荧光分光光度计- 原理概要
荧光分光光度计的工作原理
荧光分光光度计的工作原理
在激发阶段，样品被激发光源发出的激发光照射。激发光通过光源产生，并经过单色器产生具有特定波长和能量的单色激发光。这个单色激发
光通过一个镜片聚焦到样品上。在这个过程中，样品吸收光的一个部分，
将其激发到激发态。
在发射阶段，样品的激发态荧光发出。样品中的分子经过激发态转换
成能量较低的荧光发射态。发射光的波长较激发光长，且具有比激发光显
著更低的能量。发射光通过样品室中样品表面进入分光器。
在分光器内，发射光被分为不同波长的成分。分光器的主要作用是将
光按波长分散成不同的光束，方便探测器进行接收和处理。分光器将不同
波长的发射光分别引导到探测器上。
探测器接收并检测发射光的强度。常见的探测器包括光电二极管（Photomultiplier Tube, PMT）和光电二极管阵列（Photodiode Array）。探测器可以测量发射光的强度，并将结果传输到计算机上进一
步处理和分析。
通过测量样品荧光发射光的强度和特定波长下的荧光发射光，我们可
以确定样品中特定成分的存在和浓度。具体而言，对于有荧光标记的样品，其荧光发射强度与其浓度成正比关系。因此，我们可以通过测量发射光的
强度来测定样品中特定成分的浓度。
1.高灵敏度。荧光分光光度计能够检测非常微量的荧光发射光，因此
对于低浓度样品的检测非常敏感。
2.宽波长范围。荧光分光光度计能够检测多个波长范围内的光，因此
适用于多种样品的测量。
3.选择性。通过选择特定的激发波长和检测波长，可以选择性地测量
特定组分的浓度。
4.可定量分析。荧光分光光度计能够通过测量荧光发射光的强度来定
荧光分光光度计的基本原理
荧光分光光度计的基本原理
荧光分光光度计（Fluorescence Spectrophotometer）是一种测量物质荧光强度的仪器。它可用于分析、研究、检测生物分子的结构、功能和相互作用等领域，在生物学、化学、生物医学、制药等领域有着广泛的应用。本文将介绍荧光分光光度计的基本原理及其测量过程。
荧光的基本原理
荧光是自然界中一种常见的现象，指的是物质受到激发后放出的短波长光线，这种现象与物质的分子结构和化学成分有关。当物质受到激发后，外部能量使得其激发态能量提高，分子内部发生跃迁，最终返回到基态时发出荧光。荧光的光谱分布范围通常从400nm到750nm，与吸收光谱的重叠区有关。
荧光测量的原理
荧光的强度与物质的分子结构、环境条件和激发波长等因素有关。荧光分光光度计采用的测量原理是荧光分析，它通过激发光激发荧光，然后测量荧光发射的强度，从而分析样品中某种荧光物质的含量。
在荧光分析中，激发光的波长需要与目标荧光物质的吸收光谱重叠，以激发目标荧光物质的分子。当荧光物质受到激发后，分子会从基态到激发态跃迁，然后辐射出相应的荧光。荧光的强度与荧光物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光强度来计算荧光物质的浓度。
荧光强度的测量需要使用荧光分光光度计。该仪器可以选择恰当的激发波长，测量荧光发射的强度，并将荧光强度转换为相应的荧光物质浓度值。
荧光分光光度计的组成及测量过程
荧光分光光度计的组成包括光源、单色器、样品室、检测器和记录装置等。在测量过程中，样品需放置在样品室内，通过调节激发光波长和荧光发射波长来测定样品中荧光物质的浓度。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计是一种用来测量物质荧光特性的仪器，它通过
激发样品产生荧光，然后测量样品发出的荧光强度来分析样品的成
分和结构。荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至
关重要。
首先，荧光分光光度计的原理基于样品受到激发光照射后发出
的荧光现象。当样品受到特定波长的激发光照射后，其内部原子或
分子处于激发态，随后会发生非辐射跃迁，从而发出荧光。荧光分
