MTT法检测纳米金粒子体外细胞毒性的研究

● 图 ３ 与不同浓度纳米金粒子共同培养 ２４ ｈ 后 人成纤维细胞形态 （ × ２００）
透射电镜照片可见低浓度纳米金组细胞形态正
● 常 ，生长良好 ，随着纳米金浓度增高 ，镜下可见团聚
的纳米金粒子 ，仍可见纤维细胞正常形态 ，在 ３０ μｇ／ ｍ ｌ纳米金组 ，可见人成纤维细胞已失去正常细胞形 态 ，呈明显的空泡性变 。 ２ ．２ Ｍ Ｔ Ｔ 结果及毒性评级 不同浓度纳米金粒子
ｓｐｏｎｓｅ ，ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｏｆｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｓ ｗ ｅｌｌｂｉｏｃｏｍ ｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｗ ｉｔｈ Ｈ Ｆ ，ａｎｄ ３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｓ ｍ ｏｄｅｒａｔｅ ｃｙｔｏ－
ｔｏｘｉｃｉｔｙ ．
Ｋ ｅｙ ｗ ｏｒｄｓ ：ｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｆｌｏｗ ｅｒ ；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ；Ｍ ＴＴ ｍ ｅｔｈｏｄ ，ｈｕｍ ａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
Ｌ － １纳米金溶胶组 ，其 ＲＧ Ｒ 与空白对照组有显著差异 ，１ ．８７５ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３ ．７５０ ｍ ｇ·Ｌ － １ 组毒性评级为 ０ 级 ，７ ．５００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、
１５ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １组毒性评级为 １ 级 ，倒置显微镜下细胞形态正常 ，生长良好 ，３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 组毒性评级为 ３ 级 ，镜下可
见细胞明显的空泡变性 ；结论 此种纳米金粒子的体外细胞毒性呈剂量依赖关系 ，低浓度纳米金粒子具有良好的生
物相容性 ，３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １纳米金粒子有中度细胞毒性 。
关键词 ：纳米金 ；人成纤维细胞 ；细胞毒性 ；Ｍ ＴＴ 法
中图分类号 ：Ｑ ２
文献标识码 ：Ａ
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ Ｍ ＴＴ ｍ ｅｔｈｏｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＳＯＮＧ Ｗ ｅｎ－ｚｈｉ ，ＹＩＮ Ｗ ａｎ－ｚｈｏｎｇ ，ＹＡＮＧ Ｈ ｕａｎ ，ｅｔ ａｌ ．
— １２４２ —
文章编号 ：１００７ － ４２８７（２０１１）０８ － １２４２ － ０４
Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄ ｉａｇｎ ，Ａ ｕｇｕｓｔ ，２０１１ ，Ｖ ｏｌ １５ ，Ｎ ｏ ．８
Ｍ ＴＴ 法检测纳米金粒子体外细胞毒性的研究
宋文植１ ，尹万忠２ 倡 ，杨 欢１ ，姜雅萍１ ，张天夫１ ，王 伟１
ｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｗ ｅｌｌｇｒｏｗ ｔｈ ｕｎｄｅｒｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍ ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｏｗ ｄｏｓｅ ｏｆｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐｓｗ ｈｉｌｅ ｏｂｖｉｏｕｓ ｖａｃｕｏｌａｒｄｅｇｅｎ －
ｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐ ．Ｃ ｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｈａｄ ｄｏｅｓ－ｅｆｆｅｃｔ ｒｅ－
透射电镜下观察纳米金粒子形态 ，可见制备的
● ◆ 纳米金粒子呈球形 ，直径约 ２５ ｎｍ ，粒径均匀 ，分散
性较好 ，可见－紫外吸收光谱上可见纳米金溶胶主吸
收峰位于 ５４０ ｎｍ 。
●
图 １ 纳米金粒子透射电镜照片
●
图 ２ 纳米金粒子紫外－可见吸收光谱
●
Ａ ：空白对照 ；Ｂ －Ｆ ：１ ．８７５ ，３ ．７５０ ，７ ．５００ ，１５ ．０００ ，３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 粒子组
