作用原理 固定相结合作用原理 蛋白质 固定相 一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch); 二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想),暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基; 三是:高盐作用.疏水层析的特性所致,即在高盐浓度 高 下,暴露于分子表面的疏水性残基 疏水性残基 疏水性固定 疏水性残基才能与疏水性固定 疏水性 相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然去结缔组织)切成1cm3小块, 置组织捣碎机中,加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol/L TrisHCl,pH8.0,2mmol/L EDTA,1mmol/Lα-巯基乙醇)高速匀浆三 次(30s/次), 离心(8000 r/min,4℃,0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重 复抽提一次),合并抽提液, 加硫酸铵盐析(pH8.0,60%饱和度),除去大量杂蛋白, 上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0),离心收集含有效成分 的沉淀物, 加蒸馏水悬浮,用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0,令其 缓慢溶解, 经透析,离心得到溶液
第4章 疏水层析
• Elute
2014-5-1
海南大学农学院wss19
Equilibration
1. Equilibration
第四章
疏水层析
Hydrophobic interaction chromatography，HIC
2014-5-1
海南大学农学院wss1
内容提要
第一节 基本原理
• 疏水作用 • 吸附剂
第二节 操作与应用
• 层析柱的制备 • 加样和洗脱 • 应用实例
2014-5-1 海南大学农学院wss2
疏水层析和反相层析（reversed
Washing out unbound material
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution
Non-bound proteins
Abs
Conc. salt
2014-5-1
海南大学农学院wss22
Elution
1. Equilibration 2. Sample application 3. Washing 4. Elution
海南大学农学院wss10
Type of base matrix • Cross-linked agarose • Synthetic copolymer materials
AGAROSE
SOURCE 15
2014-5-1
海南大学农学院wss11
2．非亲水性吸附剂
疏水层析原理
疏水层析原理疏水层析是一种常用的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析原理是基于样品成分在疏水固定相和流动相之间的亲疏水性差异而建立的，下面将详细介绍疏水层析原理及其应用。
首先，疏水层析原理的核心是疏水作用。
疏水作用是指非极性物质在水相中受到排斥的倾向，因此在含有疏水基团的分子中，分子内部的疏水基团之间会发生疏水相互作用，使得分子趋向于聚集在一起形成疏水相。
而在疏水固定相中，也存在着疏水基团，因此样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异就是基于这种疏水作用而产生的。
其次，疏水层析原理的应用非常广泛。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域都有着重要的应用。