光光度计利用荧光强度来定量分析样品中的成分，因此对激发光源
和荧光检测器的选择十分重要。
其次，荧光分光光度计的原理还涉及荧光发射光谱的测量。荧
光分光光度计通过选择合适的激发波长和检测波长来测量样品发出
的荧光光谱，从而获得样品的荧光特性信息。这种原理的应用使得
荧光分光光度计成为一种重要的分析仪器，在生物医学、环境监测、材料科学等领域有着广泛的应用。
另外，荧光分光光度计的原理还包括荧光强度的标定和校准。
在进行荧光分光光度计测量之前，需要进行荧光强度的标定和校准，
以确保测量结果的准确性和可靠性。荧光分光光度计的原理要求对仪器进行精确的校准，同时还需要考虑到样品的荧光特性和测量条件的影响。
最后，荧光分光光度计的原理还涉及到荧光强度与样品浓度或成分之间的关系。通过建立荧光强度与样品浓度或成分之间的标准曲线，可以实现对样品中目标成分的定量分析。这种原理的应用使得荧光分光光度计成为一种灵敏、快速、准确的分析方法。
总之，荧光分光光度计原理的理解对于正确操作和数据解释至关重要。通过对荧光分光光度计原理的深入了解，可以更好地应用该技术进行样品分析和研究，为科研和实验工作提供有力的支持。
X荧光光谱仪的工作原理 X荧光光谱仪工作原理
X荧光光谱仪的工作原理 X荧光光谱仪工作
原理
荧光光谱仪又称荧光分光光度计，是一种定性、定量分析的仪器。通过荧光光谱仪的检测，可以获得物质的激发光谱、发射光谱、量子产率、荧光强度、荧光寿命、斯托克斯位移、荧光偏振与去偏振特性，以及荧光的淬灭方面的信息。
X荧光光谱仪的工作原理：
X荧光光谱仪紧要由激发源（X射线管）和探测系统构成。其原理就是：X射线管通过产生入射X射线（一次X射线），来激发被测样品。受激发的样品中的每一种元素会放射出二次X射线（又叫X荧光），并且不同的元素所放射出的二次X射线具有特定的能量特性或波长特性。探测系统测量这些放射出来的二次X射线的能量及数量或者波长。然后，仪器软件将探测系统所收集到的信息转换成样品中各种元素的种类及含量。元素的原子受到高能辐射激发而引起内层电子的跃迁，同时发射出具有确定特别性波长的X射线，因此,只要测出荧光X射线的波长或者能量,就可以知道元素的种类，这就是荧光X射线定性分析的基础。此外,荧光X射线的强度与相应元素的含量有确定的关系，据此，可以进行元素定量分析。用X射线照射试样时，试样可以被激发出各种波长的荧光X射线，需要把混合的X射线按波长（或能量）分开，分别测量不同波长（或能量）的X射线的强度，以进行定性和定量分析，为此使用的仪器叫X荧
光光谱仪。由于X荧光具有确定波长，同时又有确定能量，因此，X 射线荧光光谱仪有两种基本类型：波长色散型和能量色散型。
X荧光光谱仪的原理及应用
X射线荧光分析是确定物质中微量元素的种类和含量的一种方法，又称X射线次级发射光谱分析，是利用原级X射线光子或其它微观粒子激发待测物质中的原子，使之产生次级的特征X射线（X 光荧光）而进行物质成分分析和化学态讨论。
紫外、荧光分光光度计说明
一、设备名称：
RF-5301PC荧光分光光度计；
二、使用原理
1、荧光分光光度计
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。荧光是光致发光，任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱，发射波长总是大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。在溶液中，当荧光物质的浓度较低时,其荧光强度与该物质的浓度通常有良好的正比关系,即IF=KC,利用这种关系可以进行荧光物质的定量分析,与紫外-可见分光光度法类似，荧光分析通常也采用标准曲线法进行。利用某些物质受激发出的荧光，其光强度与该物质的含量成一定函数关系的性质而制成的。
三、组成结构
光源、光件、样品池、检测器、数据处理器
1、荧光分光光度计
图RF5301PC荧光分光光度计
