应用光生物反应器高密度培养等鞭藻

文章编号:100125132(2002)0320033206收稿日期:2001-10-30.第一作者简介:潘双叶(1976-),女,汉族,浙江宁波市人,硕士.应用光生物反应器高密度培养等鞭藻潘双叶1,陈　烨1,张华军2,裴鲁青1(1.宁波大学海洋生物工程重点实验室,浙江宁波315211;2.上海华东理工大学海洋生物工程研究所,上海200237)摘要:在经济型10L 气升式光生物反应器上进行了等鞭藻(Isochrysis galbana )高密度培养的研究.结果表明:一次性培养12d ,藻细胞由最初的接种密度1.9×105/m L ,9d 后上升到最高值1.41×107/m L ;定时补充营养盐试验过程中,经过12d 培养,藻细胞密度由最初接种密度1.8×105/m L 上升到最高值6.05×107/m L ,是一次性培养试验相同接种密度、相同培养时间内最高密度1.41×107/m L 的4.29倍.定时补充营养盐试验的第12天,放去2/3体积的藻液,加回新鲜培养液继续培养,2d 后,藻细胞密度由1.56×107/m L 升高到3.5×107/m L ,这对于快速培养饵料生物具有重要意义.关键词:光生物反应器;　培养;　高密度;　等鞭藻中图分类号:S968.4 文献标识码:AStudy on Culturing High 2density Isochrysis galbana in PhotobioreactorPAN Shuang 2ye 1,CHE N Y e 1,ZH ANG Hua 2jun 2,PEI Lu 2qing 1(1.Marine Biotecnology K ey Lab ,Ningbo University ,Ningbo 315211,China ;2.Institute of Marine Bioprocess Engineering ,East China University of Science &T echnom ogy ,Shanghai 200237,China)Abstract :The high 2density cultures of Isochrysis galbana were carried out in a 10L airlift ecnomical algal photobioreac 2tor.The result shows :cell density increased from 1.9×105/m L to 1.41×107/m L after 12days ′batch culture.Cell density of enriched culture increased from 1.8×105/m L to 6.05×107/m L which was 4.29times m ore than the result of batchexperiment in enriched culture for 12days ′cultivating in the second stage of enriched culture ,2/3v algal liquid was taken out of photobioreactor and new liquid added ,its inoculative density of which was 1.56×107/m L which was like high 2density cultivation.The density reached 3.50×107/m L after tw o days.This w ould be significant for quickly culti 2vating food 2biology.K ey w ords :photobioreactor ;　culture ;　high 2density ;　Isochrysis galbana C LC number :S968.4 Document code :A 等鞭藻(Isochrysis galbana )具有个体小(直径为5μm 左右)、繁殖快、营养丰富、运动缓慢,无细胞壁,易被幼虫摄食消化等特点,广泛用于泥蚶、牡蛎幼体培育,是水产双壳类动物幼虫的理想饵料[1].