生物化学实验复习题

生物化学实验复习题：
1.试述旋光法测定淀粉含量的实验原理。

2.在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。

在一定的水解条件下，不同谷
物淀粉的比旋光度是不同的。

其在171～195之间，因此可用旋光法测定粗淀粉的含量。

3.淀粉含量测定的方法有几种比较各方法特点。

4.淀粉是由多个葡萄糖缩合而成的多糖，测定淀粉的方法主要有酸水解法、酶水解法和旋
光法等。

5.1、酸水解法：面粉经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用酸水解淀粉为葡萄糖，
按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。

6.2、酶水解法：面粉经除去脂肪及可溶性糖类后，其中淀粉用淀粉酶水解成双糖，再用
盐酸将双糖水解成单糖，最后按还原糖测定，并折算成淀粉。

7.3、旋光法：在加热及稀盐酸的作用下，淀粉水解并转入盐酸溶液中。

在一定的水解条
件下，不同面粉淀粉的比旋光度是不同的。

其淀粉的比旋光度在171~195之间，因此可用旋光法测定淀粉的含量。

8.简述旋光法测定淀粉的关键步骤。

9. 1.样品的处理
在电子天平上称取小麦粉置于三角瓶中→加入50ml 1%HCl混成浆状（不能有结块）→沸水浴中准确加热15min→先加1ml 30% ZnSO4混匀→再加1ml 15%亚铁氰化钾混匀→移至100ml容量瓶中加水定容混匀后过滤→弃去最初15ml收集其余滤液。

2.旋光度测定
取滤液20ml置于旋光管中，先用1%HCl 调节旋光仪“0”点，然后将样品溶液放入旋光仪中测α
10.写出计算粗淀粉含量的公式并说明各符号的含义。

11.
12.。

13.试述凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验原理。

14.含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮
则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定浓度的过量硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直到恢复溶液中原来氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数（相当于待测物中氨的摩尔数）计算出待测物中的总氮量。

15.蛋白质含量测定的方法有几种比较各方法特点。

①染料法，该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。

本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。

双缩脲(Biuret)法，此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

主要的缺点是灵敏度差。

因此双缩脲法常用于快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法双缩脲法操作简单，线性关系好，但灵敏度差，样品需要量大，测量范围窄，因此在科研上的应用受到限制；而酚试剂法弥补了它的缺点，因而在科研中被广泛采用，但是它的干扰因素多；
②定氮法,双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法.考马斯亮蓝法（Bradford法）.
凯氏定氮灵敏度低,适用于氮,误差为±2％费时
10小时将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长
双缩脲法（Biuret法）灵敏度低20mg 中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋®紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定,但不太灵敏；不同蛋白质显色相似
紫外吸收法较为灵敏50～100mg 快速10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；
Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高5mg 慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；
各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化
考马斯亮蓝法(Bradford法) 灵敏度最高5mg 快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm 强碱性缓冲液；
SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化
16.简述凯式定氮法测定蛋白质的关键步骤。

17.1、消化：在电子天平上称取小麦粉置于凯氏试管底部→加混合混合催化剂和3ml
浓硫酸置于消化炉中高温加热至淡绿色透明（2h左右）取出放入通风橱内至不冒白
烟，向其中加20ml水，并移至100ml容量瓶定容→即得样品消化液。

同时每4组8人做1空白实验：混合催化剂+3ml浓硫酸置于凯氏试管中放入消化炉加热至淡绿色（1h左右）→冷却后加水移入100ml容量瓶中定容得空白消化液。

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2.蒸馏与吸收：吸取10ml 2%的硼酸于三角瓶中→加4d甲基红-溴甲酚绿混合指示剂
（若变绿色则用L HCl调至紫红色）。

将其置于冷凝管下端并使管尖插入液面以下，再吸取5ml消化液从漏斗上方加入蒸馏室内用水洗两次，并加入10ml 40%NaOH后水封（注意：勿使漏斗内玻杆取下以防漏气），然后打开通气阀进行加热蒸馏，直至吸收液由紫红色变成绿色，计时蒸馏3min→先移去吸收液再停止加热以防倒吸。