ｏｇｙ ｏｆ Ｈ Ｆ ｃｅｌｌｓ ｗ ａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍ ｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ；Ｒ ｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ Ｒ ｅｌａｔｉｖｅ ｇｒｏｗ ｔｈ ｒａｔｅ（ＲＧ Ｒ ）ｗ ａｓ １１２ ．６５３％ ，１１１ ．２９３％ ，
８９ ．５２４％ ，７２ ．１０９％ ，４６ ．８０３％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅ ｏｆｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｇｒｏｕｐｓ ，ｔｈｅ ｔｈｅ ＲＧ Ｒ ｉｎ １５ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ，３０ ．０００
（Ｃｈｉｎ Ｊ Ｌａｂ Ｄ ｉａｇｎ ，２０１１ ，１５ ：１２４２）
以纳米金为代表的贵金属纳米材料因其独特的 理化性能成为材料学家关注的热点 ，不仅在电子 、催 化［１ ，２］等高科技领域广泛应用 ，而且被越来越多地 应用于生物检测 、医学成像 、新型药物载体［３ － ５］等生 物医学研究领域 ，本实验拟对所制备的球形纳米金 粒子对人成纤维细胞的体外细胞毒性进行研究 ，以 为其在生物医学领域的应用提供依据 。 １ 材料与方法 １ ．１ 实验材料及仪器 自备球形纳米金溶胶 ；人成 纤维 细 胞 ；ＤＭ ＥＭ 培养基 （Ｇ ｉｂｃｏ ，美 国 ） ；胎 牛 血 清
基金项目 ：吉林 省 科 技 厅 科 研 基 金 资 助 课 题 （２００７０５３２５ ） ；吉 林 大 学 基本科研业务费项目资助课题 （２００９０３０６２）
倡 通讯作者
（ＴＢＤ ，美国） ；二甲基亚砜（Ｓｉｇｍ ａ ，美国） ；０ ．２５％ 胰酶 （Ｈ ｙｃｌｏｎｅ ，美国）四甲基偶氮唑盐（Ｍ ＴＴ ，Ｓｉｇｍ ａ ，美国） ； 其余试剂均为国产分析纯 ；ＪＥＯ Ｌ ＪＥＭ －１２００ＥＸ 透射 电镜 （日本电子 ） ，ＣＡ ＲＹ １００ 紫外可见吸收光 谱 仪 （瓦里安 ，美国） ；Ｄ ＮＭ －９６０２ 酶标分析仪（北京普朗新 技术有限公司） ；１ × ７０－Ｓ８Ｆ 倒置相差显微镜（Ｏ ＬＹＭ － ＰＵ Ｓ ） 。 １ ．２ 方法 １ ．２ ．１ 球形纳米金溶胶的制备 柠檬酸钠还原法 制备球形纳米金粒子 ，具体步骤如下 ：将１００ ｍ ｌ０畅２５ ｍ Ｍ 四氯金酸水溶液置于 ２５０ ｍ Ｌ 圆底烧瓶中 ，搅拌 条件下加热至沸腾状态 ，然后加入 ５％ 柠檬酸钠水 溶液 １ ｍ Ｌ ，待溶液变成酒红色后 ５ ｍ ｉｎ 停止加热 ，空
培养液中加入不同浓度纳米金溶胶（１ ．８７５ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３ ．７５０ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、７ ．５００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、１５ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ）各
组细胞相对增殖率（ＲＧ Ｒ ）分别为 １１２ ．６５３％ ，１１１ ．２９３％ ，８９ ．５２４％ ，７２ ．１０９％ ，４６ ．８０３％ ，加入 １５ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３０ ．０００ ｍ ｇ·
ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐ ｈａｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍ ｐａｒｅｄ ｗ ｉｔｈ ｂｌａｎｋ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０ ．０５） ，ｔｈｅ ｃｙｔｏｘｉｃｉｔｙ ｇｒａｄｅ ｗ ａｓ ０ ｇｒａｄｅ ｉｎ １ ．８７５ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、
３ ．７５ ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐｓ ，１ ｇｒａｄｅ ｉｎ ７ ．５ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、１５ ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ３ｇｒａｄｅ ｉｎ ３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ｇｒｏｕｐｓ ．Ｔｈｅ Ｈ Ｆ ｈａｄ ｎｏｒｍ ａｌｍ 月 第 １５ 卷 第 ８ 期