目前,在生产上常用薄膜袋或白塑料桶封闭式培养及水泥池开放式培养等方法进行等鞭藻扩种.在薄膜袋培养过程中,分袋接种、添加培养液等操作比较麻烦;白塑料桶有透光率低等缺点;水泥池培养易受污染,受天气影响较大[2].以上培养方法所能达到的藻体密度普遍较低,如水泥池开放式培养等鞭藻,最高　第15卷第3期2002年9月宁波大学学报(理工版)JOURNA L OF NI NG BO UNI VERSITY (NSEE )V ol.15N o.3Sept.2002密度只达到2.33×106/m L,用薄膜袋培养最高密度达到6.47×106/m L[3].在生产应用上存在着效率偏低,生产不稳定等问题.利用光生物反应器进行微型藻类大量培养工作,已取得一定的效果[4].光生物反应器具有效率高,少污染,易保持单种培养或纯培养,占地面积少等优点.本实验利用10L经济型气升式光生物反应器培养等鞭藻,为光生物反应器的推广应用提供依据.1　材料与方法1.1材料1.1.1等鞭藻藻种由宁波大学海洋生物工程重点实验室藻种室提供.1.1.2培养海水取自奉化湖头渡,经黑暗沉淀,脱脂棉过滤,煮沸消毒冷却后待用,其盐度为28.55,pH=8.05,以每1000m L消毒海水添加“M AV”母液1m L作培养液.1.1.310L简易光生物反应器10L简易光生物反应器(由中科院海洋所研制,经本实验室改造)为外照光内导流气升立式.其主体呈圆筒状,内有一套筒,材料为有机玻璃,高74.5 cm,筒直径为37.5cm,内筒高50cm,直径为12cm,占地面积0.14m2.内筒内放有1个散气石,由通气管连接反应器外的充气泵.由通气管通入一定流量的压缩空气,利用气泡带动内筒培养液,形成在内筒与外筒间的循环,从而使藻液受光均匀,提高光照效率.该反应器采用人工光源,由八支日光灯提供光照.温度控制在25℃,采用室内空调调节.1.2方法1.2.1一次性培养试验接种密度为1.9×105/m L,通气量5L/min,光暗周期为24∶0,光照强度为2000lx;实验周期为12d.1.2.2定时补充营养盐培养试验接种密度为1.8×105/m L,光暗周期为24∶0,起始光照强度为2000lx并随着藻细胞密度的升高隔天提高光强800Lx.每日定时取样,测pH值、OD值、藻细胞密度.适时补充消毒海水(保证培养液总体积为10L)和添加母液,分别在第5天,第7天和第9天添加10m L母液.实验周期为12d.1.2.3收获浓藻液,并补加等体积新鲜基质继续培养试验定时补充营养盐培养12d后,从第13天开始进行第二阶段培养即更新培养,具体方法:放掉2/3培养液,再加回同体积新鲜消毒海水及10m L母液继续培养,继续测定各项指标.实验周期为3d.1.3测定方法1.3.1藻细胞数和光密度测定采用O LY MPUS2CH30型显微镜,0.10mm,1/400 mm2普通血球计数板目视计数;722光栅分光光度计(上海精密科学仪器有限公司),440nm测定光密度.1.3.2生长速率计算公式:K=(ln N t-ln N0)/T其中:K为日平均生长速率;N0为实验开始时藻液细胞密度;N t为t时刻藻液细胞密度;T为培养时间.1.3.3营养盐浓度测定硝酸盐(NO-3—N)浓度的测定采用Cd2Cu还原-重氮-偶氮分光光度法[6];磷酸盐(PO3-4—P)浓度的测定采用磷钼蓝分光光度法[6].2　结果2.1一次性培养2.1.1一次性培养中等鞭藻生长情况等鞭藻在10L气升式反应器中一次性培养的生长曲线见图1.由图可知,一次性培养12d,最高密度可达到1.41×107/m L.11d后藻细胞密度呈下降趋势.2.1.2一次性培养中培养液pH,NO-3—N,PO3-4—P变化情况图2是10L气升式反应器培养等鞭藻过程中培养液pH,NO-3—N,PO3-4—P变化曲线.pH基本上呈上升趋势,第9天升到最高为8.91,此后下降.而培养液中NO-3—N含量从第1天8.92左右到第6天几乎下降为0,培养液中PO3-4—P含量从培养第1天1.78左右到第5天也几乎为0.