3. 滴定：用L HCl 滴定吸收液由绿色退去变红色为止，记下耗去标准盐酸的体积。

18.写出计算蛋白质含量的公式并说明各符号的含义。

19.
20.试述淀粉酶活力测定的实验原理。

21.淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。

α-淀粉酶可作用于淀粉中的α-1,4-糖
苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，生成麦芽糖。

淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

22.
淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。

用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于萌发后的禾谷类种子中，，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。

两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在以下迅速钝化。

β-淀粉酶不耐热，在70℃15min 钝化。

根据它们的这种特性，采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。

在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

23.淀粉酶活力测定的方法有几种比较各方法特点。

第一种：相同条件下,分别将等物质的量的酶加入适宜条件的淀粉中,然后用碘液测定
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第二种：相同条件下,分别将等物质的量的酶加入适宜条件的淀粉中,然后用斐林试剂进行还原糖的测定
24.简述淀粉酶活力测定的关键步骤
淀粉酶活力测定
①α-淀粉酶活力测定
吸取原液1ml于具塞试管中→70℃保温15min用于钝化β-淀粉酶→加1ml 1%淀粉置于40℃水浴中保温5min→加1% 一二硝基水杨酸2ml 沸水加热5min后加水至20ml混匀测A1（用1#管调零）
②总酶活力测定
吸取稀释液1ml于具塞试管中→加1ml 1%淀粉40℃保存5min→加入1% 一二硝基水杨酸2ml沸水加热5min后加水至20ml混匀测A2（用1#管调零）
25.写出计算淀粉酶活力大小的公式并说明各符号的含义。

26.
~
β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力
麦芽糖含量从标准曲线上查得麦芽糖的毫克数原液体积为100
稀释倍数为50
规定：40℃5分钟内淀粉酶水解淀粉产生1mg麦芽糖为1个活力单位（u）
27.试述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的实验原理。

28.聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的
分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。

当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。

29.试比较已做实验测定蛋白质分子量方法的异同点。

①目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法：该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。

凝胶过滤层析法：凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，周期短，重复性能好，条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。

凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白
质有可能因变性而偏离。

糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。

凝胶渗透色谱法：凝胶渗透色谱法分离速度快、分析时间短、重现性好，进样量少、自动化程度高。

但设备投入较大，价格较高。

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SDS-凝胶电泳法：实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。

但是精确程度相对较低，好的电泳图谱需要一定的技术。

渗透压法，电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法
②异；一般凝胶层析是非变性的，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是变性的，，所以
是亚基（肽。

凝胶层析与分子形状有关，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳与分子形状无关。

同；都能分离不同分子量的蛋白质；原理相同
SDS-PAGE 超速离心凝胶过滤粘度法生物质谱技术
30.简述SDS-PAGE法测定蛋白质分子量的关键步骤。

1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）放置桌面上→在上面放置“U”型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。

2. 凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 凝胶缓冲液(用前混匀再取)，2ml 1%TEMED，重蒸水，10%过硫酸铵混匀后→立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子置于35ºC培养箱中放置15min，待胶凝后取下“U”条→重新将胶板放置于电泳槽内→向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液没过低板→最后拔出梳子。

3. 加样：用微量进样器加入10μl标准蛋白于中间胶槽内→其余槽内加入10μl下列样品①牛血清蛋白②绿豆分离蛋白
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4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源→调电流120mA →电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）
5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液→测量指示剂迁移距离和染色前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离
6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内→向其中加入%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇
床上染色过夜
7. 脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。

