荧光分光光度计- 原理概要
分光光度计使用原理
分光光度计使用原理
分光光度计是一种常用的光谱仪器,用于分析和测量物质的光学性质。
它的工作原理是基于光的吸收现象。
光是由电磁波组成的,不同波长的光具有不同的能量和频率。
当光通过一个物质时,物质会吸收或传播光的不同波长。
分光光度计利用这个原理来测量物质的光学吸收特性。
分光光度计的核心部件是光源、光栅、光电二极管和检测器。
光源发出白光,光栅将白光分散成多种颜色的光谱,然后透过一个样品室,样品室中含有要测量的物质。
物质会吸收光谱中特定波长的光,其余波长的光则通过样品室。
通过测量样品室中进入和离开的光的强度,可以计算出被样品吸收的光的量。
光电二极管和检测器记录并转换通过的光强度为电信号,然后由光度计进行计算和显示。
为了准确测量物质的吸收特性,分光光度计需要进行一系列校准。
首先,需要对光源进行校准,确保其发出的光强度稳定。
其次,需要校准检测器,确保其对不同波长的光具有相同的响应。
最后,需要校准样品室,以消除样品室自身对光的吸收。
总结而言,分光光度计利用光的吸收现象来测量物质的光学性质。
通过分散光谱、测量光强度和进行校准,可以获取准确的吸收光谱和浓度数据,为物质分析和测量提供依据。
荧光分光光度计的工作原理
荧光分光光度计的工作原理在激发阶段,样品被激发光源发出的激发光照射。
激发光通过光源产生,并经过单色器产生具有特定波长和能量的单色激发光。
这个单色激发光通过一个镜片聚焦到样品上。
在这个过程中,样品吸收光的一个部分,将其激发到激发态。
在发射阶段,样品的激发态荧光发出。
样品中的分子经过激发态转换成能量较低的荧光发射态。
发射光的波长较激发光长,且具有比激发光显著更低的能量。
发射光通过样品室中样品表面进入分光器。
在分光器内,发射光被分为不同波长的成分。
分光器的主要作用是将光按波长分散成不同的光束,方便探测器进行接收和处理。
分光器将不同波长的发射光分别引导到探测器上。
探测器接收并检测发射光的强度。
常见的探测器包括光电二极管(Photomultiplier Tube, PMT)和光电二极管阵列(Photodiode Array)。
探测器可以测量发射光的强度,并将结果传输到计算机上进一步处理和分析。
通过测量样品荧光发射光的强度和特定波长下的荧光发射光,我们可以确定样品中特定成分的存在和浓度。
具体而言,对于有荧光标记的样品,其荧光发射强度与其浓度成正比关系。
因此,我们可以通过测量发射光的强度来测定样品中特定成分的浓度。
1.高灵敏度。
荧光分光光度计能够检测非常微量的荧光发射光,因此对于低浓度样品的检测非常敏感。
2.宽波长范围。
荧光分光光度计能够检测多个波长范围内的光,因此适用于多种样品的测量。
3.选择性。
通过选择特定的激发波长和检测波长,可以选择性地测量特定组分的浓度。
4.可定量分析。
荧光分光光度计能够通过测量荧光发射光的强度来定量分析样品中特定成分的浓度。
总结起来,荧光分光光度计是一种基于样品在吸收光激发下发出荧光发射的光学仪器。
通过测量样品发射光的强度和特定波长下的发射光,我们可以确定样品中特定成分的存在和浓度。
荧光分光光度计具有高灵敏度、宽波长范围、选择性和可定量分析等优点,因此在科学研究和化学分析等领域得到了广泛应用。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理荧光分光光度计是一种用来测量物质荧光特性的仪器,它通过激发样品产生荧光,然后测量样品发出的荧光强度来分析样品的成分和结构。
荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至关重要。
首先,荧光分光光度计的原理基于样品受到激发光照射后发出的荧光现象。
当样品受到特定波长的激发光照射后,其内部原子或分子处于激发态,随后会发生非辐射跃迁,从而发出荧光。
荧光分光光度计利用荧光强度来定量分析样品中的成分,因此对激发光源和荧光检测器的选择十分重要。
其次,荧光分光光度计的原理还涉及荧光发射光谱的测量。
荧光分光光度计通过选择合适的激发波长和检测波长来测量样品发出的荧光光谱,从而获得样品的荧光特性信息。
这种原理的应用使得荧光分光光度计成为一种重要的分析仪器,在生物医学、环境监测、材料科学等领域有着广泛的应用。
另外,荧光分光光度计的原理还包括荧光强度的标定和校准。
在进行荧光分光光度计测量之前,需要进行荧光强度的标定和校准,以确保测量结果的准确性和可靠性。
荧光分光光度计的原理要求对仪器进行精确的校准,同时还需要考虑到样品的荧光特性和测量条件的影响。
最后,荧光分光光度计的原理还涉及到荧光强度与样品浓度或成分之间的关系。
通过建立荧光强度与样品浓度或成分之间的标准曲线,可以实现对样品中目标成分的定量分析。
这种原理的应用使得荧光分光光度计成为一种灵敏、快速、准确的分析方法。
总之,荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至关重要。
通过对荧光分光光度计原理的深入了解,可以更好地应用该技术进行样品分析和研究,为科研和实验工作提供有力的支持。
紫外、荧光分光光度计说明
一、设备名称:RF-5301PC荧光分光光度计;二、使用原理1、荧光分光光度计由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中,激发样品中的荧光物质发出荧光,荧光经过滤过和反射后,被光电倍增管所接受,然后以图或数字的形式显示出来。
荧光是光致发光,任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱,发射波长总是大于激发波长。
荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱,反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。
荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光,是荧光强度对发射波长的关系曲线,表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。
