赤羽病病毒的纯化及其单克隆抗体的制备

中国动物检疫2009年第26卷第4期赤羽病（Ａｋａｂａｎｅｄｉｓｅａｓｅ）又名阿卡斑病，是由赤羽病病毒引起的牛、绵羊和山羊的一种多型性传染病。

以流产、早产、死胎、畸形产为特征，能引起先天性关节弯曲和水性无脑症。

日本、澳大利亚以外，以色列（１９６９）、沙特阿拉伯、科威特、也门、巴林、土耳其、印度尼西亚（１９７９）、韩国（１９８２）和阿拉伯联合酋长国（１９８８）等国均有报道本病记录［１］。

给畜牧业造成严重的经济损失，是国际动物贸易中重点检疫对象。

目前我国尚无用于赤羽病病毒检测的试剂盒，所需全部依靠进口。

我们旨在通过本研究，将人工繁殖、纯化的赤羽病病毒作为免疫原，通过常规杂交瘤技术，制备亲和性强、特异性好的小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体，并进行了相应的纯化和标记工作，为日后诊断、检测赤羽病病毒打下基础。

１材料与方法１．１材料ＣＯ２培养箱、ＶＥＲＯ细胞、ＭＥＭ、离心机、Ｇ２５凝胶柱、ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ阴离子层析柱、酶联仪、ＥＬＩＳＡ试剂盒（ＥＭＡＩＮＳＷＡｕｓ－ｔｒａｌｉａ，Ｒ２５７９）等。

１．２赤羽病病毒的增殖将ｖｅｒｏ细胞于含１０％ＦＢＳ的ＭＥＭ培养基中，置３７℃，５％ＣＯ２培养箱培养至单层生长，１．３赤羽病病毒的纯化将感染赤羽病病毒的ｖｅｒｏ细胞培养液，２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清；Ｇ２５凝胶过滤置换至缓冲液ｐＨ７．０磷酸盐缓冲液，再经ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ阴离子交换层析柱行“穿透式”层析，收集穿流峰；截流分子量３００００的浓缩管超滤浓缩。

１．４纯化病毒的检测ＢＣＡ法测定纯化病毒的含量，方法参照试剂盒说明书，根据标准曲线，估算纯化所得病毒的含量；病毒定量包被酶标板，４℃过夜，１００μｌ／孔５％ＦＢＳ３７℃封闭１ｈ，５０μｌ／孔加入小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体，３７℃孵育１ｈ，ＰＢＳ－Ｔ洗三遍，５０μｌ／孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白多克隆抗体，３７℃孵育１ｈ，ＰＢＳ－Ｔ洗五遍，加入ＴＭＢ底物液，室温显色１５ｍｉｎ，测定４５０ｎｍ吸光值。

１．５小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体的制备常规方法免疫６周龄Ｂａｌｂ／ｃ小鼠，首次基础免疫使用福氏完全佐剂，每隔３周进行一次基础免疫，共三次，５０－１００μｇ／只／次，第二次和第三次免疫后１０ｄ取小鼠尾血，使用进口试剂盒提供的包有病毒的酶标板检测血清效价。

最后一次基础免疫后３周后脾内注射加强免疫，２５μｇ／只；３ｄ后取脾，与ＮＳ１小鼠骨髓瘤细胞进行融合，按常规方法进行。

１．６抗赤羽病病毒单克隆抗体的亚克隆及亚类鉴定融合１２ｄ后，收集单克隆生长的融合孔上清，利用ＥＭＡＩＮＳＷＡｕｓ－ｔｒａｌｉａ（有效期内）试剂盒提供的酶标板进行筛选，选择反应性强，生长状态好的杂交瘤细胞进行亚克隆，得到稳定分泌抗赤羽病病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为ＡＡＫ，液氮冻存；使用亚类检测试剂盒测定ＡＡＫ亚类，方法参照说明书。

１．７抗赤羽病病毒单克隆抗体的生产及其酶标抗体的制备采用小鼠腹腔内诱生法，将ＡＡＫ细胞株接种Ｂａｌｂ／ｃ小鼠腹腔，１．５×１０６／只，１周后采集腹水，经ＰｒｏｔｅｉｎＧＳｅｐｈａｒｏｓｅ４ＦＦ亲和层析柱层析，制备抗ＡＡＫ抗体纯品。