由此可以得知,等鞭藻在生长过程中对NO-3—N,PO3-4—P的需要量比较大,有必要补充NO-3—N,PO3-4—P.但是,培养液中pH升得太高对藻细胞生长不利.43宁波大学学报(理工版)2002图2　一次性培养时,培养液中NO -3—N ,PO 3-4—P 及pH 变化情况图1　一次性与补充营养盐培养条件下等鞭藻的生长曲线图4　定时培养时,培养液中NO -3—N 、PO 3-4—P 变化情况图3　一次性与定时补充营养盐条件下等鞭藻的生长速率2.2定时补充营养盐培养2.2.1定时补充营养盐培养等鞭藻生长情况等鞭藻在10L 气升式反应器中定时补充营养盐培养的生长曲线见图1.接种密度为1.8×105/m L ,与一次性培养相同的时间(12d ),培养到第11天达最高密度为6.05×107/m L ,以后藻密度下降.其生长速率在培养前5d 与一次性培养类似,但随着营养盐的补加,生长速率高于一次性培养(图3).2.2.2定时补充营养盐培养液pH ,NO -3—N ,PO 3-4—P 变化情况图4,图5反映的是10L 气升式反应器定时补充营养盐培养等鞭藻过程中培养液NO -3—N ,PO 3-4—P ,pH 变化曲线.从图4可知,补加营养盐后,NO -3—N ,PO 3-4—P 含量明显上升.从图5可知,补加营养盐后,培养液中pH 水平有明显反应(pH 是在添加了母液以后测得),在第5天,第7天,第9天呈下降趋势,但随着细胞分裂加快,pH 上升使曲线呈明显波动的缓慢上升.2.3定时补充营养盐与一次性培养等鞭藻生长比较 定时补充营养盐培养试验与一次性培养试验由于不同的培养条件,藻细胞的生长表现出不同的生长规律(图1).在相同的培养时间内,定时补充营养盐培养条件下藻细胞浓度最高为6.05×107/m L ,而一次性培养试验其最高浓度仅为1.41×107/m L.在培养的12d 时间内,藻细胞在定时补充营养盐培养条件下,细胞数呈持续快速增加的趋势,而在一次性培养中虽然前5d 时生长与定时补充营养盐培养情况下基本相同,但整个培养期的生长速率明显较低见表1.生长到第9天仅达最高浓度(1.41×107/m L ),接着开始下降.图5　定时补充营养盐培养时,培养液pH 变化情况53第3期潘双叶等:应用光生物反应器高密度培养等鞭藻表1　等鞭藻的日平均生长速率比较培养时间/d 一次性培养定时补充营养盐培养培养时间/d 一次性培养定时补充营养盐培养1 1.081 1.17070.5880.7422 1.107 1.17680.5330.6713 1.097 1.11790.4780.62740.9410.961100.4210.57550.7990.821110.3730.52860.6740.785120.3190.486表2　等鞭藻的日生长速率比较培养时间/d 一次性培养定时补充营养盐培养培养时间/d 一次性培养定时补充营养盐培养1 1.0811.17070.0740.4852 1.134 1.18180.1460.1693 1.075 1.00090.0430.28140.4750.49110-0.1010.10750.2280.26111-0.1080.06460.0510.60712-0.2690.012表3　收获一定体积藻液,补加新鲜海水培养试 验等鞭藻的相对生长速率及细胞密度比较培养时间/d一次性培养生长速率细胞密度定时补充营养盐培养生长速率细胞密度5～70.0621030～1167　0.5461090～32507～90.0951167～1410　0.2253250～51009～11-0.1051410～1144　0.0855100～605010～12-0.1891275～874　0.0386050～560012～14220.4041560～35002.5收获一定体积藻液,补加新鲜海水培养以上两试验都可看出,培养10d 左右以后,藻细胞生长速率发生了明显下降,这可能由于细胞密度过大、培养液老化有一定关系.在定时补充营养盐培养藻细胞12d以后,取出2/3体积的藻细胞培养液,重新向反应器中加入等体积的新鲜消毒海水,并加入10m L 母液,继续培养,其生长曲线如图6.