主要是由激发光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器以及数据处理系统几部分组成
1. 光源：
为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用。
2．激发单色器：
荧光分光光度计结构
荧光分光光度计结构
一、引言
在现代科学研究和工业生产中，荧光分析技术被广泛应用于物质组成分析、生物分子探测、环境监测等领域。而荧光分光光度计作为荧光分析技术的核心装置之一，其结构设计对于荧光信号的检测和分析至关重要。
二、荧光分光光度计的基本结构
荧光分光光度计一般由以下部分组成：
1. 光源系统
光源系统是荧光分光光度计的重要组成部分，主要用于提供激发荧光的光源。常见的光源包括氘灯（deuterium lamp）和氙灯（xenon lamp）。氘灯主要产生紫外光，而氙灯则能发出更宽的波长范围的光。光源通常通过准直器和聚光系统来调节光线的形状和聚焦程度。
2. 单色器系统
单色器系统用于选择特定波长的光线，以提供给样品的激发光或检测荧光信号。常见的单色器系统有光栅单色器和干涉滤光片单色器。光栅单色器通过调节光栅的角度来选择所需波长的光线，而干涉滤光片单色器则通过利用干涉现象来实现波长选择。
3. 采样系统
采样系统是荧光分光光度计中用于容纳样品的部分。荧光分光光度计中常使用的采样系统包括光纤探头和比色皿。光纤探头可以用于固体样品或液体样品的荧光检测，而比色皿则适用于液体样品的测量。
4. 探测器系统
探测器系统用于检测样品中的荧光信号，并将信号转化为电信号进行处理和分析。常见的探测器包括光电倍增管（photomultiplier tube, PMT）和光电二极管
（photodiode）。光电倍增管具有高灵敏度和宽波长范围的特点，适用于弱荧光信号的测量；而光电二极管则更加紧凑和便于使用。
5. 信号处理系统
荧光分光光度计
第七章荧光分光光度计
物质的分子吸收了照射光的能量后，处于基态最低能量级的分子被激发到电子激发态的各个振动能及。被激发的分子与周围的分子碰撞，并把部分能量以热能的形式传给周五的分子，自己降落到单线第二电子激发态的最低振动能级。然后，由此最低振动能级向基态的各个振动能级跃迁，同时以发光的形式释放出其能量，这种光即称为荧光。荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定，不但可以做一般的定量分析，而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化，从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
1．荧光分光光度计的基本原理
由高压汞灯或氙灯发出的紫外光和蓝紫光经滤光片照射到样品池中，激发样品中的荧光物质发出荧光，荧光经过滤过和反射后，被光电倍增管所接受，然后以图或数字的形式显示出来。
物质荧光的产生是由在通常状况下处于基态的物质分子吸收激发光后变为激发态, 这些处于激发态的分子是不稳定的,在返回基态的过程中将一部分的能量又以光的形式放出，从而产生荧光．
不同物质由于分子结构的不同,其激发态能级的分布具有各自不同的特征，这种特征反映在荧光上表现为各种物质都有其特征荧光激发和发射光谱，因此可以用荧光激发和发射光谱的不同来定性地进行物质的鉴定。
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计原理
荧光分光光度计是一种用于测量物质荧光强度的仪器。它利用激发光源激发样品产生荧光，然后测量样品发射的荧光强度。
荧光分光光度计的基本原理是荧光分光。它首先通过一个激发光源产生激发光，该激发光与样品之间的相互作用激发样品分子的电子跃迁到高能级，从而产生荧光。然后，荧光发射光由样品发射到光度计器件中进行测量。
在激发光源产生激发光的过程中，通常使用的光源有氘灯、汞灯和钨丝灯等。其中，氘灯和汞灯主要用于紫外荧光的激发，而钨丝灯则用于可见光荧光的激发。
