44讲 基因工程

304第44讲 基因工程（选修3 P4）【考纲要求】1、基因工程的诞生（Ⅰ）； 2、基因工程的原理及技术（Ⅱ）； 3、基因工程的应用（Ⅱ）； 4、蛋白质工程（Ⅰ）一、基因工程的概念1、标准概念基因工程又称为 DNA 重组技术或( 基因拼接 技术），是指在生物体外，按人们的需要将特定的目的基因剪切并拼接到病毒、质粒或其它载体分子上，构成重组DNA 分子，并在 离体 条件下导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，最终产生人类需要的基因产物，或改良、创造出新的物种。

2、通俗概念（选修3P1） 学海导航P2完成填空 3、特点 主要技术 基因拼接技术或DNA 重组技术 原理 基因重组 操作环境 生物体外 操作对象 基因 操作水平 分子水平基本过程 剪切→拼接→导入→表达。

一旦成功，便可遗传结果打破生殖隔离，按照人们意愿定向改造生物，产生人类需要的生物类型和生物产品。

【例1】以下有关基因工程的叙述，正确的是 D A ．基因工程是细胞水平上的生物工程B ．基因工程的目的是获得目的基因表达的蛋白质产物C ．基因工程产生的变异属于人工诱变D ．基因工程育种的优点之一是可以定向地使生物产生可遗传的变异二、基因工程的操作工具1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” （1）主要来源：原核生物（2）作用特性：特异性。

一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定切点切割DNA 分子。

（3）作用部位：使每一条DNA 链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

（4）切割的方式：可以分为错位切和平切两种。

①错位切：限制酶在它识别序列的中心轴线两则将DNA 的两条链分别切开，中间相隔几个核苷酸，形成黏性末端 ，这种酶在基因工程中应用得最多的如大肠杆菌的EcoRI 限制酶，能识别GAATTC 序列，并在G 和A 之间切开。

②平切：限制酶在它识别序列的中心轴线处将DNA 的两条链切开，中间没有相隔核苷酸，形成平末端，这种酶在基因工程中应用得最多的如SmaI 限制酶。

（5）两种末端的比较（学海导航P2）【例2】关于限制酶的说法中，正确的是 CA ．限制酶是一种酶，只识别GAATTC 碱基序列B ．EcoRI 切割的是G —A 之间的氢键C ．限制酶一般不切割自身的DNA 分子，只切割外源DNAD ．限制酶只存在于原核生物中 2、DNA 连接酶——“分子缝合针”305（1）作用：DNA 连接酶将双链DNA 片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

（2）分类①大肠杆菌分离得到：E.coli DNA 连接酶，只能缝合 双链DNA 片段互补的黏性末端。

②T 4DNA 连接酶：既可缝合DNA 片段互补的黏性末端，又可缝合双链DNA 片段的平末端 （3）与DNA 分子相关酶的比较（学海导航P2）【例3】 DNA 连接酶催化的反应是 CA ．DNA 复制时母链与子链之间形成氢键B ．黏性末端碱基之间形成氢键C ．两个DNA 片段黏性末端之间的缝隙的连接D ． A 、B 、C 都不正确 【例4】下列关于DNA 连接酶的作用的叙述正确的是 B A ．将单个核苷酸加到某DNA 片段末端，形成磷酸二酯键 B ．将断开的两个DNA 片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键 C ．连接两条DNA 链上碱基之间的氢键 D ．不能将双链片段平末端进行连接 【例5】下图为DNA 分子的切割和连接过程：（1）EcoRI 是一种________________酶，其识别序列是___________，切割位点是__________________与_________________之间的________________键。

切割结果产生的DNA 片段末端形式为_______________。

（2）不同来源DNA 片段结合，在这里需要的酶应是____________连接酶，此酶的作用是在___________________________________ 与___________________之间形成______________键，而起“缝合”作用的。

还有一种连接平末端的连接酶是_________________。

【例5】（1）限制性核酸内切 GAATTC 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷 酸磷酸二酯 黏性末端 （2）E· coliDNA 鸟嘌呤脱氧核苷酸 腺嘌呤脱氧核苷 酸磷酸二酯 T4DNA 连接酶3、基因运载体——“分子运输车” （1）使用载体的目的（2）基因工程的载体必须满足的条件 （3）种类（4）质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA 之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA 分子。

在基因工程中最常用的运载体是质粒，最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。

被用作运载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。

【例5】作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件及理由，表达准确的是 AA ．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因B ．具有多个限制酶切点,以便于目的基因的表达C ．具有某些标记基因，以便为目的基因的表达提供条件D ．能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便于进行筛选 【例6】下列关于质粒的叙述，正确的是（双选）BDA ．质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器B ．质粒进入受体细胞后，除了能进行单独的自我复制外，还能整合到染色体DNA 上，随染色体DNA 复制而复制学海导航P2306C ．细菌的主要遗传性状是由质粒控制的D ．质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状DNA 分子1.2 基因工程的基本操作程序一、获取目的基因（一）目的基因的概念：主要是指编码蛋白质的结构基因， （二）目的基因的获取方法 1、从基因文库中获取目的基因（1）基因文库的概念（学海导航P6）【例1】以下关于基因文库的叙述，正确的是 BA ．基因文库含有各种生物不同基因的许多DNA 片段B ．基因文库含有某种生物不同基因的许多DNA 片段C ．某种生物不同基因的许多DNA 片段被导入某个受体菌的中贮存D ．某个受体菌含有这种生物的不同的基因 （2）基因文库的种类（学海导航P6）获取依据：基因核苷酸序列；基因的功能；基因在染色体上的位置；基因的转录产物mRNA ； 基因翻译产物蛋白质等。