由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长,可用它来鉴定荧光物质。
有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比,故可用荧光分光光度法测定其含量。
在溶液中,当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似,荧光分析通常也采用标准曲线法进行。
利用某些物质受激发出的荧光,其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的。
三、组成结构光源、光件、样品池、检测器、数据处理器1、荧光分光光度计图RF5301PC荧光分光光度计主要是由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器以及数据处理系统几部分组成1. 光源:为高压汞蒸气灯或氙弧灯,后者能发射出强度较大的连续光谱,且在300nm~400nm 范围内强度几乎相等,故较常用。
2.激发单色器:置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单色器,筛选出特定的激发光谱。
3.发射单色器:置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二单色器,常采用光栅为单色器。
筛选出特定的发射光谱。
4.样品室:通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样品)组成。
测量液体时,光源与检测器成直角安排;测量固体时,光源与检测器成锐角安排。
荧光分光光度计的基本原理
荧光分光光度计的基本原理荧光分光光度计(Fluorescence Spectrophotometer)是一种测量物质荧光强度的仪器。
它可用于分析、研究、检测生物分子的结构、功能和相互作用等领域,在生物学、化学、生物医学、制药等领域有着广泛的应用。
本文将介绍荧光分光光度计的基本原理及其测量过程。
荧光的基本原理荧光是自然界中一种常见的现象,指的是物质受到激发后放出的短波长光线,这种现象与物质的分子结构和化学成分有关。
当物质受到激发后,外部能量使得其激发态能量提高,分子内部发生跃迁,最终返回到基态时发出荧光。
荧光的光谱分布范围通常从400nm到750nm,与吸收光谱的重叠区有关。
荧光测量的原理荧光的强度与物质的分子结构、环境条件和激发波长等因素有关。
荧光分光光度计采用的测量原理是荧光分析,它通过激发光激发荧光,然后测量荧光发射的强度,从而分析样品中某种荧光物质的含量。
在荧光分析中,激发光的波长需要与目标荧光物质的吸收光谱重叠,以激发目标荧光物质的分子。
当荧光物质受到激发后,分子会从基态到激发态跃迁,然后辐射出相应的荧光。
荧光的强度与荧光物质的浓度成正比,因此可以通过测量荧光强度来计算荧光物质的浓度。
荧光强度的测量需要使用荧光分光光度计。
该仪器可以选择恰当的激发波长,测量荧光发射的强度,并将荧光强度转换为相应的荧光物质浓度值。
荧光分光光度计的组成及测量过程荧光分光光度计的组成包括光源、单色器、样品室、检测器和记录装置等。
在测量过程中,样品需放置在样品室内,通过调节激发光波长和荧光发射波长来测定样品中荧光物质的浓度。
荧光分光光度计的具体测量过程如下:1.设定激发波长:荧光分析中,激发波长需要与目标荧光物质的吸收光谱重叠,以激发目标荧光物质的分子。
通过调节单色器可以选择恰当的激发波长。
2.注入样品:样品通过样品室,可以防止激发光对测量的影响。
样品需要与激发波长重叠,并且需要稳定地放置在样品室内。
3.测量荧光强度:通过检测器测量样品产生的荧光强度。
分光光度计工作原理
分光光度计工作原理
分光光度计是一种用来测量物质吸收、发射或透射光谱的仪器。
其工作原理主要包括以下几个方面:
1. 光源:分光光度计通过一个稳定的光源产生一束光。
常见的光源有白炽灯、钨丝灯、氘灯等。
光源发出的光通过空气或光学元件进入进样室。
2. 进样室:进样室是一个容器,光线进入其中与样品发生相互作用。
进样室通常由透明的材料制成,在光路上引入待测样品。
3. 分光装置:分光光度计采用一种称为分光器的光学元件,将进入进样室的光束分成两束。
其中一束光束与样品相互作用,这些光被样品吸收、发射或透射。
另一束光不经样品直接通过。
4. 检测器:分光光度计采用一种灵敏的检测器来测量透射或发射光的强度。
常见的检测器有光电二极管(Photodiode)、光
电倍增管(Photomultiplier tube)等。
5. 数据处理:分光光度计通过检测器测量样品光的强度,然后将其转换为电信号。
这些电信号经过放大、滤波、数值转换等处理,最终转化为测量结果。
常见的数据处理包括吸光度测量、发射光谱、透射光谱等。
总的来说,分光光度计通过光源、进样室、分光装置、检测器和数据处理等部件的协同工作,实现了对样品光的测量和分析。
这种测量分析方法可以广泛应用于化学、生物、医学等领域,用于研究物质的光学性质和测量物质的浓度等。
原子荧光分光光度计的原理
原子荧光光度计基本原理
2.5.3 干扰消除: ★ 选择合适介质和酸度,防止产生氧化性气体和固态氢化物或难
溶的化合物,有些元素对酸度要求很苛刻,例如锡和铅、锗, 过高过低都影响氢化物的产生; ★ 选择还原剂用量,减少金属离子被还原; ★ 加入掩蔽剂,例如硫脲、碘化钾、草酸等,对共存的干扰离子 进行掩蔽,防止生成难溶化合物; ★ 预还原或氧化,氢化物的发生效率与价态有关,加入抗坏血酸 可使5价砷还原成3价,测量Pb时加入铁氰化钾则是先把2价氧化 成4价,提高氢化物的产生效率; 还有一些其它方法,应根据样品基体来选择合适的办法。
例如硒化铜难溶,而砷化铜则溶于酸,因此铜离子 对硒的干扰比对砷要大,因此样品中要加掩蔽剂消 除干扰离子;
原子荧光光度计基本原理
2.5.2 干扰机理 ★ 样品中的Cu、Co、Fe、Ni等离子在还原剂中被 还原,析出金属沉淀吸附氢化物,减少氢化物的释 放,对硒影响很大,因此要加大酸度以提高金属沉 淀的溶解度; ★ 产生氧化性气体,能用盐酸则不 用硝酸,硝酸有可能被样品基体还原成亚硝酸根— 强氧化剂,抑制氢化物释放; ★ 价态效应,氢化物的产生和被测元素的价态有 很大关系,因此必须要考虑到这一点。