在荧光分光的过程中，需要使用一个光栅或光圈来分离发射光的不同波长组分，以便进行定量和定性分析。光栅或光圈将荧光发射光分散成不同波长的光，并通过一个光学系统将其聚焦到光度计器件中。
光度计器件中通常采用光电二极管（Photodiode）或光电倍增管（Photomultiplier）来检测和测量荧光发射光。光电二极管是一种直接转换光信号为电信号的装置，而光电倍增管则是一种通过电子倍增过程来放大光信号的装置。
在测量荧光强度时，需要将样品放置在荧光分光光度计的样品池中，通过调节激发光源的强度和样品与激发光之间的距离，可以控制激发光的强度和样品的激发程度。然后，荧光发射光经过光栅或光圈分离后，由光电二极管或光电倍增管检测和测
量。
最后，荧光分光光度计会将测量到的荧光数据进行分析和处理，例如计算荧光强度、绘制荧光光谱等。
总之，荧光分光光度计利用激发光源激发样品产生荧光，再测量样品发射的荧光强度。它的原理包括激发光源产生激发光、荧光发射光的分散和检测。通过荧光分光光度计可以实现对样品荧光性质的研究和分析。
荧光分光光度计
一．荧光的原理
1 ．荧光的定义：物质的发光随照射光停止而立即消失的叫荧光。
荧光寿命：10-8-10-9秒磷光：10-4秒
2．荧光的产生：光物质分子吸收能量激发到第一电子激发状态及其它电子激发态的各个能级回到单线第一电子激发态的最低振动能级向基态各能级跃迁发光（荧光）。
从此可见，任何能发荧光的物质都有两种特征光谱：激发光谱和吸收光谱，前者表示不同波长的激发光产生荧光的效率，后者表示物质发射出不同波长光线的相对强度。
3.荧光分光光度计是用于扫描液相荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数,从各个角度反映了分子的成键和结构情况。通过对这些参数的测定, 不但可以做一般的定量分析, 而且还可以推断分子在各种环境下的构象变化, 从而阐明分子结构与功能之间的关系。荧光分光光度计的激发波长扫描范围一般是190~650nm，发射波长扫描范围是200~800nm。可用于液体、固体样品（如凝胶条）的光谱扫描。
二．描述荧光的参数：
1．荧光寿命：去除激发光后，荧光强度降到激发时最大强度的e-1需要的时间。
2．荧光效率：即发射量子数与吸收量子数之比。ф=发射量子数/ 吸收量子数
3．荧光强度：F=KI0clzфF:荧光强度K:仪器常数I0:激发光强度
C：样品物质L：样品池厚度Z：物质吸光系数ф：荧光效率
三．荧光分析的特点：
1．高灵敏度：荧光分析的灵敏度比分光光度计法大2 ～3 个数量级。
分光光度法通常在10-7 级，而荧光的灵敏度达10-9。
荧光
荧光光谱最大激发波长和最大发射波长的测定
一、实验目的
（1）熟悉F-4600型荧光分光光度计的工作原理和定性测量方法。
（2）掌握物质的最大激发波长和最大发射波长的测量方法。
（3）学习识别荧光物质的分子荧光峰和拉曼散射峰。
二、实验原理
荧光分光光度计（如日本日立公司的F-4600）主要由光源、激发单色器、样品池、发射单色器、检测器及信号记录显示系统等所组成，其基本结构如下图所示：
荧光分光光度计结构示意图
由光源发出的光经第一单色器（激发单色器）分光后入射到样品池上，产生的荧光经第二单色器（发射单色器）分光后进入检测器，检测器把荧光强度信号转化成电信号，并经过放大器放大后经信号记录显示系统输出信号。通常在激发单色器与样品池之间及样品池与发射单色器之间还装有滤光片架，以便不同荧光测量时选择使用各种滤光片。滤光片的作用是为了消除或减小瑞利散射光及拉曼散射等的影响。仪器由计算机控制，并可进行固体物质的荧光测量及低温条件下的荧光测量等。
固定第二单色器的波长，使测定的荧光波长保持不变，而不断改变第一单色器的波长，测定相应的荧光强度，所得到的荧光强度与激发波长的谱图，称为激发光谱。
固定第一单色器的波长，使激发光的波长和强度保持不变，而不断改变荧光的测定波长（即发射波长），测定相应的荧光强度，所得到的荧光强度与发射波长的谱图称为发射光谱。