31.写出电泳法测定蛋白质分子量的计算公式并说明各符号的含义。

32.
33.试述赖氨酸含量测定的实验原理
34.蛋白质中赖氨酸的含量是谷物品质的主要指标之一。

由于动物及人类不能合成，须
从食物中得以补充，为此培育高含量赖氨酸的谷物，对于提高营养价值有重要意义。

本实验分别用茚三酮溶液显色法和染料结合法，测定小麦种子中赖氨酸含量。

谷物蛋白中赖氨酸残基有自由的ε－NH3与茚三酮试剂可发生颜色反应，生成紫红色物质，其颜色深浅与赖氨酸残基的数目成正相关，而其它氨基酸没有自由氨基，不能发生这一反应。

选用碳原子数目与赖氨酸相同的亮氨酸，配成标准溶液，做出标准曲线，可用以测定谷物蛋白内赖氨酸的含量。

35.氨基酸含量测定的方法有几种比较各方法特点。

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常用的有,半定量法：纸层析法；定量法：HPLC柱前衍生化法.
1)称干重法.可用离心法或过滤法测定.优点：可适用于一切微生物,缺点：无法区别死菌和活菌.
2)比浊法.原理：由于微生物在液体培养时,原生质的增加导致混浊度的增加,可用分光光度计测定.优点：比较准确.
3)测含氮量,大多数微生物的含氮量占干重的比例较一致,根据含氮量再乘以即可测得其粗蛋白的含量.
4)血球计数板法.优点：简便、快速、直观.缺点：结果包括死菌和活菌.
5)液体稀释法.对未知菌样作连续的10倍系列稀释,经培养后,记录每个稀释度出现生长的试管数,然后查MPN表,再根据样品的稀释倍数就可计算其中的活菌含量.优点：可计算活菌数,较准确.缺点：比较繁琐.
6)平板菌落计数法.取一定体积的稀释菌液涂布在合适的固体培养基,经培养后计算原菌液的含菌数.优点,可以获得活菌的信息.缺点：操作繁琐,需要培养一定时间才能获得,测定结果受多种因素的影响.
36.简述测定赖氨酸的关键步骤。

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1.标准曲线的制作（每2组4人做1标准曲线）
2、样品的处理与测定：在电子天平上称取小麦粉10mg于具塞试管底部→加1ml 2% 碳酸钠于80℃水浴中保温提取10min→加2ml茚三铜试剂80℃水浴中保温30min后冷却至室温→加5ml 95%乙醇和5ml蒸馏水充分混匀后转移至离心管中3000转/分离心3min（离心前必须平衡）→取上清液测A（以1号管调零）
37.写出计算赖氨酸的公式并说明各符号的含义。

38.试述甲醛滴定法测定氨基氮的实验原理。

常温下甲醛能迅速与氨基酸的氨基结合生成亚羟甲基化合物，使上述平衡右移促使NH3+释放H+，从而使溶液酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH值左右），根据滴定终点时所消耗标准碱的量即可算出反应体系中存在的游离氨基即氨基氮的含量如果样品为一种已知的氨基酸，即可算出该氨基酸的含量。

如果样品为未知氨基酸或几种氨基酸的混合物，则只能算出其氨基氮的含量。

39.简述甲醛滴定法测定氨基氮的关键步骤。

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已知氨基酸溶液中氨基酸含量的测定:
取3只三角瓶编号①2ml 1% 甘氨酸②2ml 1% 甘氨酸③2ml 水（空白）
均加5ml 水和5ml中性甲醛（用前加2滴% 酚酞滴加LNaOH调至淡红色），及4滴%酚酞混匀→用L滴至粉红色出现为止→分别记下耗去标准碱的体积）
40.写出甲醛滴定法测定甘氨酸的公式并说明各符号的含义。

41.试述纸上层析法分离氨基酸的实验原理。

纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的－OH具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。

有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。

流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。

42.氨基酸分离的方法有几种比较各方法特点。

43.氨基酸的分离提纯方法主要有沉淀法、离子交换法、萃取法、电渗析等
44.离子交换法，根据氨基酸是两性电解质这一特征,以及目的氨基酸与杂质氨基酸pK、
pI值的差异,利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同对氨基酸进行分离纯化。