例如在蛋白质纯化过程中，疏水层析可以利用蛋白质分子中的疏水氨基酸残基与疏水固定相之间的相互作用，实现对蛋白质的分离和纯化。
在药物分析领域，疏水层析也常用于药物的提取和分离，通过调节流动相的成分和流速，实现对复杂混合物中药物的有效分离。
此外，疏水层析原理还可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
例如与离子交换层析、亲和层析等技术结合，可以实现对复杂混合物中成分的更精确分离和纯化。
同时，疏水层析也可以与质谱联用，实现对样品成分的快速鉴定和定量分析。
总之，疏水层析原理是一种重要的分离技术，它利用样品成分在疏水固定相和流动相之间的分配差异，实现对混合物中成分的分离和纯化。
疏水层析技术在生物化学、生物医药、环境监测等领域有着广泛的应用，而且可以与其他分离技术相结合，发挥更大的作用。
通过对疏水层析原理的深入理解和应用，可以为科研工作者和工程技术人员提供更多的选择和可能性。
寡核苷酸药物疏水层析纯化 -回复
寡核苷酸药物疏水层析纯化-回复寡核苷酸药物的疏水层析纯化是一种常用的纯化方法，可以将复杂的混合物中的寡核苷酸分离出来。
本文将一步一步回答关于寡核苷酸药物疏水层析纯化的相关问题。
第一步：准备工作在进行寡核苷酸药物疏水层析纯化前，我们首先需要准备一些必要的试剂和设备，包括：1. 疏水层析柱：常用的疏水层析柱材料有丙烯酰胺凝胶、适合于生物大分子分离的亲水柱等。
2. 缓冲液：一般选择pH适宜范围的缓冲液，常用的缓冲液有PBS、Tris-HCl等。
3. 溶液：寡核苷酸药物的溶液通常为无菌水或缓冲液。
4. 色谱梯度洗脱液：一般使用的洗脱液为有机溶剂、盐浓度递增或pH变化的缓冲液。
5. 分析方法：为了监测纯化过程中的寡核苷酸药物的纯度和生物活性，需要选择适当的分析方法，如高效液相色谱(HPLC)、凝胶电泳等。
第二步：制备样品在进行疏水层析纯化之前，我们需要制备寡核苷酸药物的样品。
通常的制备方法包括：1. DNA合成：如果我们要研究的是DNA寡核苷酸药物，我们可以通过化学合成的方法制备所需的DNA片段。
2. RNA转录：如果研究的是RNA寡核苷酸药物，我们可以通过RNA转录的方式合成所需的RNA片段。
3. 提取纯化：在一些情况下，我们可以从生物样品（如细胞、组织）中提取寡核苷酸药物，并进行纯化。
第三步：疏水层析纯化过程1. 样品预处理：将制备好的寡核苷酸药物样品先进行预处理。
预处理能够去除一些杂质，例如通过加入酶或酶切除可能存在的剩余DNA、RNA、蛋白质等。
2. 柱平衡：将疏水层析柱用缓冲液进行平衡，以达到适合的吸附条件。
3. 样品加载：将预处理好的样品加入到疏水层析柱中，通过重力或压力来进行加载。
4. 洗脱：使用色谱梯度洗脱液进行洗脱。
洗脱液中的有机溶剂、盐浓度或pH的变化可以改变寡核苷酸药物在疏水层析柱上的亲和性，实现纯化的分离。
5. 收集纯化产物：根据纯化过程的监测结果，通过适当的方法收集纯化后的寡核苷酸药物。
丁基疏水层析
丁基疏水层析
丁基疏水层析是一种层析技术，常用于化学分离和纯化的过程中。
它基于化合物在不同疏水性条件下的亲/疏水性差异，通
过溶剂的选择和控制来实现分离。
丁基疏水层析的原理是基于多相液体的分配平衡。
样品在两种液体相（一般是水和有机溶剂）之间分配，并根据其相对亲/
疏水性来决定在哪个相中停留。
疏水性较弱的化合物更容易溶解在有机溶剂中，而亲水性较强的化合物则更容易溶解在水相中。
在丁基疏水层析中，通常使用一个丁基（C4）疏水基团作为
固定相。
这个疏水基团可以与样品中的疏水性化合物相互作用，从而实现分离。
在分离过程中，样品先通过预处理步骤将目标化合物固定在丁基固相上，然后使用适当的洗脱剂洗脱出目标化合物。
洗脱剂一般为疏水性较弱的有机溶剂，可以根据目标化合物的亲/疏水性来选择。
丁基疏水层析具有简单、快速和高效的特点，广泛应用于化学、生物和制药领域的分离和纯化过程中。
它可以用于分离和纯化天然产物、蛋白质、多肽、核酸和其他有机物等。
第八节 疏水层析法
