62EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法)
PCR法检测EBV
PCR法检测EBV引言EBV（Epstein-Barr virus）是一种常见的人类疱疹病毒，普遍存在于全球人群中。
EBV感染与多种疾病的发展相关，包括传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤和鼻咽癌等。
PCR（聚合酶链反应）是一种敏感且特异性极高的检测方法，用于检测EBV感染。
PCR法原理PCR法利用DNA聚合酶扩增特定DNA序列，从而在病毒感染的样本中检测出EBV的存在。
PCR法主要包括以下步骤：1. 样本提取：从病患的体液或组织中提取DNA，如血液、唾液或淋巴组织。
2. DNA扩增：在PCR反应中加入EBV特定的引物（primers），使其与EBV的DNA序列特异性结合。
然后通过多个温度循环，DNA聚合酶将引物延伸，并复制出多个EBV DNA片段。
3. 凝胶电泳：将PCR反应产物分离出来，并通过凝胶电泳分析，确定是否存在EBV DNA片段。
PCR法的优势PCR法检测EBV具有以下优势：- 高灵敏度：PCR法可以检测极低浓度的EBV DNA，即使在感染初期也能被发现。
- 高特异性：PCR法使用特定的引物，能够准确识别和扩增EBV的DNA序列。
- 快速：PCR法的实验操作相对简单，且可以在几小时内快速获得结果。
结论PCR法是一种可靠且广泛应用于EBV检测的方法。
通过扩增EBV的DNA序列并进行分离分析，可以准确判断EBV感染的存在与程度。
在临床诊断和疾病监测中，PCR法的高灵敏度和特异性使其成为一种重要的工具。
> 注意：以上内容仅供参考，本文档中所述的检测方法和原理只用于简要介绍PCR法检测EBV，具体的实验操作和分析过程请参考相关文献和标准操作流程。
人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序
人民医院基因扩增实验室EB病毒核酸定量检测标准操作程序1 项目名称单纯疱疹病毒Ⅱ型核酸定量检测2 检验方法名称TaqMan荧光定量检测3 方法学原理用一对EB病毒特异性引物和一条EB病毒特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。
探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。
每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。
被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。
4 标本要求4.1 适用标本类型：全血。
4.2 标本采集a ) 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5～10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
5 试剂5.1 试剂名称：EB病毒病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）5.2 生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；5.3 试剂货号：#DA-B065；5.4 包装规格：20人份/盒；5.5 试剂成份：5.6 试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。
6 仪器ABI 7500全自动基因扩增检测仪7 操作步骤7.1 DNA提取7.1.1 阴性质控品处理a ) 取出阴性质控品，8,000rpm离心数秒，吸50μl至0.5ml灭菌离心管中，加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；b ) 12000r/min离心5min，备用。
7.1.2 标本处理7.1.2.1 全血a ) 取全血1ml至干燥玻璃试管中，加入生理盐水1ml轻摇混匀；b ) 取干燥玻璃试管卷入500µl淋巴细胞分离液；c ) 将稀释好的全血用加样枪缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中（注意沿管壁，速度要慢）；d ) 2000rpm离心20min；e ) 吸取白细胞层（从上而下的第二层），加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；12,000 rpm离心5分钟；f ) 去上清，沉淀中加入50μl DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；g ) 12000r/min离心5min，备用。
核酸检验操作规程
核酸检验操作规程一、引言核酸检验是一种常用的生物化学分析方法，广泛应用于医学、生物学和病毒学等领域。
为了保证核酸检验的准确性和可靠性，制定核酸检验操作规程是必要的。
本文档旨在规范核酸检验操作流程，确保实验的一致性和可重复性。
二、实验前准备1.检查实验室仪器和设备的情况，确保正常工作。
2.检查实验所需试剂和材料的存量，及时补充。
3.准备相关资料和记录表格，如实验记录表和生物废弃物处理记录表。
4.实验人员需佩戴个人防护装备，包括实验服、手套、口罩和护目镜。
三、核酸样本处理1.根据实验要求，选择合适的样本类型，如血液、组织或细胞。
2.从样本中提取核酸，可以使用商用核酸提取试剂盒或自行制备提取缓冲液。
3.操作前，检查提取试剂盒或提取缓冲液的有效期和保存条件，确保试剂的质量。
4.按照提取试剂盒的说明书或提取缓冲液的制备方法进行提取操作，遵循每一步的操作要求和时间控制。
5.注意避免污染，使用新鲜的一次性操作工具和试剂管，避免手指直接接触样本。