原子荧光光度计基本原理
2.6 气路 ★ 自动控制,分成两路,一路是载气,一路是屏蔽气 ★ 载气流量每分钟300--1000毫升,三个电磁阀控制 ★ 屏蔽气流量每分钟500--1200毫升,三个电磁阀控制 ★ 压力开关保护 ★ 气流量的选择
原子荧光光度计基本原理
2.7 其它 ★ 进样量1.0-1.5毫升 ★ 炉高调节--手动,数值是反方向 ★ 预热灯电流 ★ 换灯务必关闭仪器主机电源
原子荧光光度计基本原理
2.4.5 反应系统和氢化物通路
载流/样品 反 还原剂 应 块
荧光分光光度法
荧光效率(φf)=
2、分子结构与荧光的关系 A 长的共轭结构 例 激发光 荧光 205nm 278nm 286nm 321nm 0.29 356nm 404nm 0.36
荧光效率 0.11
B 分子的刚性和共平面性
荧光效率:0.2
1.0
C 取代基:给电子基团使荧光效率增大,如 -OH、-OCH3、-NH2等。
表面吸 光物质
F
问题(1)不同强度的光照射物质所产生 的荧光光谱形状是否相同? (2)不同波长的光照射物质所产生的荧 光光谱是否相同? 是否影响荧光强度? 单色器
I0
λex
I
表面吸 光物质
λem 单色器
检测器
3、激发光谱:荧光λex不变时,记录荧光 强度F与激发波长之间的关系。
单色器 F荧光的产生
(1)振动弛豫:同一电子能级电子从高的 振动能级到最低的振动能级。
电子能级
原因:分子碰撞 结果:热能,无辐射
振动能级
(2)内部能量的转移
产生原因:受激分子常由高电子能级以无辐射 (热)跃迁方式转移至低电子能级。
电子能级 振动能级
(3)荧光发射 无论分子处于哪一个激发单线态,通过内转换 及振动弛豫,均可返回到第一激发单线态最低 能级,然后以辐射的形式发射光量子而返回到 基态的任一能级。 第二激发态 第一激发态
散射光波长与荧光接近,对荧光强度测定 有干扰,使其读数增大。
荧 光 光 谱
散 射 光 谱
不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 溶剂 水 248 271 313 350 365 416 405 469 436 511
乙醇
环已烷 四氯化 碳 氯仿
267
267 — —
344
荧光分光光度计的原理及应用
2.荧光光谱
固定激发光波长, 化合物发射的荧光强 度与发射光波长关系 曲线(图中曲线II)。 问题:荧光(磷光)的 激发光波长如何选择 ?Stokes位移:激发 光谱与发射光谱之间 的波长差值。发射光 谱的波长比激发光谱 的长。
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三、荧光强度和溶液浓度的关系
1 定量依据
(2)生物与有机化合物的分析
见表
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• P14 3
作业
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荧光分光光度计的原理 及应用
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第一节 荧光分光光度法原理
一、分子荧光的产生
1.电子激发态的多重度
单重激发态S:电子自旋方向和处于基态轨道的电 子配对。 三重激发态T:电子 自旋方向和处于基态 轨道的电子平行。
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2. 分子能级与跃迁
基态(S0)→激发态(S1、S2激发态振动能级):吸收特 定频率的辐射。 激发态→基态:多种途径和方式(见能级图);速度最 快、激发态寿命最短的途径占优势;
(1)灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2~4个数量级;为什
么? 分光光度法所检测的是两个较大的信号的微小差
别,荧光光度法检测的是很小背景值上的荧光强度 。 (2)选择性强
既可依据特征发射光谱,又可根据特征吸收光谱 ; (3)试样量少 (4)可提供比较多的物理参数
缺点:应用范围小。
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传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 Leabharlann 转移 外转移 振动弛预2019/8/11
内转换
振动弛豫 内转换
荧光光度计原理
荧光光度计原理
荧光光度计是一种用于测量物质发光强度的仪器,其原理基于荧光现象和分光光度学原理。
荧光是指在某些物质吸收能量后,激发至高能级,然后从高能级返回基态时放出能量的过程。
这种能量损失的过程会以光的形式发出,并具有特定的波长和强度。
荧光光度计的工作原理如下:
1. 激发:荧光光度计通过使用适当的激发源(如氙灯或激光器)产生特定波长的激发光,该波长通常与待测物质吸收光的波长相对应。
2. 滤光:通过使用适当的滤光片或光栅,荧光光度计将只允许特定波长的光通过,并滤除其他波长的光。
3. 激发光照射:通过镜子或透镜系统,荧光光度计将激发光照射到待测物质上。
4. 荧光发射:待测物质吸收激发光后,从高能级返回基态时将发出荧光。
荧光的波长通常比激发光的波长长,并且具有特定的荧光光谱特征。
5. 检测:通过光电检测器(如光电二极管或光电倍增管)将荧光信号转换为电信号。
光电检测器的灵敏度和响应特性与荧光光谱相匹配。
6. 信号处理:荧光信号通过放大器和/或滤波器进行处理,并
转换为数字信号以进行后续数据处理和分析。
7. 数据显示和分析:荧光光度计通常配备显示屏,可直接显示测量结果。
此外,可以使用计算机和相关软件对数据进行更详细的分析和处理。
总结而言,荧光光度计利用激发光激发待测物质,测量其发出的荧光强度以获得相关的信息。
相较于传统吸光光度计,荧光光度计具有更高的敏感度和选择性,因此,在生物学、化学分析等领域得到了广泛应用。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计是一种用于测量物质荧光强度的仪器。