1972年，Erel Z．等人将不同链长的a，ω-二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子方面的重 要作用。 蛋白质分离纯化目的是要求获得具有生物活性的组分， 而生物活性的保持与蛋白质的空间结构的完整性密切 相关。在分离纯化过程中一旦破坏了蛋白质的三级结 构，都可能使其丧失生物活性。疏水层析的分离过程， 可以根据蛋白质分子的疏水特性，采用温和的实验条 件，有效保护蛋白质的空间结构不受破坏，保持其原 有的生物活性。因此疏水层析是纯化活性蛋白质的有 效手段。
四、影响疏水层析分离的因素
1、盐类和盐组成 流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的保留 值具有最为重大的影响。某些离子对蛋白质构象有稳 定作用，如SO42-可以提高蛋白质构象的稳定性，能 使蛋白质的溶解度下降，对蛋白质有盐析效应，使蛋 白质与固定相的疏水作用增强，这些盐或离子的洗脱 能力就较弱。有些离子对蛋白质构象具有不稳定作用， 如Cl- , Ca2＋会使蛋白质构象稳定性降低，使蛋白质 发生不同程度的变性，增加蛋白质的溶解度，具有盐 溶效应。这样的盐或离子的洗脱能力就比较强。
第八节 疏水层析法
刘耀玺
一、定义 疏水层析亦称疏水相互作用层析 （hydrophobic interaction chromatography, HIC），是利用盐-水体系 中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之 间的疏水力的不同而使样品组分得以分离的一 种层析方法。 也就是说：是利用待分离组分中的疏水基团与 固定相的疏水配基发生亲和作用的差异，在用 流动相洗脱时各组分在介质中的迁移率不同而 达到分离目的。
疏水层析
生物大分子的分离与表征第1章、疏水层析 第2章、反相层析 第3章、色谱聚焦层析 第4章、高效液相色谱 第5章、重组蛋白的分离与分析 第6章、抗体纯化技术A)疏水层析（HIC）亦称为疏水作用层析 ，是利用固定相载体上偶联的疏水性配基 与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结 合而进行分离的层析技术。
从作用机制来看，它属于吸附层析。
非极性化合物例如苯、环己烷在水中的溶解度非常 小，与水混合时会形成互不相溶的两相，即非极性分子 有离开水相进入非极性相的趋势，即所谓的疏水性 (Hydrophobicity)。
非极性溶质与水溶剂的相互作用则称为疏水效应 (Hydrophobic effect) 。
疏水作用(hydrophobic interaction):非极性分子进入水中，有 聚集在一起形成最小疏水 面积的趋势，保持这些非 极性分子聚集在一起的作 用则称为疏水作用。
对于可溶蛋白，溶剂是水，疏水侧链因此被包 埋在蛋白质内部。
最终的结构是最适合周围溶液的 热动力学折衷的结果。
就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。
虽然疏水氨基酸大多被包埋在球形蛋白内部，有些则暴露在外，在蛋白质表面形成疏 水区域，这部分暴露在外疏水 性基团称为疏水补丁。
疏水和亲水部件表面的溶菌 酶。
最疏水部分是深红色,浅红色 的更少的疏水性。
最亲水部 分显示在深蓝色的,更少的亲 水部分是浅蓝色。
1.2、疏水层析原理A)B)高度规则的水壳层包围在配基和蛋白的疏水表面周围。
疏水物质被迫融合以减少这种壳的总面积（熵最大）。
在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白 之间或蛋白自身的相互作用。
盐能够增强疏水作用。
亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理◦ 靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；◦ 令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露 出掩藏于分子内的疏水性残基；◦ 高盐作用。