（3）基因结构①原核生物基因结构在原核生物的基因中，分为编码区和非编码区。

编码区能通过转录翻译直接指导蛋白质合成，而且编码区是连续编码的；非编码区位于编码区的上游和下游，有调控遗传物质表达（转录）的序列，如存在启动子（通常是RNA 聚合酶结合的位点）、增强子（增加转录活性）、终止子（转录终止信号）等。

②原核生物基因结构真核生物的基因同样也分为编码区和非编码区，但真核生物的基因的编码区是间隔的、不连续的，即一个基因的编码区包含有几个编码顺序，叫外显子，同时，也包含几个不编码的间隔顺序叫内含子。

外显子和内含子是相间排列的，且外显子通常比内含子多一个。

这样的基因又称为断裂基因。

③归纳基因的定义 DNA 上有遗传效应的片段基因的存在位置 细胞核的染色体及线粒体、叶绿体，原核生物核区及质粒基因如何包含遗传信息基因中脱氧核苷酸的排列顺序代表遗传信息 基因的作用 传递（复制）及表达（转录、翻译）以及储存、变异基因结构原核细胞 分编码区和非编码区，编码区是连续编码的 真核细胞分编码区和非编码区，编码区有内含子和外显子之分， 为断裂基因。

【例2】下列关于基因组文库和cDNA 文库的区别，不正确的是 BA ．基因组文库所包含的基因数量多于cDNA 文库B ．基因组文库和cDNA 文库中均具有启动子C ．基因组文库的真核生物的基因具有内含子D ．cDNA 文库的基因不含内含子 2、利用PCR 技术扩增目的基因 （1）概念PCR 技术即 多聚酶链反应法，是一个模拟细胞核内DNA 复制的天然过程，可在3—4h 内使目的基因扩增上百万倍的技术，极大地方便了对DNA 分子的检测、研究和应用，在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用。

（2）遵循的原理：DNA 双链复制307（3）仪器：PCR 扩增仪（4）前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

（5）DNA 的特性：加热变性，缓慢冷却复性 （6）DNA 的复制的方向DNA 聚合酶只能使脱氧核苷酸按5/→3/连接成子链；新生链的方向只能由5/→3/。

【例3】 关于DNA 复制，下列叙述正确的是 CA ．DNA 聚合酶不能从头开始合成DNA ，只能从引物的5/端延伸DNA 链 B ．DNA 复制不需要引物C ．引物与DNA 母链通过碱基互补配对进行结合D ．DNA 的合成方向总是从子链的3/端向5/端延伸 （7）PCR 技术的关键PCR 技术的关键是利用耐热耐热的DNA 聚合酶，解决了高温导致DNA 聚合酶失活的问题，促成了PCR 技术的自动化，使少量的DNA 在短期内即能扩增数百万倍。

（8）DNA 分子复制的条件引物：单链DNA 片段，使DNA 聚合酶能够从引物的3/端开始连接脱氧核苷酸。

模板：目的基因DNA原料：四种游离的脱氧核苷酸 酶：热稳定DNA 聚合酶（Taq 酶）此外，还需要能严格控制温度变化的温控设备和缓冲溶液。

（9）方式：呈指数扩增扩增：2n，其中n 为扩增循环的次数。

（10）PCR 反应过程一般要经过 30多 次循环，每次循环可分为 变性 、复性 和 延伸。

具体过程：首先，把得到的DNA 加热（至90～94℃），使双链分开（即使DNA 变性）；然后用人工合成一段单链核苷酸（即DNA 引物），粘附到DNA 单股螺旋上，利用DNA 模板链，利用引物的引导，利用周围的脱氧核苷酸原料等，在降温至55～60℃（即使DNA 复性），加热至70～72℃，Taq 酶从引物起始，依据碱基配对原则，进行互补链的合成（即使DNA 延伸），就能复制出新的DNA 来，重复放大30-40次后就可以复制出大量的DNA 分子。

基本过程如下图所示：①高温(90～94℃) ②降温(55～60℃) ③70～72℃ 变性 复性 延伸【例5】①PCR 扩增反应需要在一定的_________中进行，需提供_________、___________、_______________、_________________。

②加热会使DNA 双链间的氢键_______________________。

③在细胞内是_________________________使氢键断裂的。

④PCR 扩增反应中加入引物的作用是什么？⑤DNA 聚合酶(Taq 酶)的作用是什么？【例5】①缓冲溶液 DNA模板两种引物四种脱氧核苷酸耐热的DNA聚合酶②断裂③DNA解旋酶④引物能结合在模板DNA上，提供DNA延伸起始位点。