它利用激发光源激发样品产生荧光,然后测量样品发射的荧光强度。
荧光分光光度计的基本原理是荧光分光。
它首先通过一个激发光源产生激发光,该激发光与样品之间的相互作用激发样品分子的电子跃迁到高能级,从而产生荧光。
然后,荧光发射光由样品发射到光度计器件中进行测量。
在激发光源产生激发光的过程中,通常使用的光源有氘灯、汞灯和钨丝灯等。
其中,氘灯和汞灯主要用于紫外荧光的激发,而钨丝灯则用于可见光荧光的激发。
在荧光分光的过程中,需要使用一个光栅或光圈来分离发射光的不同波长组分,以便进行定量和定性分析。
光栅或光圈将荧光发射光分散成不同波长的光,并通过一个光学系统将其聚焦到光度计器件中。
光度计器件中通常采用光电二极管(Photodiode)或光电倍增管(Photomultiplier)来检测和测量荧光发射光。
光电二极管是一种直接转换光信号为电信号的装置,而光电倍增管则是一种通过电子倍增过程来放大光信号的装置。
在测量荧光强度时,需要将样品放置在荧光分光光度计的样品池中,通过调节激发光源的强度和样品与激发光之间的距离,可以控制激发光的强度和样品的激发程度。
然后,荧光发射光经过光栅或光圈分离后,由光电二极管或光电倍增管检测和测
量。
最后,荧光分光光度计会将测量到的荧光数据进行分析和处理,例如计算荧光强度、绘制荧光光谱等。
总之,荧光分光光度计利用激发光源激发样品产生荧光,再测量样品发射的荧光强度。
它的原理包括激发光源产生激发光、荧光发射光的分散和检测。
通过荧光分光光度计可以实现对样品荧光性质的研究和分析。
荧光分光光度法原理
荧光分光光度法原理荧光分光光度法是一种基于物质吸收与发射荧光的分析技术。
它利用物质在吸收紫外光能量后,发生电子从基态跃迁到激发态,再经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程,从激发态退回基态,释放出的能量以荧光形式发射出来。
通过测量荧光的强度和波长分布,可以对样品中的化合物进行定量和定性分析。
1.激发:激发光源照射样品溶液,激发光源通常为紫外光和可见光,其波长需要与所研究的物质的激发波长匹配。
激发光源经过滤波器选择特定波长的光线,然后通过光导纤维引导到样品室中。
2.激发态产生:样品中的物质吸收光能量,使得物质的电子由基态跃迁到激发态。
激发态的产生取决于样品中的化合物种类,以及激发光源的能量和波长等因素。
3.荧光发射:激发态的物质经过热辐射和无辐射跃迁的复合过程,返回基态。
在这个过程中,部分能量以荧光的形式发射出来。
发射的荧光波长与激发光的波长不同,可以通过光栅或者单色仪分离出来。
4.荧光光谱测量:通过荧光光谱仪对荧光进行测量,荧光光谱仪通常由光栅、检测器(如光电倍增管)和数据采集系统组成。
荧光光谱仪能够选择特定波长范围的荧光进行测量,并将荧光信号转化为电信号。
5.信号处理:荧光信号经过光电器件转换为电信号后,通过放大、调理和滤波等处理,最终通过数据采集系统记录和分析。
荧光分光光度法的优势在于其高灵敏度、高选择性和广泛的应用范围。
它可以应用于环境、食品、制药、生物化学等领域的定量分析和荧光标记分析。
此外,荧光分光光度法还可以结合其他技术,如高效液相色谱、毛细管电泳等,提高其分析的准确性和灵敏度。
荧光分光光度法的一些应用包括:药物分析、痕量元素测定、蛋白质分析、环境污染物检测、核酸分析、生物标记等。
在荧光分析中,还有一些常用的技术方法,如荧光共振能量转移(FRET)、荧光探针和荧光染料等,这些方法进一步扩展了荧光分光光度法的应用范围和分析手段。
总之,荧光分光光度法基于物质的吸收与发射荧光原理,通过测量荧光的强度和波长分布,实现对物质的定量和定性分析。
实验一 荧光分光光度计的使用
实验一 荧光分光光度计的使用一、实验目的1.通过实验强化对荧光分光光度法的理解。
2.了解荧光分光光度计的结构和使用方法。
二、实验原理荧光分析法适宜一定强度的激发光经第一单色器分光,选择最佳波长的光去激发液池内的荧光物质。
该物质发出的荧光可射向四面八方,但通过液池后的激发余光是沿直线传播的。
为了准确的进行荧光测定,检测器不能直接对准光源通常在液池的一边,与激发光成直角关系。
1. 荧光激发光谱:将激发荧光的光源用单色器分光,连续改变激发光波长,固定荧光发射波长,测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度)(F ,作λ-F 光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex λ,选用 ex λ可得到强度最大的荧光。
2.荧光发射光谱:选择ex λ作激发光源,用另一单色器将物质发射的荧光分光,记录每一波长下的 F ,作 λ-F 光谱图称为荧光发射光谱。
荧光发射光谱中荧光强度最强的波长为em λ。
ex λ与 em λ一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三、仪器与试剂1.仪器:Cary Eclipse 型荧光分光光度计2.试剂:核黄素试剂四、实验步骤1.试剂配制:取适量核黄素加水配置成溶液。
将溶液加入荧光比色皿,再将比色皿放入荧光分光光度计中。
2.测定(1)荧光发射光谱打开程序,单击set up,跳出一个窗口,单击Emission,则Excitation 固定,设为350nm。
再将扫描波长设定为400~600nm。
狭缝定为5,单击OK,等Start变绿灯时单击,仪器扫描出图,此为荧光发射光谱。
如下图。
(2)荧光激发光谱打开程序,单击set up,跳出一个窗口,单击Excitation,则Emission 固定,设为370nm。
再将扫描波长设定为200~500nm。
狭缝定为5,单击OK,等Start变绿灯时单击,仪器扫描出图,此为荧光激发光谱。
如下图。
五、注意事项1.荧光比色皿四面均透光,用手拿取时应拿棱边,避免碰到透光面。
荧光分光光度法
荧光分光光度计的结构与操作
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荧光分光光度计的结构
荧光分光光度计由光源、单色器、样品池、检测 器等部分组成,各部分协同工作完成荧光光谱的 测量。