疏水层析的特性所致，即在高盐浓度 下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性 固定相作用。
丁基疏水层析
丁基疏水层析
【实用版】
目录
1.丁基疏水层析简介
2.丁基疏水层析原理
3.丁基疏水层析的应用
4.丁基疏水层析的优点与局限性
正文
一、丁基疏水层析简介
丁基疏水层析，又称丁基硅胶层析，是一种常用的色谱技术。
该技术主要通过样品在移动相和固定相之间的分配系数的不同，达到分离样品的目的。
二、丁基疏水层析原理
丁基疏水层析是利用样品在移动相和固定相之间的分配系数的不同，达到分离样品的目的。
移动相通常是极性溶剂，如甲醇、乙醇等，而固定相则是非极性的丁基硅胶。
极性样品在极性移动相中溶解度大，非极性样品在非极性固定相中溶解度大，从而达到分离的目的。
三、丁基疏水层析的应用
丁基疏水层析被广泛应用于化学、生物、医药等领域。
例如，在有机合成中，可以用于分离和提纯有机化合物；在生物领域，可以用于分离蛋白质、核酸等生物大分子；在医药领域，可以用于分离和纯化药物。
四、丁基疏水层析的优点与局限性
丁基疏水层析具有操作简单、分辨率高、回收率高等优点。
第1页共1页。
第四章 疏水层析
二、操作
1.层析பைடு நூலகம்制备 1.层析柱制备
层析柱规格：类似普通层析。当被分离样品量较大时、 层析柱规格：类似普通层析。当被分离样品量较大时、 被分离物与杂质间的疏水性差异较大时， 被分离物与杂质间的疏水性差异较大时，选用体积较大的 柱子（ d≤3）。 柱子（h：d≤3）。 固定相选择：根据要分离物质的特点进行选择。 固定相选择：根据要分离物质的特点进行选择。
第四章 疏水层析 （hydrophobic interaction chomatography，HIC） chomatography，HIC）
由两部分构成： 由两部分构成： 基质：同一般的层析介质，如交联琼脂糖、硅胶、 ①基质：同一般的层析介质，如交联琼脂糖、硅胶、树脂 等。 配体：如苯基、烷基（ ）、烷氨基 ②配体：如苯基、烷基（C3-C8）、烷氨基、聚乙二醇等。 ）、烷氨基、聚乙二醇等。 基质与配体以共价键耦连在一起。 基质与配体以共价键耦连在一起。
原理 高浓度盐溶液中，亲水性的较强的物质， 高浓度盐溶液中，亲水性的较强的物质， 分子内部的疏水基团外露， 分子内部的疏水基团外露，便可与疏水的固定 相以疏水作用力相结合（吸附） 相以疏水作用力相结合（吸附）.由于这种作用 力大小不同， 力大小不同，可以通过改变极性流动相的离子 强度（由高到低）使其依次解吸附。 强度（由高到低）使其依次解吸附。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
疏水层析经验
1、疏水层析是根据不同蛋白质的疏水力强弱不同来分离的。
在高盐离子强度的情况下，蛋白质的疏水基团充分暴露与填料的疏水介质相互作用，从而结合在柱子上。
不同蛋白质的疏水性强弱不同从而导致其与柱子填料的结合力也不同。
随后，逐渐降低洗脱缓冲液的盐离子强度就可以将不同的蛋白分布洗脱下来，形成一个个的蛋白质洗脱峰。
2、柱子的装填：如果是预装柱，就不存在装柱的问题了。
不是，则从头开始：首先，把柱子洗干净，一定要洗干净，不然会出现气泡。
填料预先融涨（注意，进口一般已经是融涨好的，不必再做这一步），取一定的填料（例如：想装5.0ml的柱子，一般将瓶子里的填料（沉淀的填料：上清=1：1的话）取10.0ml出来）先脱一下气（请人帮忙，不然控制不好会暴沸出来！），然后缓缓装入柱子（柱子上下口一定不要搞错！！！），打开下口让水流出，最好一次性装完，等待其自然沉降，柱子就装好了。
（实际上，因为疏水层析的原理与分子筛不同，所以其装柱远远没有分子筛的柱子那么严格，很容易的！放心好了！看着顺眼就应该差不多吧）
3、注意：柱子装好之后，任何时间都不能让缓冲液流到柱面以下而干柱，切记！