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气自然冷却 ，得到球形纳米金粒子 ，直径约 ２５ ｎｍ 。 １ ．２ ．２ 细胞培养 取手术切除的新鲜儿童包皮组 织 ，７５％ 酒精消毒后去除结缔组织 ，ＰＢＳ 冲洗 ３ 次 ， 剪成 ５ ｍ ｍ × ５ ｍ ｍ 小块 ，０ ．４％ 中性蛋白酶 ４ ℃ 消化 ２４ ｈ ，分离真皮和表皮 ，将真皮剪碎 ，用 ０ ．２５％ Ⅰ 型
ＲＧ Ｒ （％ ） ＝ 试验组平均 ＯＤ 值 × １００％ ／阴性对 照组平均 Ｏ Ｄ 值
实验中所有结果用均 值 ± 标 准 差 表 示 ，通 过 ＳＰＳＳ 软件包进行统计学处理 ，试验组与阴性对照组 组间差异用 ｔ检验 ，Ｐ ＜ ０ ．０５ 为显著性差异 。 ２ 结果 ２ ．１ 纳米金粒子与细胞形态观察 纳米金粒子透 射电镜照片及可见－紫外吸收光谱见图 １ ，２ 。
Ｈ ｕｍ ａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（Ｈ Ｆ） ｗ ｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗ ｉｔｈ ｍ ｅｄｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｏｓｅ ｏｆｓｐｈｅｒｉｃａｌｇｏｌｄ ｎａｎｏ－ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（１ ．８７５ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３ ．７５０
ｍ ｇ·Ｌ － １ 、７ ．５００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、１５ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ 、３０ ．０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ） ｆｏｒ２４ ｈｏｕｒｓ ，ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｅｆｆｅｃｔｗ ａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｍ ＴＴ ｍ ｅｔｈｏｄ ，ｍ ｏｒｐｈｏｌ－
（１ ．吉林大学中日联谊医院 口腔科 ，吉林长春 １３００３３ ；２ ．吉林大学第一临床医院 耳鼻咽喉头颈外科）
摘要 ：目的 研究球形纳米金粒子对人成纤维细胞的体外细胞毒性作用 ；方法 应用柠檬酸钠还原法制备纳米
金溶胶 ，将纳米金溶胶制备成不同浓度的含金培养液 ，采用 Ｍ ＴＴ 法体外检测其对人成纤维细胞的细胞毒效应 。 结果
］胶原酶 ３７ ℃ 消化 ３ － ４ ｈ ，加含 １０％ ＦＢＳ 的 ＤＭ ＥＭ 终
止消化 ，２００ 目网过滤 ，１ ０００ ｒ·ｍ ｉｎ － １ 离心 ５ ｍ ｉｎ ，加 ＤＭ ＥＭ 重悬细胞 ，转移至培养瓶内培养 ，４ ｈ 后首次 换液 ，去除混有的杂细胞 。 传代 ４８ － ７２ 小时 ，取处 于对数生长期的细胞 ，０ ．２５％ 胰酶消化后调整细胞 密度为 １ × １０５ 个·ｍ Ｌ － １ ，均匀接种到 ９６ 孔板内 ，每 孔 ２００ μＬ ，５％ ＣＯ ２ ，３７ ℃ 孵育 ，至细胞单层铺满孔底 后 ，吸 弃 原 培 养 液 ，将 制 备 的 纳 米 金 粒 子 溶 胶 用 ＤＭ ＥＭ 细胞培养液 （加入 １００ Ｕ ·ｍ Ｌ － １ 青霉素－链霉 素） 稀释后加入到细胞培养板中 ，根据加入的纳米 金浓 度 不 同 分 为 ７ 组 ，各 组 试 验 终 浓 度 分 别 为 １畅８７５ ，３畅７５０ ，７畅５００ ，１５畅０００ ，３０畅０００ ｍ ｇ·Ｌ － １ ，每个浓 度设 ６ 复孔 ，空白对照组只加 ＤＭ ＥＭ 细胞培养液 。 作用 ２４ ｈ 后 ，吸弃原培养液 ，倒置相差显微镜下观 察细 胞 形 态 。 各 孔 用 Ｄ ＰＢＳ 小 心 清 洗 １ 遍 ，加 入 ＤＭ ＥＭ 培养液 ２００ μｌ ，再加入 ５ ｇ·Ｌ － １ Ｍ ＴＴ 溶液 １０ μｌ ，继续培养 ４ ｈ 后中止培养 ，小心吸去孔内培养液 ， 每孔加入 １００ μｌ二甲基亚砜 ，置摇床上低速振荡 １０ ｍ ｉｎ ，使结晶物充分溶解 。 在酶标仪 Ｏ Ｄ 值 ５７０ ｎｍ 处 测量各孔的吸光值 ，参比波长 ６５０ ｎｍ 。 １ ．２ ．３ 评价标准和统计处理 细胞相对增值率 （ＲＧ Ｒ ）计算及细胞毒性评价标准参考ＩＳＯ ２１０９９３２－５ 细胞毒性试验［６］采用 ５ 分制法进行细胞毒性分级 ：０ 级 ：ＲＧ Ｒ ≥ １００％ ，Ⅰ 级 ：ＲＧ Ｒ 在 ７５％ － ９９％ ，Ⅱ 级 ： ＲＧ Ｒ 在 ５０％ － ７４％ ，Ⅲ 级 ：ＲＧ Ｒ 在 ２５％ － ４９％ ，Ⅳ 级 ＲＧ Ｒ 在 １％ － ２４％ ，Ⅴ 级 ＲＧ Ｒ ＜ １％ 。 ０ 级和 Ⅰ 级被 认为没有细胞毒性 ，Ⅱ 级为轻度细胞毒性 ，Ⅲ 级和 Ⅳ 级为中度细胞毒性 ，Ⅴ 级为明显细胞毒性 。