荧光分光光度计的操作步骤
操作步骤包括样品准备、仪器调试、参数设置、 数据采集与分析等,操作时应严格按照仪器说明 书进行。
荧光分光光度计的维护与保养
为了保持仪器的性能和延长使用寿命,应定期对 仪器进行维护和保养,如清洁光学元件、检查电 路连接等。
荧光分光光度法
目录
CONTENTS
• 荧光分光光度法简介 • 荧光分光光度法的基本原理 • 荧光分光光度法的实验技术 • 荧光分光光度法的应用实例 • 荧光分光光度法的挑战与展望
01 荧光分光光度法简介
CHAPTER
定义与原理
定义
荧光分光光度法是一种基于荧光物质与激发光的相互作用, 通过测量荧光光谱来研究荧光物质性质的分析方法。
利用荧光染料标记DNA或RNA,通过 荧光光谱法检测基因表达和突变,以 及DNA和RNA的定量分析。
在环境监测领域的应用
污染物检测
荧光分光光度法可用于检测水体、土壤和空气中的有 害物质,如重金属、农药、酚类化合物等。
饮用水安全
通过荧光光谱法检测饮用水中的消毒副产物,确保饮 用水安全。
生态毒理学研究
荧光光谱的定量分析方法
荧光光谱的定量分析原理
荧光光谱的定量分析基于荧光物质浓度与荧 光强度之间的线性关系,通过测量荧光强度 可以推算出荧光物质的浓度。
荧光光谱的定量分析方法
定量分析方法包括标准曲线法、内标法、外标法等 ,应根据实验需求选择合适的分析方法。
荧光光谱的定量分析误差 来源
误差来源包括仪器误差、样品不均匀性、操 作误差等,应采取相应措施减小误差,提高 分析精度。
荧光分光光度法的原理
荧光分光光度法的原理
荧光分光光度法(Fluorescence Spectrophotometry)是一种基
于样品发射荧光的分析方法。
其原理可以概括为:在荧光分光光度法中,首先使用一定波长的激发光照射样品,样品吸收激发光能量后从基态到激发态跃迁。
然后,样品从激发态返回基态时,会发射出比激发光长波长的荧光。
通过测量样品发射的荧光强度和波长分布,可以获得关于样品的光谱信息。
其主要原理如下:
1. 激发:在荧光分光光度法中,使用适当波长的激发光源照射样品。
这些激发光由荧光光源产生,其波长通常位于紫外、可见光或近红外区域。
2. 吸收:样品分子吸收激发光,其中电子从基态跃迁到激发态。
吸收光谱可以在分光光度计中测量,它描述了样品对不同波长的光的吸收程度。
3. 荧光:激发态的样品分子保持相对较长的寿命,然后通过辐射转换为基态。
在此过程中,一部分能量以光的形式释放出来,并发射出长波长的荧光。
荧光光谱可以在分光光度计中测量,它显示了样品发射荧光的强度和波长分布。
4. 分光:分光光度计会通过使用光栅或光柱将发射光进行分散。
然后,光谱仪通过调整光栅或光柱的角度,使得不同波长的光在光谱仪中的不同位置聚焦。
通过检测不同波长的荧光,光谱仪可以获得关于样品的发射光谱。
通过测量不同波长下的荧光强度,荧光分光光度法可以提供关于样品的化学和结构信息。
这种方法广泛应用于分析领域,例如生物化学、环境监测、药物分析等。
荧光分光光度计- 原理概要
分子荧光分析法发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。
根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同,荧光分析法可分为以下几种:1. X射线荧光分析法用X射线作光源,待测物质的原子受激发后在很短时间内(10-8 s)发射波长在X 射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法:待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后,在很短的时间内(10-8 s),部分将发生辐射跃迁至基态,这种二次辐射即为荧光,根据其波长可进行定性,根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同,称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长,称为stokes荧光;若短,称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法:有些物质的多原子分子,在用紫外、可见光(或红外光)照射时,也能发射波长在紫外、可见(红外)区荧光,根据其波长及强度可进行定性和定量分析,这就是通常的(分子)荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程(一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=½+(-½)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”;图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C)当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即ÄS=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”;如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1:S=1/2+1/2=1 其多重性:M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”;“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计(分子荧光)Fluores_cence •1楼1、基本原理在室温下分子大都处在基态的最低振动能级,当受到光的照射时,便吸收与它的特征频率相一致的光线,其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级,这就是在分光光度法中所述的吸光现象。
跃迁到较高能级的分子,很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级,能量的这种转移形式,称为无辐射跃迁。
