《染色体显微操作》PPT课件

在理论上，遗传标记之间1cM的距离已连锁非常紧 密。因此，应用染色体显微切基因克隆的有效方法之一。
染色体显微切割的方法主要有5种：流式细胞分类
器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、
玻璃针-激光法和激光捕获微分离法。此外，目前开始
其它染色体污染率高达整理ppt
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• 3、玻璃针-激光法 • 由于激光显微切割法需要价格昂贵的特殊培养
皿，操作也较复杂。且氩离子激光热效应大， 容易对切口附近的染色体DNA造成较大损伤。 • 玻璃针法较为成功，但难以对染色体进行精确 的定位切割。王槐等研究了一种由激光微束与 玻璃针结合使用来切割分离植物染色体片段的 方法。
• 它是一种将紫外激光束切割与激光压力弹射相 结合的新方法，激光聚焦点直径小于1um，是 目前最为先进的技术，它使染色体显微切割操 作步骤大大简化。
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• 将超薄膜用胶带封固在干净的载片上，紫外消 毒，染色体制片。
• 用激光脉冲将靠近目标染色体的不需要的遗传 材料选择去除。
• 围绕目标染色体，用激光脉冲切割薄膜，通过 激光压力弹射操作仪将切下的薄膜上的目标染 色体弹射到距载玻片小于1mm的收集装置上， 如果所需目标染色体数目多且相同，则可收集 到同一个收集装置上。
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• 优缺点 • 盖玻片的存在减少了切割过程中外源DNA分
子的污染，且为油镜下更准确地识别目的染色 体和定位切割靶点创造条件，切割准确； • 因为用玻璃针分离切割后的染色体，所以用普 通载玻片即可进行染色体制备，费用较低； • 但仍需借助玻璃针的操作，易污染。
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• 4、激光捕获微分离法
• 三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材 料一定层次上的同质性。
• 四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子
生物学、免疫学及病理学技术结合使用。
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• 显微切割的结合技术
• 能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术 结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。
• 根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫 组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、 FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行 标记。
PCR技术发明之后，Lüdecke等（1989）将PCR 技术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割 片段就获得了足够数量的DNA。
自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成 果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻 璃针法已相继构建了一系整列理p人pt 类染色体区带探针池。7
时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟， 并成为构建染色体特异区段DNA探针池最为有效和直 接的技术手段，例如，应用显微切割技术可以获得长 度为1～3Mb的DNA片段，相当于水稻基因组遗传图 谱上1～3cM。
尝试使用微操作机器人系整统理pp。t
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1、激光切割法
此法与手工操作法的主要差别在于：用激光束代 替玻璃针，将染色体标本上不需要的片段剔除， 然后将剩余染色体片段消化、扩增。Fukui等利 用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方 法对设备要求较高，激光切割区域对DNA分子 也有损伤。
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• 显微切割的特点
• 一是“细微”，显微切割的对象可以达到微米 级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此 利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染 色体特异区带这样细微的对象；
• 二是“原位”，利用显微切割技术是在组ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ细 胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位 清楚，所研究对象的历史背景明确。
第六章 染色体显微操作
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染色体微分析技术包括：染色体显微切割、分离； PCR体外扩增；微克隆技术，染色体或特异区扩增产 物间的Southern杂交及特异DNA片段的FISH定位。 该项技术是近十多年来随分子生物学技术发展而诞生 的一项生物高新技术，它既有细胞生物学的可视性， 又有分子生物学的先进性，在染色体结构、基因组和 比较基因组学、基因克隆、物理图谱构建等方面具有 广泛的应用前景。
• 与不同的方法结合决定了需要对显微切 割的材料进行不同的处理。
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染 色 体 显 微 切 割 技 术 出 现 于 20 世 纪 80 年 代 。 Scalenghe等（1981）首次报道了应用特殊玻璃针 对果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。因 为当时尚没有发明PCR技术，需分离数百条染色体才 可获得足够数量的DNA。
2、流式细胞分类器法：
• 流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生 物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。
• 1983年至1986年，美国的两个实验室用流式 细胞分类器和分子生物学染色体。
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• 优缺点 • 使实验过程机械化，可用于处理大批染色体。 显微切割技术是在显微状态或显微镜直 视下通过显微操作系统对欲选取的材料 （组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染 色体区带等）进行切割分离并收集用于 后续研究的技术。
• 显微切割技术实际上属于在微观领域对 研究材料的分离收集技术，因此应用此 技术往往是许多要深入的研究工作中起 始的重要一步。
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• 优缺点
• 除具有激光微切割的优点之外，还在一种环境 中操作，避免了污染；
• 激光波长为337nm，远离DNA最大吸收波长 260nm，无热效应产生，不会损坏材料；样 品可长时间保存。
• 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和
RNA等用于Western Blot、Southern Blot、
Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。
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• 显微切割的影响因素
• 最终结果的因素多种多样。 • 在实验过程中把握一个原则,即一切与显
微切割结合的技术中影响因素应同时列 为显微切割实验最终结果的影响因素， 在实验的过程中予以考虑。