同一荧光物质的分子荧光光谱曲线的波长范围不因它的激发波长值的改变而位移。由于这一荧光特性，如果固定荧光最大发射波长，然后改变激发波长，从激发光谱中确定最大激发波长。反之，固定最大激发光波波长值，测定不同发射波长时的荧光强度，既得荧光发射光谱曲线和最大荧光发射波长值。由于不同的荧光物质有各自特定的荧光发射发射波长值，所以，可用它来鉴别各种不同的荧光物质。
实验一 荧光分光光度计的使用
实验一 荧光分光光度计的使用
一、实验目的
1.通过实验强化对荧光分光光度法的理解。
2.了解荧光分光光度计的结构和使用方法。
二、实验原理
荧光分析法适宜一定强度的激发光经第一单色器分光，选择最佳波长的光去激发液池内的荧光物质。该物质发出的荧光可射向四面八方，但通过液池后的激发余光是沿直线传播的。为了准确的进行荧光测定，检测器不能直接对准光源通常在液池的一边，与激发光成直角关系。
1. 荧光激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度)(F ，作λ-F 光谱图称激发光谱。
从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长ex λ，选用 ex λ可得到强度最大的荧光。
2.荧光发射光谱：选择ex λ作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 λ-F 光谱图称为荧光发射光谱。
荧光发射光谱中荧光强度最强的波长为em λ。
ex λ与 em λ一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。
三、仪器与试剂
1.仪器：Cary Eclipse 型荧光分光光度计
2.试剂：核黄素试剂
四、实验步骤
1.试剂配制：取适量核黄素加水配置成溶液。将溶液加入荧光比色皿，再将比色皿放入荧光分光光度计中。
2.测定
（1）荧光发射光谱
打开程序，单击set up，跳出一个窗口，单击Emission，则Excitation 固定，设为350nm。再将扫描波长设定为400~600nm。狭缝定为5，单击OK，等Start变绿灯时单击，仪器扫描出图，此为荧光发射光谱。如下图。
荧光分光光度计
F-4600荧光分光光度计实验报告
一﹑荧光分光光度计工作原理：
采用脉冲氙灯作光源（1 μs 半宽）保证测量结果有很好的重复性。高档精密仪器配置：激发光部分和荧光发射部分,分别采用900条/mm凹面衍射光栅。检测器采用高灵敏度高光电倍增管,倍增信号送计算机处理，最后将分析结果转入显示器的屏幕上显示。
由光源氙弧灯发出的光通过切光器使其变成断续之光以及激发光单色器变成单色光后，此光即为荧光物质的激发光，被测的荧光物质在激发光照射下所发出的荧光，经过单色器变成单色荧光后照射于测样品用的光电倍增管上，由其所发生的光电流经过放大器放大输至记录仪，激发光单色器和荧光单色器的光栅均由电动机带动的凸轮所控制，当测绘荧光发射光谱时，将激发光单色器的光栅，固定在最适当的激发光波长处，而让荧光单色器凸轮转动，将各波长的荧光强度讯号输出至记录仪上，所记录的光谱即发射光谱（emission spectrum），简称荧光光谱。
当测绘荧光激发光谱时，将荧光单色器的光栅固定在最适当的荧光波长处，只让激发光单色口的凸轮转动，将各波长的激发光的强度讯号输出至记录仪，所记录的光谱即激发光谱（emission spectrum）。
当进行样品溶液的定量分析时，将激发光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。
二﹑方法
液体试样荧光光谱分析、定性和定量测定
自动96位孔板阅读器:用于生物样品分析、PCR技术
液谱联用配套装置: 液相色谱－荧光检测联用技术用于环境检测，如多环芳烃检测
荧光分光光度法
04 荧光分光光度法的应用实例
CHAPTER