离子交换法的分离步骤主要包括树脂的处理、装柱、平衡、加样、洗脱等步骤
45.沉淀法，沉淀法是历史最悠久的分离纯化方法，目前仍在工业上发挥着重大的作用。

氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。

沉淀法原理是根据某些氨基酸可以与某些有机或者无机化合物结合而形成沉淀，可以利用这种性质向溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸沉淀，与其他氨基酸分离，在分离后再将氨基酸与沉淀剂分离即可。

46.萃取法，萃取法主要包括反应萃取法、溶剂萃取法、反向微胶团萃取、液膜萃取法
等。

其中，反应萃取法是选择适当的萃取剂，使萃取剂解离出来的离子与氨基酸解离出来的离子发生反应，生成可以溶于有机相的物质，从而使氨基酸从水相进入有机相，进而分离氨基酸。

溶剂萃取法，由于氨基酸是离子型化合物，氨基酸在物理萃取时难以高效提取的，因此常用化学发来萃取氨基酸。

反向微胶团萃取的原理相对复杂，表面活性剂自发形成的纳米级的一种聚体，它的极性尾在外与非极性的有机溶剂接触，而极性头则排列在内形成极性核，极性核溶于水后就形成了特殊的“水池”，当含有氨基酸的水溶液与含反相微胶团的有机溶剂相混合时，氨基酸以带电离子状态进入反相微胶团的“水池”内或微胶团球粒的界面分子膜层内而被分离。

液膜萃取是将第三者液体辗成膜状，利用液膜的选择透过性，从而使目标产物透过半透膜进行分离，这是一种新型的氨基酸分离法，常用于乳酸液泡膜分离L-苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸。

47.电透析，由于氨基酸拥有不同的等电点，故可以通过控制溶液的PH值，使氨基酸
带有正负电荷，即当PH大于等电点时，带有负电荷，将氨基酸放置在电场中，会带上负电，并且移向正极，相反，PH值小于等电点时，则带上正电荷，氨基酸向负极移动。

电透析主要有毛细电透析等方法，通过这种方法可以高效而精确地分离氨基酸。

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49.简述纸上层析法分离氨基酸的关键步骤。

1、平衡：将展开剂（乙醇：水：冰乙酸＝50:10:1）放入培养皿中置于密闭容器内使其充满展开剂（24h左右）
2、点样：取滤纸1张用铅笔在距下方2cm处划线并将所得线段分成5等分从而得到4个标记点，用微量进样器分别取5μl下列样品①phe②lys③pro④混合Aa向4个标记点上加样（样品扩散中Ø≤1cm）
3、展层：将滤纸卷成筒状且不能够重叠，并用棉线扎紧然后垂直放入培养皿中进行展层2h （当展开剂沿到达滤纸长度三分之二时，即可取出）测量展开剂前沿移动距离（a）
4、显色：用%茚三酮-丙酮溶液朝点样面喷雾（不要喷得太多）然后将滤纸置于电炉上方20cm 处加热直至斑点出现为止，测量各斑点中心到点样点距离（b）
50.影响纸上层析法分离氨基酸的因素有哪些
①温度,层析液,样品的浓度等
②1. 物质结构对于Rf值的影响：极性物质易溶于极性溶剂(水)中，非极性物质易溶于
非极性溶剂(有机溶剂)中。

例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸。

所以前者在水(固定相)中分配较多，因此Rf值低于后者。

2. 溶质与溶剂间的相互作用对Rf值的影响：这种影响是由溶质与溶剂间的相互作用与分配系数的关系所决定的。

3. pH对Rf值的影响：这种影响主要是由pH与分配系数的关系所决定的。

弱酸与弱碱的解离度受pH影响很大，解离度越大，极性越强，极性强的物质在两相溶剂中分配时，偏向于极性强的一相，这样，改变pH就会同时改变分配系数，从而使Rf也会相应变化。

在氨基酸的层析法中，改变溶剂的pH，使酸性和碱性氨基酸的Rf值变动较大，而中性氨基酸的Rf值变动较小。

在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的极性降低，从而使Rf值变大，而使碱性氨基酸的Rf变小。