再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级,并以光的形式放出它们所吸收的能量,这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点,它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级,在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后,物质本身所发射的光的强度。
物质吸收的光,称为激发光;物质受激后所发射的光,称为发射光或荧光。
如果将激发光用单色器分光后,连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线,称为该荧光物质的激发光谱(ex citation spectrum)。
实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。
在激发光谱中最大吸收处的波长处,固定波长和强度,检测物质所发射的荧光的波长和强度,所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱,简称荧光光谱(fluorescence spectrum)。
在建立荧光分析法时,需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。
激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光,根据荧光的光谱和荧光强度,对物质进行定性或定量的方法,称为荧光分析法(fluoresc ence analysis)。
对于某一荧光物质的稀溶液,在一定波长和一定强度的入射光照射下,当液层的厚度不变时,所发生的荧光强度和该溶液的浓度成正比,这是荧光定量分析的基础。
2、检测荧光的仪器测定荧光可用荧光计和荧光分光光度计,其二者的结构复杂程度不同,但其基本结构是相似的。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理荧光分光光度计是一种利用物质在吸收紫外或可见光后产生荧光发射的原理来进行分析的仪器。
其原理基于激发和发射的光谱特性,通过测量样品在特定波长下的荧光强度来确定其成分和浓度。
下面将详细介绍荧光分光光度计的原理。
首先,荧光分光光度计利用激发光源对样品进行激发。
在激发过程中,样品中的某些分子吸收光子的能量,电子跃迁至激发态。
这些激发态的分子具有较短的寿命,会在很短的时间内退激发,释放出荧光光子。
荧光光子的能量和波长与激发光子的能量和波长有关,通常荧光波长比激发波长长,这种现象称为斯托克斯位移。
荧光分光光度计利用这一原理来测量样品的荧光强度。
其次,荧光分光光度计包含激发光源、样品室、荧光检测器和数据处理系统。
激发光源通常为氙灯或汞灯,能够提供足够的能量来激发样品中的分子。
样品室用于容纳样品,并确保激发光能够充分照射到样品上。
荧光检测器用于测量样品在不同波长下的荧光强度,并将信号传输给数据处理系统进行处理和分析。
最后,荧光分光光度计的原理还涉及荧光光谱和荧光强度的测量。
荧光光谱是指样品在不同波长下的荧光强度分布,可以反映样品中不同成分的荧光特性。
荧光强度的测量通常通过单光束或双光束模式进行,单光束模式用于测量样品的荧光强度,而双光束模式用于消除背景干扰。
荧光分光光度计通过测量样品的荧光光谱和荧光强度来确定样品的成分和浓度。
总之,荧光分光光度计是一种利用物质在吸收光子后产生荧光发射的原理来进行分析的仪器。
其原理基于激发和发射的光谱特性,通过测量样品在特定波长下的荧光强度来确定其成分和浓度。
荧光分光光度计在生物化学、环境监测、药物分析等领域有着广泛的应用,是一种重要的分析仪器。
分光光度计工作原理
分光光度计工作原理
分光光度计是一种用于测量光的强度和吸收率的仪器,它在化学、生物、环境
等领域具有广泛的应用。
分光光度计的工作原理主要基于光的吸收和透射特性,下面我们来详细了解一下它的工作原理。
首先,分光光度计通过光源产生一束光线,这束光线经过单色器(或滤光片)
后成为单色光,然后通过样品室。
在样品室中,样品会吸收一部分光线,而剩余的光线会通过样品,最后到达光电检测器。
光电检测器会将光信号转换为电信号,然后通过放大器放大并转换为计算机可以读取的数字信号。
其次,分光光度计的工作原理还涉及到比较。
在测量过程中,仪器会将样品吸
收的光与参比溶液吸收的光进行比较,从而得出样品的吸光度。
这种比较的方式可以消除光源强度、仪器灵敏度等因素对测量结果的影响,提高测量的准确性。
另外,分光光度计还可以通过调节单色器、光源强度等参数来实现不同波长的
光的选择和测量。
这样就可以对不同波长的光进行分析和研究,满足不同领域对光的特定需求。
在实际应用中,分光光度计的工作原理还可以结合各种分析方法,如比色法、
光度法等,来实现对样品中特定物质的定量或定性分析。
通过测量样品在不同波长下的吸光度,可以得到样品中特定物质的含量或特征,为科研和生产提供重要的数据支持。
总的来说,分光光度计的工作原理是基于光的吸收和透射特性,通过光源、单
色器、样品室、光电检测器等部件的配合和调节,实现对样品吸光度的测量和分析。
它在化学、生物、环境等领域的应用具有重要意义,为科学研究和生产实践提供了可靠的技术手段。
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分子荧光分析法发光光谱:物质分子或原子吸收辐射被激发后,电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级,再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。