从图图6　收获一定体积藻液,补加新鲜海水培养条件下等鞭藻的生长曲线6可以得知,收获一定体积藻液,补加新鲜海水后,起始密度为1.56×107/m L ,相当于高密度接种培养.培养2d 达到3.5×107/m L.两天的生长速率为0.404,比定时补料培养的10～12d 生长速率为0.038高,但比定时补料培养密度从1.09×107/m L 上升到3.25×107/m L ,生长速率(0.546)低.3　讨论 (1)在相同的培养时间内,定时补充营养盐培养与一次性培养表现出不同的生长情况.从细胞密度来看,定时补充营养盐培养12d ,藻细胞密度达到最高为6.05×107/m L ,是一次性培养最高密度的4.29倍,藻细胞代时由一次性培养的9d 延长到11d (图1所示).从细胞生长速率来看,由表1可以得知,一次性培养或定时补充营养盐培养5d ,等鞭藻的日平均生长速率比较高,但其细胞密度比较低,到第5天为1.05×107/m L ,这对于生产上来说,意义不大,不能满足生产的需要.在一次性培养过程中,第6天开始,细胞生长速率下降比较快,到第9天,细胞密度达到最高为1.41×107/m L ,以后,细胞密度开始下降.而在定时补充营养盐培养试验中,第5天,第7天,第9天分别添加了营养盐,其细胞生长速率明显比一次性培养高(表2也能反应出),细胞密度增长比一次性培养快,第11天达最高密度为6.05×107/m L.也就是说,通过添加营养盐起到提高生长速率,延长细胞代时的作用.图2中NO -3—N ,PO 3-4—P 浓度变化曲线也反映出第5天时,NO -3—N ,PO 3-4—P 浓度接近于0,说明了等鞭藻生长过程中需要消耗一定量的NO -3—N ,PO 3-4—P.因此,培养到第5天时,有必要向反应器中添加营养盐.图4反映了添加营养盐之后,培养液中NO -3—N ,PO 3-4—P 浓度变化情况.培养到第5天时,添加了母液后,NO -3—N ,PO 3-4—P 浓度有回升趋势.但经过2d 培养(图5)pH 值又升得比较高,所以在第7天又添加了营养盐,这时,培养液中NO -3—N ,PO 3-4—P ,浓度变化与前面类似,所以培养到第9天时,又一次补加了营养盐.此后培养了3d ,发现藻细胞生长开始进入衰退期,藻密度开始下降,从而不再添加营养盐.从表3可以看出,当定时补充营养盐培养12d 以后,取出2/3体积培养液,加回等体积新鲜消毒海水继续培养即收获一定体积藻液,补加新鲜海水培养,经过2d63宁波大学学报(理工版)2002培养,细胞密度由1.56×107/m L上升到3.50×107/ m L,日平均生长速率为0.404,比定时补充营养盐培养的7～9,9～11,10～12d的日平均生长速率都高.这说明了经济型光生物反应器培养等鞭藻达到高密度时,更换新鲜培养液,可以起到提高生长速率的作用.收获一定体积藻液,补加新鲜海水培养在2d内所达到的细胞密度绝对值是相当高的,这对于生产育苗来说使具有很大意义,一方面可以节约人力,物力,另一方面可以节约时间,提高藻细胞数的收获数.另外,本次定时补料培养试验是在第5天开始添加营养盐的,在5d以前就添加营养盐会不会效果更好,也有待于研究.不同的接种密度,是否效果不一样等等众多的疑问有待于进一步解决.在本次试验中,隔天提高光强800lx,一方面可以减少随着藻细胞密度的增加而引起的光衰减作用,另一方面是为了防止一次性增加光强过大而引起的光抑制作用.至于在培养过程中,光强应何时增加,增加多少及不增加光强对等鞭藻的生长有何影响还有待于进一步的试验加以研究与探讨.(2)空气中只含有0.03%的二氧化碳,当无法满足等鞭藻生长对无机碳的需求时,藻细胞就消耗培养液中的HC O-3进行光合作用,pH值不断上升,等鞭藻生长越快,pH值升高幅度越大[7].因此,在10L气升式反应器培养等鞭藻过程中,通过测定培养液的pH值可以一定程度上反映等鞭藻的生长情况.由图2看出,pH值呈现上升趋势,最高为8.91.通常认为,等鞭藻的最适pH为8.0左右,超过8.75会抑制其生长[8].在培养到第5天时,藻液pH已达到8.7左右,这时候如果不降低pH,藻细胞生长会受到影响.