4、缓冲液的选择：a、pH值：要在蛋白质的pI值附近，因为这时蛋白质的疏水力会最强，但是也不要把缓冲液的pH正好调到pI，因为蛋白那时会发生等电点沉淀！（大家都知道，呵呵…）。
所以，如果你的蛋白等电点是8.5的话，配一个8.0或9.0的缓冲液应该都可以！b、缓冲介质：常用的是PBS或者Tris-HCl缓冲液，都可以，看个人习惯了，或者，你以后的实验要用Tris-HCl，那么这里也用Tris-HCl就是了。
蛋白质技术手册上用的是PBS，自己选择吧。
c、缓冲液的浓度：依照蛋白质技术手册上的浓度即可：20mM。
5、样品的处理：疏水层析是在高盐离子强度的情况下上样的。
而且，样品在上样之前一定要注意没有沉淀，有的话应该离心除去。
样品的盐离子强度的调整：可以直接将固体的磨的很细的盐颗粒加在样品里，使之达到预定的浓度（是硫酸铵的话，就查手册后面的表格，计算应该加多少盐），或者将样品与100%的硫酸铵等体积混合，不就变成50%的了（这样的好处是缓冲液的浓度不会因为加入硫酸铵体积变大而降低，从而影响了样品的pH值）？还有更加重要的是：请仔细选择上样的离子强度，要知道，蛋白质在高盐的情况下是要发生沉淀的（硫酸铵沉淀纯化蛋白的原理）！如果你的蛋白的硫酸铵沉淀范围是50-80%，那么你大可放心地用50%硫酸铵来上样！如果你的蛋白的硫酸铵沉淀范围是30-50%，那么你就只能用30%来上样了，千万记住！！！还有就是，调整盐离子强度的时候要在低温下操作，如果有沉淀产生，轻轻地混匀一会儿，该溶解的就会溶解，离一下心，就可以上样了。
6、不知道你的蛋白的稳定性如何？必要的时候，请加入蛋白酶抑制剂。
7、柱子的预平衡：10倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵（这个浓度要你选择，50%还是30%？）），使其平衡。
8、上样：当平衡层析缓冲液流至恰好与床面相切时，关闭出液口（有泵的话，把它一关就OK!），然后上样。
注意：尽量小心，保持床面的平整性！打开出口，让样品缓缓进入柱床，再次相切时，加入少量（很少就可以，稍稍盖过床面就行！）层析缓冲液（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗一下。
9、洗柱：注意，这一步不是洗脱，而是把一些吸附不在柱子上的杂蛋白尽量洗下来！步骤：3倍床体积的层析缓冲液洗柱（20mM PBS, 50%硫酸铵）洗柱或者观察检测仪的信号回到基线，那就证明吸不住的杂蛋白完全洗下来了。
10、目的蛋白的洗脱：有梯度混合仪的话，可以梯度洗脱（比如50%-0%洗脱），没有的话，就像手册上那样，配置一系列浓度的洗脱缓冲液，各两倍体积来洗。
控制好流速，0.5ml/min左右吧，再问问人家一般用多大的流速？两种洗脱方式各有利弊，梯度洗脱分辨率高一些，操作较简单，不用频繁更换缓冲液，但是不太适合批量蛋白的过柱。
分布洗脱比较烦，要不停更换缓冲液（换液之前，别忘了关泵，否则柱子要被吸干！！！），但是批量操作性好，重复性好，样品可以不
用分步收集，只需把不同浓度缓冲液洗下来的样品收集到一起即可。
11、样品的收集：梯度洗脱的话，将洗脱峰的各管合并（不放心，可以峰前，峰尖，峰尾分别合并，至少可能保证峰尖是纯的，不过我觉得你的样品没必要这样，因为本来就比较纯的！）分布洗脱的话，本来就是直接按照不同浓度合并收集的，不存在再次合并问题。
12、样品纯度的检查：疏水层析后的样品盐离子强度很高的一般都，除非你是在0%的时候才洗脱下来你的蛋白（还有，如果你的蛋白0%还洗不下来，可以在洗脱缓冲液中加入5%的乙醇或者乙二醇来洗脱）。
不管用什么办法，请将你的样品脱盐（透析，体积太大可以先冷冻干燥再溶解后透析，或者直接用三氯乙酸沉淀洗涤即可）。
然后，估计一下你的样品的蛋白质浓度，就可以SDS-PAGE上样电泳检查纯度了（测酶活方便的话，比较比酶活也可以初步知道纯化程度！）。
若纯度要求很高，你可以用银染来检查，这个灵敏度高，ng级的！
13、好了，就这么多，有什么问题再讨论吧。
或者到丁香园去问一下，chromatography很内行的！。