反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值变小，而使赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的Rf值变大。

4. 滤纸对Rf值的影响：滤纸本身的pH及含水量对Rf值的影响很大，所以不同的滤纸得到不同的Rf值及不同
的斑点形状。

纸上含水量的多少随溶剂与纸对水的亲和力的大小而异，质地不均一的滤纸常使溶剂扩展不一致，随着纤维的纹理流动紊乱，另一方面纸的含水量不均一，也不能得到理想的分离效果。

5. 温度对Rf值的影响：Rf值的重现性与恒温情况的好坏有密切关系。

温度对Rf值的影响主要是因为溶质在固体相与流动相之间的分配随温度的变化而不同。

随各溶剂组分的粘度和表面张力的不同其蒸发能力也不同，因此有些溶剂系统对温度的敏感程度强些，有些则差些。

敏感程度强的对温度的要求就严格，敏感程度差的对温度的要求就不太严格。

温度改变使溶剂系统中的溶解度改变，所以Rf值也改变。

一般层析展层是在恒温室中进行的，室温可在20℃至40℃，温度改变不超过±℃。

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51.试述凝胶层析法测定蛋白质分子量的实验原理。

聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子质量的方法，主要是根据各蛋白质组分的分子大小和形状以及所带净电荷多少等因素所造成的电泳迁移率的差别。

在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），使所有蛋白质颗粒表面覆盖一层SDS分子，导致蛋白质分子间原有的电荷差异消失，此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小。

当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈直线关系。

52.简述凝胶层析法测定蛋白质分子量的关键步骤。

1. 电泳槽的安装：取两块玻璃板→将带玻璃条的板（高板）放置桌面上→在上面放置“U”型橡胶条→最后将凹槽玻璃板（低板）压在高板上，置于电泳槽内，用锲子压紧。

2. 凝胶液的制备与灌装：配置20ml凝胶液：在小烧杯中依次加入5ml 30%凝胶储液，10ml PH 凝胶缓冲液，2ml 1%TEMED，重蒸水，10%过硫酸铵混匀→立即沿高板内侧倒凝胶液于两板之间直至低板上沿→插上梳子放置15min，待胶凝后取下“U”条→重新将胶板放置于电泳槽内→向外槽内加三分之一槽深电极缓冲液→向内槽加入电极缓冲液没过低板→最后拔出梳子。

3. 加样：用微量进样器加入7μl标准蛋白于中间胶槽内→其余槽内加入7μl下列样品①牛血清蛋白②绿豆分离蛋白
4. 电泳：连接电极线，高板外侧接正极，低板内侧槽接负极，打开电源→调电流120mA→
电泳2h（当指示剂前沿超过二分之一胶长时停止）
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5. 剥胶：取下胶板倒去电极缓冲液→量取指示剂迁移距离和染色剂的前胶长，然后将胶板置于水龙头下方冲玻板四周直至胶与玻璃板分离
6. 染色与固定：将胶板放入染色盒内→向其中加入%考马斯亮蓝R250使其浸没置于摇床上染色过夜
7. 脱色：用10%乙酸溶液脱色至谱带清晰，测定脱色后胶长及各谱带迁移距离。

53.写出凝胶层析法测定蛋白质分子量的公式并说明各符号的含义。

54.说明离心机使用时应注意的事项。

1 离心机要放在平坦和结实的地面或实验台上，不允许倾斜；
2 通常离心机都会有登记表，请在使用前确实登记使用者、转头、转速、时间；
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3 离心管一定要用天平平衡重量（重量平衡），盖上离心管盖子并旋紧；
4 把平衡好的离心管对称地放入离心陀中（位置平衡），盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧；
5 完成离心时，要等待离心机自动停止，不允许用手或其他物件迫使离心机停转，待转头完全静止后，才能打开舱门，请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置，尽速把上清倒出，小心不要把沉淀弄混浊。

6离心机套管底部要垫棉花或试管垫。