四、核酸质量检测1.提取后的核酸需要进行质量检测，常用方法包括浓度检测和纯度检测。
2.浓度检测可使用分光光度计测量核酸的吸光度，并根据标准曲线计算浓度值。
3.纯度检测常用比值检测法，包括260/280比值和260/230比值，分别用于检测蛋白质和污染物的存在。
4.检测结果需记录在实验记录表中，并进行相应分析和评估。
五、核酸扩增1.根据实验设计选择合适的扩增方法，如聚合酶链反应（PCR）或逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。
2.准备扩增反应体系，包括DNA模板、引物、酶和缓冲液等。
3.按照反应体系的配比和引物扩增温度等参数进行扩增反应，严格控制反应时间和温度。
4.同时设置阳性对照和阴性对照，用于确定扩增结果的可靠性。
5.扩增后的产物可以进行凝胶电泳分析或实时荧光定量分析。
六、实验后处理1.实验后，关闭仪器和设备。
2.将实验产生的生物废弃物进行规范处理，包括核酸废弃物和一次性器材。
EB病毒感染实验室检测方法
EB病毒感染实验室检测方法摘要本文档详细描述了EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的实验室检测方法，包括病毒培养、血清学检测、核酸扩增和病毒载量测定等。
这些检测方法在临床诊断、流行病学研究以及疫苗研发等领域具有重要意义。
1. 病毒培养1.1 原理EBV属于疱疹病毒科，是一种专性细胞内寄生的DNA病毒。
病毒培养可以充分展示病毒的感染性、复制能力和生物学特性。
1.2 方法1. 选择合适的细胞系，如B95-8或Daudi细胞。
2. 将临床样本（如唾液、血液等）接种至细胞系。
3. 在适宜的条件下（如37°C、5% CO2）培养细胞，观察病毒复制和感染现象。
4. 定期观察细胞病变，如细胞增大、核固缩等。
5. 采用免疫荧光染色、电子显微镜等方法检测病毒颗粒。
2. 血清学检测2.1 原理血清学检测基于病毒感染后诱导的免疫反应，通过检测特异性抗体来诊断EBV感染。
2.2 方法1. 收集患者血清样本。
2. 使用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测EBV特异性抗体，如VCA-IgM、VCA-IgG、EA-IgG等。
3. 采用免疫荧光染色、免疫组化等方法进行抗体检测。
4. 根据抗体类型和滴度判断感染状态，如急性感染、慢性感染或回忆性感染。
3. 核酸扩增3.1 原理核酸扩增技术通过特异性引物和DNA聚合酶酶链反应（PCR）来检测EBV的DNA序列。
3.2 方法1. 提取临床样本的DNA。
2. 设计针对EBV DNA的特异性引物，进行巢式PCR或实时定量PCR（qPCR）。
3. 扩增EBV特异性基因，如EBNA1、EBNA2、LMP1等。
4. 分析扩增产物，判断病毒感染情况。
4. 病毒载量测定4.1 原理病毒载量测定通过检测病毒颗粒的数量来评估病毒感染的程度。
4.2 方法1. 提取临床样本的病毒颗粒。
2. 采用实时定量PCR、定量荧光显微镜等方法测定病毒载量。
3. 根据病毒载量判断感染程度，为临床治疗提供依据。
欧蒙ebv标准操作规程
欧蒙ebv标准操作规程欧蒙公司提供了一系列关于EBV（Epstein-Barr Virus，EB病毒）检测的标准操作规程，其中包括酶联免疫吸附法（ELISA）和间接免疫荧光技术（IIFT）等不同的检测方法。
这些操作规程旨在帮助实验室人员准确地进行EBV相关的血清学检测和核酸检测。
以酶联免疫吸附法为例，操作步骤通常包括：1. 样本处理：将待测的人血清或血浆按照规定的稀释比例进行稀释。
2. 加样：将稀释后的样本与包被有EBV抗原的微孔板混合，然后进行孵育。
3. 洗涤：使用洗涤液彻底清洗微孔板，去除未结合的物质。
4. 加二抗：向微孔板中加入标记有酶的第二抗体，再次孵育。
5. 洗涤：重复第3步的洗涤过程。
6. 显色：加入底物溶液，使之在酶的作用下发生反应，产生颜色变化。
7. 终止反应：通过加入终止液停止显色反应。
8. 结果判定：使用酶标仪测定每个微孔的吸光度，根据标准曲线判断样品中EBV抗体的含量。
另一种检测方法IIFT（间接免疫荧光技术）的基本步骤如下：1. 取材制片：采用适当的方法获取含有EBV抗原的细胞涂片。
2. 封闭：使用封闭液覆盖涂片，减少非特异性结合。
3. 加一抗：滴加已知的EBV特异性抗体，让其与细胞中的抗原结合。
4. 洗涤：使用缓冲液清洗涂片，去除未结合的一抗。
5. 加二抗：滴加标记有荧光素的第二抗体，使其与一抗结合。
6. 洗涤：再次清洗涂片，去除未结合的二抗。
7. 干燥：让涂片晾干。
8. 镜检：使用荧光显微镜观察涂片，根据荧光强度和模式判断样品中EBV抗体的存在情况。
以上只是简略介绍了两种EBV检测方法的基本操作步骤。
实际操作中，还需严格遵守各项安全规范和质量控制措施，确保检测结果的准确性和可靠性。
具体操作时，建议仔细阅读并遵循由欧蒙公司提供的详细标准操作规程。
1150817303EB病毒核酸定量检测试剂盒（PCR荧光法）说明书
EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)说明书【产品名称】EB病毒核酸定量检测试剂盒(PCR荧光法)【包装规格】 32人份/盒【预期用途】本产品用于定量检测人全血中的EB病毒核酸。
EB病毒是人类的一种特异性嗜淋巴细胞性疱疹病毒，EB病毒在人群中具有广泛的感染性，主要通过人类唾液传播，也可经输血传染。
现在的研究表明与EB病毒的感染有关的疾病主要为传染性单核细胞增多症。
适应症：由EB病毒感染引起的传染性单核细胞增多症。
【检验原理】本试剂盒选用EB病毒保守基因片段设计特异引物及特异Taqman 探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3’端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对EB病毒核酸的自动化检测。