图5反映了添加营养盐之后,培养液中pH值变化情况.培养到第5天时,添加了母液后,藻液pH明显下降.但经过培养pH值又升高,所以在第7天又添加了营养盐,这时,藻液中pH变化与前面类似,所以培养到第9天时,又一次补加了营养盐.因此,通过添加营养盐,一方面防止pH值快速上升,另一方面,可以补充营养[9].另外,本次试验说明了在培养等鞭藻的过程中向反应器中添加营养盐,可以达到优化培养条件,达到高密度培养的目的;及时收获藻液和添加新鲜培养液有明显的应用价值.(3)生产上常用薄膜袋或白塑料桶封闭式培养及水泥池开放式培养等方法进行等鞭藻扩种.但在薄膜袋培养中,分袋接种、添加培养液等操作比较麻烦,适用于一次性使用;白塑料桶有透光率低等缺点;水泥池培养易受污染[3].同时,这3种培养方法所能达到的藻体密度都不高.缪国荣等采用聚乙烯薄膜袋做等鞭藻培养容器,进行平卧封闭式培养,在生产上取得了一定的效果[3].表4为光生物反应器补料培养等鞭藻效果与薄膜袋,水泥池培养效果[3]的比较.表4　不同容器培养结果比较[3]天数培养天数/d01234566d平均日增指标X/(10-4・m L・d-1)K3d平均日增指标X/(10-4・m L・d-1)K水泥池658713615520223123328.00.2128300.29薄膜袋5612225032641762364798.50.4079900.59光生物185818951484012702002330.70.7850165.33 1.12反应器15602700350033756050.26注:X为日平均增长密度. 由表2数据知,用水泥池开放式培养等鞭藻,生长6d后其密度只达到2.33×106/m L,用薄膜袋培养达到6.47×106/m L,而用光生物反应器培养可以达到2.002×107/m L.用以投喂扇贝幼虫时,在相同投喂密度下,投喂光生物反应器培养的藻液量为薄膜袋培养的23.3%,为水泥池培养的藻液量的11.6%,这样就可以减少随藻液而带入的NH+4-N 等,提高了投饵质量.另外,用光生物反应器培养球等鞭藻,当藻液密度达到很高时,放去2/3体积的藻液继续培养(更新培养),即接种密度为1.56×107/ m L,相当于高密度接种培养,其平均日增长密度是接种密度为1.8×105/m L的3.66倍,是水泥池培养的20.17倍,是薄膜袋培养的6.72倍,这对于育苗时快速培养饵料具有重要意义.4　结论 (1)10L气升式光生物反应器能够培养出高密度的等鞭藻.补料分批培养等鞭藻12d,等鞭藻的细73第3期潘双叶等:应用光生物反应器高密度培养等鞭藻胞密度由1.8×105/m L 上升到6.05×107/m L.(2)用光生物反应器培养等鞭藻时,通过添加营养盐,能够起到加速等鞭藻生长的作用.(3)光生物反应器培养等鞭藻到一定的密度后,收获并添加新鲜培养液继续培养,在生产上具一定应用价值.参考文献:[1]　竺俊全,赵青松,石钢德.泥蚶育苗中优质单胞藻培养技术[J ].水产科学,2000,(3):22～24.[2]　戴俊彪,吴庆余.室内外培养海洋单细胞微藻的生长及生化组分[J ].海洋科学,2000,24(6):29～32.[3]　缪国荣,宫庆礼,王进和,等.单胞藻薄膜袋封闭式培养技术的研究[J ].青岛海洋大学学报,1989,19(3):119～124.[4]　刘晶琳,张嗣良.封闭式光生物反应器研究进展[J ].生物工程学报,2000,16(2):119～123.[5]　湛江水产专科学校.海洋饵料生物培养[M].北京:中国农业出版社,1979.[6]　曹善茂.碳酸氢钠在单胞藻生产性培养中的应用[J ].大连水产学院学报,1997,7(3):52～58.[7]　张栩,戢涌聘,周百成.气升式藻类光生物反应器的应用研究[J ].海洋科学,2000,24(5):14～17.[8]　曹丽.持续稳定培养单胞藻技术[J ].水产科学,1995,14(4):35～37.[9]　李志勇,郭祀远,李琳,等.螺旋藻的大规模工业化生产[J ].海洋盐与化工,1997,27(1):38～44.(责任编辑　洪明照)83宁波大学学报(理工版)2002。