在生物医学领域的应用
蛋白质分析
细胞成像
荧光分光光度法可用于检测蛋白质的含 量和结构，如荧光染料与蛋白质结合， 通过荧光光谱分析蛋白质的构象变化。
荧光染料可以用于标记细胞，通过荧 光显微镜观察细胞结构和功能，研究 细胞增殖、凋亡等生物学过程。
DNA和RNA分析
激发光谱
描述荧光物质在不同激发波长下 的荧光发射强度，用于确定最佳 激发波长。
发射光谱
描述荧光物质在特定激发波长下 的荧光发射波长和强度，用于确 定荧光物质的特征发射波长。
荧光量子产率
• 荧光量子产率：表示荧光物质发射荧光的光子数 与其吸收的光子数之比，用于描述荧光物质的发 光效率。
荧光寿命
• 荧光寿命：荧光物质发射荧光的光子数衰减到初始值的 1/e所需的时间，用于描述荧光物质的稳定性。
优化光谱解析算法
研究和发展新型的光谱解析算法，提高荧光光谱数据的解析精度 和速度。
提升硬件性能
改进和升级荧光光谱仪器的性能，提高其检测灵敏度和分辨率。
实时监测与快速检测
研究实现荧光光谱数据的实时监测和快速检测的方法，满足实际 应用的需求。
拓展荧光分光光度法的应用领域与范围
环境监测
将荧光分光光度法应用于环境中的有 毒有害物质、污染物等的检测。
利用荧光染料标记DNA或RNA，通过 荧光光谱法检测基因表达和突变，以 及DNA和RNA的定量分析。
实验九荧光分光实验PPT课件
了解荧光现象的产生和发光原理。
学习荧光分光光度计的原理
了解荧光分光光度计的应用范围
荧光分光光度计在化学分析中的应用，如有机物、无机物的定性定量分析。
荧光分光光度计在生物学研究中的应用，如蛋白质、核酸、酶活性等的检测。
荧光分光光度计在环境监测中的应用，如水体污染物的检测和空气质量监测。
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结果分析
1.晨勃 on a thread of this thread of this thread of this thread of this thread of this thread of this thread
结合实验目的，对数据分析结果进行解释，得出实验结论。
对实验过程中可能产生的误差进行分析，以提高实验结果的准确性。
数据整理
数据分析
结果解释
误差分析
04
结果分析
结果分析
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荧光分光光度计实验
荧 光 分 光 光 度 计
实验目的：1、学会荧光分光光度计的原理和使用；
2、测量蒸馏水的特征谱线；
3、研究各种物质的特征谱线及规律。
实验重点：荧光分光光度计的原理和使用
实验难点：研究各种物质的特征谱线及规律
原理：WGY —10型荧光分光光度计具有双单色器，可以记录物质的激发光谱和
荧光光谱，采用计算机完成仪器的系统控制和数据采集。其工作原理如下： 由光源发出的光，通过激发单色器后变
成单色光，而后照在荧光池中的被测样
品上，由此激发出的荧光被发射单色器
收集后，经单色器色散成单色光而照在
光电倍增管上转换成相应的电信号，经
放大器放大反馈入A/D 转换单元，将
模拟信号转换成相应的数字量，并通过
显示器或打印机显示记录下被测样品
的谱图，这就是荧光光度计的基本原理。
基本结构
整机基本结构如图所示
1、光学系统
仪器的光学系统如图所示
光学系统由激发单色器，发射单色器组成
激发单色器：波长区间220—760nm
光栅1200L/mm 闪耀波长250nm
焦距250 mm
口径 1 ：4
更换一块600L/mm，闪耀波长760nm激发波长区间可扩展到1500nm 发射单色器：波长区间220—760nm
光栅1200L/mm 闪耀波长250nm
焦点250mm
口径1：4
2、滤光片
激发单色器滤光片共四片，其工作区间如下：
第一片340—600nm 第二片600—760 nm
第三片760—1300 nm 第四片1300—1500 nm
发色单色器滤光片共五片，其工作区间如下