过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的ＡＡＫ；称取５ｍｇＨＲＰ溶解于１ｍｌ蒸馏水中；向其中加入０．２ｍｌ新配的０．１ＭＮａＩＯ４溶液，室温避光搅拌２０ｍｉｎ；于１ｍＭｐＨ４．４的醋酸钠缓冲液中透析，４℃过夜；向其中再加入２０μｌ０．２ＭｐＨ９．５的碳酸盐缓冲液，然后立即加入溶于０．０１Ｍ碳酸盐缓冲液的ＡＡＫ抗体纯品５ｍｇ（１０ｍｇ／ｍｌ），室温避光轻柔搅拌２ｈ；加入０．１ｍｌ新配的４ｍｇ／ｍｌＮａＢＨ４，混匀，４℃放置２ｈ；所得产物于０．１５ＭｐＨ７．４ＰＢＳ中４℃透析过夜。

１．８ＡＡＫ抗体的初步鉴定使用上述澳大利亚提供的酶标板，按照常规ＥＬＩＳＡ方法对制备的ＡＡＫ纯品和ＡＡＫ－ＨＲＰ进行检测。

１．９以进口试剂盒对生产的ＡＡＫ进赤羽病病毒的纯化及其单克隆抗体的制备赵祥平１，屈浩２，董志珍１，肖妍１，侯艳梅１，郭桂庆２，黄丽华２，王冬梅２，张宇光２（１．天津出入境检验检疫局，天津３００４５７；２．协和干细胞基因工程有限公司，天津３００４５７）摘要：将人工繁殖、纯化的赤羽病病毒作为免疫原，通过常规杂交瘤技术，制备亲和性强、特异性好的小鼠抗赤羽病病毒单克隆抗体，并进行相应的纯化和标记工作。

以澳大利亚进口的试剂盒进行验证，结果证明：进口单抗与我们制备的ＡＡＫ纯品及ＡＡＫ－ＨＲＰ显示同样结果；且质控结果表明，ＡＡＫ纯品及其衍生物ＡＡＫ－ＨＲＰ的特异性和亲和性均基本满足进行封闭ＥＬＩＳＡ检测方法的要求，为制备国产化ＥＬＩＳＡ试剂盒提供了基础。

关键词：赤羽病病毒；纯化；单克隆抗体中图分类号：Ｓ８５２．６５９．５文献标识码：Ａ文章编号：1005－944X （2009）04－0029－03Abstract:A monoclonal antibody against Akabane virus was developed using artificial grown virus.Normal hybridoma technology was used to prepare more specific and sensitive mouse anti-Akabane virus monoclonal anti-body,which was then purified and labeled,and was compared with the Australia commercial Elisa-kit .It was certified that our AAK and AAK-HRP had the same effect as the imported monoclonal antibody kit,and from the quality control results,both specificity and sensibility of AAK or AAK-HRP met requirements for ELISA.The study provides the basis for the developrent of domestic ELISA kit for akabane disease virus.Key words :Akabane Disease Virus;Purification;Monoclonal AntibodyPurification of Akabane Disease Virus and Preparation of Its Monoclonal AntibodyZhao Xiang-ping 1,Qu Hao 2,Dong Zhizhen 1,Zhao Yan 1,Hou Yanmei 1,Guo Guiqing 2,Huang Lihua 2,Wang DongMei 2,Zhang Yuguang 2(1.TianJin Exited Entry Inspection and Quarantine Bureau;2.Xiehe stem cell Gene Engineering Co.Ltd.)试验研究－29－中国动物检疫2009年第26卷第4期行检测以我们制备的ＡＡＫ纯品和ＡＡＫ－ＨＲＰ与进口试剂盒中单抗进行了平行比对试验。

进口的单抗和我们的ＡＡＫ纯品均按照试剂盒说明书步骤进行，ＡＡＫ－ＨＲＰ省略二抗步骤，一抗反应后直接显色。

各个质控孔均作４个平行孔，取平均值计算抑制率，公式为：抑制率＝（阳性－阴性））／阴性×１００％２结果２．１凝胶层析柱法纯化赤羽病病毒颗粒经Ｇ２５凝胶层析置换缓冲液，ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＸＬ阴离子交换层析柱穿流峰主要为病毒颗粒。