根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同,荧光分析法可分为以下几种:1. X射线荧光分析法用X射线作光源,待测物质的原子受激发后在很短时间内(10-8 s)发射波长在X 射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法:待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后,在很短的时间内(10-8 s),部分将发生辐射跃迁至基态,这种二次辐射即为荧光,根据其波长可进行定性,根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同,称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长,称为stokes荧光;若短,称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法:有些物质的多原子分子,在用紫外、可见光(或红外光)照射时,也能发射波长在紫外、可见(红外)区荧光,根据其波长及强度可进行定性和定量分析,这就是通常的(分子)荧光分析法。
基本原理一. 分子荧光的发生过程(一)分子的激发态——单线激发态和三线激发态大多数分子含有偶数电子,在基态时,这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中,成对自旋,方向相反,电子净自旋等于零:S=½+(-½)=0,其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数),因此,分子是抗(反)磁性的,其能级不受外界磁场影响而分裂,称“单线态”;图1 单线基态(A)、单线激发态(B)和三线激发态(C)当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后,被激发跃迁到能量较高的轨道上,通常它的自旋方向不改变,即ÄS=0,则激发态仍是单线态,即“单线(重)激发态”;如果电子在跃迁过程中,还伴随着自旋方向的改变,这时便具有两个自旋不配对的电子,电子净自旋不等于零,而等于1:S=1/2+1/2=1 其多重性:M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂,这种受激态称为“三线(重)激发态”;“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。
但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的,即跃迁几率非常小,只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。
(二)分子去活化过程及荧光的发生:(一个分子的外层电子能级包括S0(基态)和各激发态S1,S2,…..,T1…..,每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级)处于激发态的分子不稳定,在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量(辐射或非辐射跃迁)回到激态,这个过程称为“去活化过程”,这些途径为:1. 振动弛豫:在溶液中,处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞,把一部分能量以热的形式迅速传递给溶剂分子(环境),在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级,这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图2. 内转换:当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时,分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上,这一无辐射过程称为“内转换”。
(“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间)3. 外转换:激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用(如碰撞)而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。
4.系间跨跃:当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时,发生电子自旋状态改变的S—T 跃迁,这一过程称为“系间跨跃” 。
(含有高原子序数的原子如Br2、I2 的分子中,由于分子轨道相互作用大,此过程最为常见。
)5. 荧光发射:当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时,第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射(光子)跃回到基态的不同振动能级,此过程称为“荧光发射”。
如果荧光几率较高,则发射过程较快,需10-8秒。
(它代表荧光的寿命)由于不同电子激发态(S)的不同振动能级相重叠时,内转换发生速度很快(容易),在10-11~1013秒内完成,所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多,因此,尽管使分子激发的波长有短(λ1)有长(λ2),但发射荧光的波长只有λ3(>λ1>λ2)。
6. 磷光发射:第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射(光子)的形式回到基态的不同振动能级,此过程称为 “磷光发射”。
(磷光的波长λ4较荧光的波长λ3稍长,发生过程较慢 约 10-4~10s )由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的,三线态寿命比较长,(10-3~10s 左右),若没其它过程同它竞争时,磷光的发生就有可能;由于三线态寿命较长,因而发生振动弛豫及外转换的几率也高,失去激发能的可能性大,以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。
因此,试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。