第一片220—280 nm 第二片280—380 nm 第三片380—500 nm
荧光分光光度计(分子荧光)
荧光分光光度计（分子荧光）
Fluores_cence •
1楼
1、基本原理
在室温下分子大都处在基态的最低振动能级，当受到光的照射时，便吸收与它的特征频率相一致的光线，其中某些电子由原来的基态能级跃迁到第一电子激发态或更高电子激发态中的各个不同振动能级，这就是在分光光度法中所述的吸光现象。跃迁到较高能级的分子，很快通过振动弛豫、内转换等方式释放能量后下降到第一电子激发态的最低振动能级，能量的这种转移形式，称为无辐射跃迁。再由第一电子激发态的最低振动能级下降到基态的任何振动能级，并以光的形式放出它们所吸收的能量，这种光便称为荧光。
荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛。
荧光分析法是测定物质吸收了一定频率的光以后，物质本身所发射的光的强度。物质吸收的光，称为激发光；物质受激后所发射的光，称为发射光或荧光。如果将激发光用单色器分光后，连续测定相应的荧光的强度所得到的曲线，称为该荧光物质的激发光谱（ex citation spectrum）。实际上荧光物质的激发光谱就是它的吸收光谱。在激发光谱中最大吸收处的波长处，固定波长和强度，检测物质所发射的荧光的波长和强度，所得到的曲线称为该物质的荧光发射光谱，简称荧光光谱（fluorescence spectrum）。在建立荧光分析法时，需根据荧光光谱来选择适当的测定波长。激发光谱和荧光光谱是荧光物质定性的依据。
某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法（fluoresc ence analysis）。
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分子荧光分析法
发光光谱：物质分子或原子吸收辐射被激发后，电子以无辐射跃迁至第一电子激发态的最低振动能级，再以辐射的方式释放这一部分能量而产生的光谱称为荧光、磷光。
根据物质接受的辐射能量的大小及与辐射作用的质点不同，荧光分析法可分为以下几种：
1. X射线荧光分析法
用X射线作光源，待测物质的原子受激发后在很短时间内（10-8 s）发射波长在X 射线范围内的荧光。
2. 原子荧光分析法：
待测元素的原子蒸气吸收辐射激发后，在很短的时间内（10-8 s），部分将发生辐射跃迁至基态，这种二次辐射即为荧光，根据其波长可进行定性，根据谱线强度进行定量。
荧光的波长如与激发光相同，称为共振荧光。
荧光的波长比激发光波长长，称为stokes荧光；若短，称为反stokes荧光。
3. 分子荧光分析法：
有些物质的多原子分子，在用紫外、可见光（或红外光）照射时，也能发射波长在紫外、可见（红外）区荧光，根据其波长及强度可进行定性和定量分析，这就是通常的（分子）荧光分析法。
基本原理
一. 分子荧光的发生过程
（一）分子的激发态——单线激发态和三线激发态
大多数分子含有偶数电子，在基态时，这些电子成对地存在于各个原子或分子轨道中，成对自旋，方向相反，电子净自旋等于零：S=½+(-½)=0，其多重性M=2S+1=1 (M 为磁量子数)，因此，分子是抗（反）磁性的，其能级不受外界磁场影响而分裂，
称“单线态”；
图1 单线基态（A）、单线激发态（B）和三线激发态（C）
当基态分子的一个成对电子吸收光辐射后，被激发跃迁到能量较高的轨道上，通常它的自旋方向不改变，即ÄS=0，则激发态仍是单线态，即“单线(重)激发态”；
如果电子在跃迁过程中，还伴随着自旋方向的改变，这时便具有两个自旋不配对的电子，电子净自旋不等于零，而等于1：S=1/2+1/2=1 其多重性：M=2S+1=3 即分子在磁场中受到影响而产生能级分裂，这种受激态称为“三线(重)激发态”；
“三线激发态” 比“单线激发态” 能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。（二）分子去活化过程及荧光的发生：