ＥＬＩＳＡ检测，可以与特异性识别赤羽病病毒的单克隆抗体反应（图１，２）。

２．２纯化的赤羽病病毒定量及活性测定病毒外壳为蛋白质，可以利用测定蛋白含量的方法来测得病毒的相对含量，ＢＣＡ法测得便准曲线后，利用Ｅｘｅｃｌ线形回归计算得到病毒样本含量（表１）。

纯化病毒经浓缩后浓度为８９４μｇ／ｍｌ。

根据测得的病毒含量，定量包被病毒颗粒于酶标板，然后使用进口对照小鼠抗赤羽病病毒抗体测定所纯化病毒颗粒的免疫原性，结果证明所得的病毒颗粒可以被特异性抗体识别，可以用于免疫（表２）。

２．３赤羽病病毒免疫小鼠及杂交瘤的制备每次免疫小鼠后第十天取尾血，融合前摘除眼球采血，使用包被有病毒的酶标板（ＥＭＡＩＮＳＷＡｕｓｔｒａｌｉａ，Ｒ２５７９）检测血清中抗体效价。

可见随着免疫次数的增加，小鼠血清效价显著增加（表３，４）。

选择效价最高的１号小鼠进行融合，在融合前其血清效价达到１：１６０００（表５）。

杀死小鼠后取脾得１．８×１０８细胞，与ＮＳ１骨髓瘤融合，共筛得１６株阳性杂交瘤细胞，命名为ＡＡＫ（原孔号）。

冻存于液氮中备用。

２．４取ＡＡＫ（２Ｂ２）进行亚克隆，得到阳性杂交瘤细胞株。

使用ＳＢＡＣｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇＳｙｓｔｅｍ－ＡＰ测得其亚类为ＩｇＧ１／ｋ。

按１×１０６／只注射小鼠腹腔，诱生腹水。

腹水经Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ亲和凝胶层析住纯化（图３，４），共得单克隆抗体纯品２０ｍｇ，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测纯度大于９２％。

取１０ｍｇ过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶得ＡＡＫ－ＨＲＰ６ｍｇ。

２．５ＡＡＫ的初步鉴定使用包被有病毒的酶标板（ＥＭＡＩＮＳＷＡｕｓｔｒａｌｉａ，Ｒ２５７９）检测所制备的ＡＡＫ抗体的活性，Ｃｏｎ为阴性对照，Ｐｏｓｉｔｉｖｅ为进口小鼠抗赤羽病病毒抗体，结果表明无论是ＡＡＫ纯品（间标法）还是ＡＡＫ－ＨＲＰ（直标法）均可以识别赤羽病病毒，２．５μｇ／孔用量所得结果与对照抗体接近（表６）。

２．６与进口试剂盒中所提供单抗的比对实验我们制备的ＡＡＫ抗体与进口试剂盒中的抗体对同一批牛血清样本进行了平行比较，结果一致（表７）。

根据公式换算抑制率（表８）。

此批牛血清的赤羽病病毒抗体均为阴性，因此结果未列出。

３讨论病毒的纯化有很多方法，如沉淀法、离心法和透析法等。

最近，随着技术的发展，液相色谱层析法逐渐成为一种新兴的纯化病毒的方法，并且应用越来越广泛。

对比其它传统方法，其具有无试剂残留，易于规模线性放大，方法易于标准化，适合大规模生产等优点，在具备仪器设备的条件下是一种简单有效的纯化病毒的方法［２－３］。

根据我们的研究目的和已具备的条件，我们选择液相色谱作为纯化赤羽病病毒颗粒的方法。

我们使用试验研究－30－中国动物检疫2009年第26卷第4期Ｇ２５凝胶过滤层析将病毒颗粒置换到合适ｐＨ的缓冲体系中，再通过阴离子交换层析柱只进行一步“穿透式”层析，就可以去除几乎所有培养体系中的其他蛋白质成分，得到可以满足作为免疫原使用的病毒颗粒，并且此方法没有烈性条件，对病毒基本没有损害，可以最大程度上保存病毒颗粒的天然构像，为制备杂交瘤，得到对天然病毒构像识别能力强的单克隆抗体打下了基础。