总之:处于激发态的分子,可以通过上述不同途径回到基态,哪种途径的速度快,哪种途径就优先发生。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快,则荧光发生几率高,强度大。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢,则荧光很弱或不发生。
(三)荧光量子效率:物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
吸收激发光的光子数发射荧光的光子数=Φ (1) Φ 数值在 0~1 之间。
他的大小取决于物质分子的化学结构及环境(t 0c 、pH 、溶剂等)。
二. 激发光谱与荧光(发射)光谱1. 激发光谱:将激发荧光的光源用单色器分光,连续改变激发光波长,固定荧光发射波长,测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F ),作F —λ光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex ,选用 λex 可得到强度最大的荧光。
2. 荧光光谱:选择λex 作激发光源,用另一单色器将物质发射的荧光分光,记录每一波长下的 F ,作 F- λ 光谱图称为荧光光谱。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。
λex 与 λem 一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三. 荧光与分子结构的关系1. 分子结构与荧光具有 π、 π 及 n 、 π 电子共轭结构的分子能吸收紫外和可见辐射而发生 π -π* 或 n - π* 跃迁,然后在受激分子的去活化过程中发生 π*- π或 π*- n 跃迁而发射荧光。
发生 π - π* 跃迁分子,其摩尔吸光系数(å)比 n - π* 跃迁分子的大100—1000倍,它的激发单线态与三线态间的能量差别比 n - π* 的大的多,电子不易形成自旋反转,体系间跨越几率很小,因此, π - π* 跃迁的分子,发生荧光的量子效率高,速率常数大,荧光也强。
所以——只有那些具有 π- π 共轭双键的分子才能发射较强的荧光;π 电子共轭程度越大,荧光强度就越大( λex 与 λem 长移)大多数含芳香环、杂环的化合物能发出荧光,且 π 电子共轭越长, Φ 越大。
2. 取代基对分子发射荧光的影响(1)(苯环上)取代 给电子基团,使 π 共轭程度升高 荧光强度增加:如–CH 3,–NH 2 ,–OH ,–OR 等。
(2) (苯环上)取代吸电子基团,时荧光强度减弱甚至熄灭:如: ,–COOH ,–CHO , –NO 2 ,–N=N –。
(3)高原子序数原子,增加体系间跨越的发生,使荧光减弱甚至熄灭。
如:Br ,I 。
3. 共面性高的刚性多环不饱和结高的分子有利于荧光的发射。
例如:荧光素呈平面构型,其结构具有刚性,它是强荧光物质;而酚酞分子由于不易保持平面结构,故而不是荧光物质。
∙ 溶液的荧光强度一.荧光强度与溶液浓度的关系荧光是由物质吸收光能后发射而出,因此,溶液的荧光强度 F 和溶液吸收光能的程度以及物质的荧光频率有关:F ∝(I 0-I t )→ F = K ’(I 0-I t ) (2) K ’ 为常数,取决于荧光物质的量子效率Φ,根据L —B 定律:bct I I ε-=100bc t I I ε-⋅=100所以 F = K’ ( I 0-I 010-εbc ) = K’ I 0 ( 1-10-εbc ) = K’ I 0 ( 1-e -2.303εbc ) (3) 将式中 e -2.303εbc 展开,得)!3)303.2(!2)303.2(303.2('320 ++-=bc bc bc I K F εεε (4) 当 2.303εbC ≤ 0.05 时(浓度很小,溶液较稀时),上式括号内第一项以后的各项均可忽略不计,所以:F = K’I 02.303εbc (5)对于一荧光物质的稀溶液,当 I 0 及 b 一定时,F = K·c (6)即在低浓度(2.303εbc ≤ 0.05)时,溶液的荧光强度与荧光物质的浓度呈(线性)正比关系。
二. 定量分析方法1. 工作曲线法:配制一系列浓度梯度的待测物的标准溶液,同空白溶液,使样经过相同的处理之后分别测定荧光强度:F s 、F 0、F x ,然后作( F s - F 0)— c 曲线,根据(F x –F 0),从工作曲线上求得待测物的浓度(或含量)。
2. 直接比较法 :如果荧光物质溶液的工作曲线通过原点,就可选择其线性范围,用直接比较法进行测定:F s¯F 0 = Kc S , F x¯F 0 = Kc x s s x x c F F F F c ⋅-==0 (7) 三. 影响荧光强度的外界因素1. 激发光源:一般选用λex 最大但对某些易感光、易分解的荧光物质,尽量采用长波长,低 I 0 及短时间光照2. 温度:大多数分子在温度升高时,分子与分子之间,分子与溶剂分子之间的碰撞频率升高,非辐射能量转移过程升高,Φ 降低,因此,降低温度,有利于提高 Φ 。
3. 溶液的 pH :带有酸性或碱性环状取代基的芳香组化合物的荧光一般都与 pH 值有关,有些化合物在离子状态时不显荧光。
为此,在用荧光强度进行定量测定时,严格控制溶液pH值是非常重要的。
4. 溶剂:对π—π共轭的荧光物质在极性溶剂中,∆E 减小↓→跃迁几率升高↑→Φ↑(波长长移)溶剂粘度↓→Φ↓5. 内滤:当荧光波长与荧光物质或其它物质的吸收峰相重叠时,将发生自吸收使荧光物质的荧光强度下降,此现象称“内滤” 。
6. 散射光的影响(溶剂的二种散射)(1)瑞利散射光:物质(溶剂或其它分子)分子吸收光能后,跃迁到基态的较高振动能级,在极短时间(10-12s)返回到原来的振动能级并发出和原来吸收光相同波长的光,这种光称为瑞利散射光。
(2)拉曼散射光:物质分子吸收光能后,若电子返回到比原来能极稍高(或稍低)的振动能级而发射的光称为拉曼散射光。
瑞利散射光波长与激发光波长相同,拉曼散射与激发光波长不同,而荧光物质的荧光波长与激发光波长无关,因此可以通过选择适当的激发波长将拉曼散射光与荧光分开。