（一个分子的外层电子能级包括S0（基态）和各激发态S1，S2，…..，T1…..，每个电子能级又包括一系列能量非常接近的振动能级）
处于激发态的分子不稳定，在较短的时间内可通过不同途径释放多余的能量（辐射或非辐射跃迁）回到激态，这个过程称为“去活化过程”，这些途径为：
1. 振动弛豫：在溶液中，处于激发态的溶质分子与溶剂分子间发生碰撞，把一部分能
量以热的形式迅速传递给溶剂分子（环境），在10-11~10-13 秒时间回到同一电子激发态的最低振动能级，这一过程称为振动弛豫。
图2 分子吸收和发射过程的能级图
2. 内转换：当激发态S2的较低振动能级与S1的较高振动能级的能量相当或重叠时，分子有可能从S2的振动能级以无辐射方式过渡到S1的能量相等的振动能级上，这一无辐射过程称为“内转换”。
（“ 内转换”过程同样也发生在三线激发态的电子能级间）
3. 外转换：激发态分子与溶剂分子或其他溶质分子相互作用（如碰撞）而以非辐射形式转移掉能量回到基态的过程称“外转换” 。
4.系间跨跃：当电子单线激发态的最低振动能级与电子三线激发态的较高振动能级相重叠时，发生电子自旋状态改变的S—T 跃迁，这一过程称为“系间跨跃” 。
（含有高原子序数的原子如Br2、I2 的分子中，由于分子轨道相互作用大，此过程最为常见。）
5. 荧光发射：当激发态的分子通过振动驰豫—内转换—振动驰豫到达第一单线激发态的最低振动能级时，第一单线激发态最低振动能级的电子可通过发射辐射（光子）跃回到基态的不同振动能级，此过程称为“荧光发射”。
如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒。（它代表荧光的寿命）
由于不同电子激发态（S）的不同振动能级相重叠时，内转换发生速度很快（容易），在10-11~1013秒内完成，所以通过重叠的振动能级发生内转换的几率要比由高激发态发射荧光的几率大的多，因此，尽管使分子激发的波长有短（λ1）有长（λ2），但发射
荧光的波长只有λ3（>λ1>λ2）。
6. 磷光发射：第一电子三线激发态最低振动能级的分子以发射辐射（光子）的形式回到基态的不同振动能级，此过程称为 “磷光发射”。
（磷光的波长λ4较荧光的波长λ3稍长，发生过程较慢 约 10-4~10s ）
由于三线态 — 单线态的跃迁是禁阻的，三线态寿命比较长，（10-3~10s 左右），若没其它过程同它竞争时，磷光的发生就有可能；由于三线态寿命较长，因而发生振动弛豫及外转换的几率也高，失去激发能的可能性大，以致在室温条件下很难观察到溶液中的磷光现象。因此，试样采用液氮冷冻降低其它去活化才能观察到某些分子的磷光。 总之：处于激发态的分子，可以通过上述不同途径回到基态，哪种途径的速度快，哪种途径就优先发生。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较快，则荧光发生几率高，强度大。
如果—发射荧光使受激分子去活化过程与其他过程相比 较慢，则荧光很弱或不发生。
（三）荧光量子效率：
物质发射荧光的光子数与吸收激发光的光子数的比值。
吸收激发光的光子数
发射荧光的光子数=Φ (1) Φ 数值在 0~1 之间。他的大小取决于物质分子的化学结构及环境（t 0c 、pH 、溶剂等）。
二. 激发光谱与荧光（发射）光谱
1. 激发光谱：将激发荧光的光源用单色器分光，连续改变激发光波长，固定荧光发射波长，测定不同波长激发光下物质溶液发射的荧光强度(F )，作F —λ光谱图称激发光谱。 从激发光谱图上可找到发生荧光强度最强的激发波长λex ，选用 λex 可得到强度最大的荧光。
2. 荧光光谱：选择λex 作激发光源，用另一单色器将物质发射的荧光分光，记录每一波长下的 F ，作 F- λ 光谱图称为荧光光谱。
荧光光谱中荧光强度最强的波长为 λem 。
λex 与 λem 一般为定量分析中所选用的最灵敏的波长。