【主要组成成份】组成组成成分规 格核酸提取液10×红细胞裂解液EB反应混合液Taq酶EB强阳性对照EB临界阳性对照阴性对照定量标准品1#（1.0-8.0）×104copies/ml 定量标准品2#（1.0-8.0）×105copies/ml 定量标准品3#（1.0-8.0）×106copies/ml 定量标准品4#（1.0-8.0）×107copies/ml 含0.5%Triton-100、5%Chelex-100含NH4Cl、NaHCO3、EDTA-Na2含Tris-HCl、 KCl、MgCl2、 dNTP、引物、荧光探针含Taq DNA 酶及抗体含EB病毒基因组DNA(重组克隆)含EB病毒基因组DNA(重组克隆)含TE缓冲液含EB病毒基因组DNA(重组克隆)1.8ml×15 ml×11.2ml×114ul×1100ul×1100ul×1100ul×120ul×120ul×120ul×120ul×1注： 不同批号试剂盒中各组份不可以互换。
PCR实验检测标准操作规范
PCR检测实验室操作规范一、PCR实验室的设置及管理i•目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。
2•适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。
3•负责人：4.细则：4. 1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。
4. 2本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。
每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。
标本的接收则在检验科标本接收处进行。
4. 3各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。
4. 4各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP文件。
4. 5严格遵守从“试剂准备区T标本处理区T扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。
4. 6非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。
4. 7实验完毕后做好清洁消毒工作。
1、PCR实验室工作制度1.目的：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。
2.适用范围：所有本实验室人员。
3.负责人：4.细则：4. 1本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。
4. 2各区的用品不得混用。
4. 3在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。
4. 4试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP文件）。
4. 5标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成（见相关SOP文件）。
核酸检测的操作规程
核酸检测的操作规程核酸检测的操作规程一、实验室准备1. 确保实验室设备正常运行并处于良好状态，包括核酸提取仪、PCR仪、离心机等。
2. 准备所需试剂和材料，包括核酸提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 检查并清洁实验台面及仪器表面，以确保无任何污染。
4. 佩戴防护装备，包括实验帽、实验服、手套等，以防止实验过程中的交叉污染。
5. 核对每个样本的信息，确保准确无误。
二、核酸提取1. 提取样本之前，将样本转移到符合规定的安全实验室。
2. 根据试剂和设备的说明书，进行核酸提取。
将样本加入提取试剂中，充分混合。
3. 使用离心机进行离心分离，离心条件按照试剂盒的要求。
4. 将提取的核酸样品转移至干燥的离心管中，保存在低温条件下，避免冻融。
三、逆转录1. 准备逆转录反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将核酸样品与逆转录反应液混合，反应温度和时间按照试剂盒要求进行设置。
3. 使用逆转录仪进行反应，注意反应过程中温度的稳定。
4. 反应结束后，检查反应液的外观，确保反应成功。
四、PCR扩增1. 准备PCR反应液，按照试剂盒说明书中的配方比例配制。
2. 将逆转录反应液与PCR反应液混合，充分混合。
3. 设定PCR仪的温度曲线和扩增时间，确保参数设置正确。
4. 在PCR扩增结束后，进行凝胶电泳检测，检查扩增产物的数量和大小。
五、结果分析和记录1. 根据凝胶电泳的结果，判定扩增产物是否存在。
2. 根据扩增产物的大小和带电泳率，判断所检测的目标基因是否存在。
3. 记录检测结果，包括样本编号、核酸提取情况、逆转录情况、PCR扩增结果等。
4. 输送结果至指定的部门或仪器进行最终结果分析和报告生成。
六、实验后处理1. 清洗实验台面和仪器设备，以确保无任何污染。
2. 妥善处理实验过程中产生的废液和废弃物，按照规定的程序进行处理。
3. 对实验室设备进行常规的维护和保养，以确保正常运行。
以上是核酸检测的操作规程，通过严格的操作流程和规范的实验室操作，可以确保核酸检测的准确性和可靠性，提供有效的数据支持。
核酸检测pcr操作流程
核酸检测pcr操作流程核酸检测是一种常用的生物学实验技术，其中PCR（聚合酶链式反应）是其中一种重要的操作流程。
PCR是一种体外的DNA复制技术，通过PCR可以在短时间内扩增出目标DNA片段，从而进行检测和分析。
首先，进行核酸检测需要准备样本，通常是从患者的唾液、血液或其他体液中提取DNA或RNA。
提取的核酸样本需要经过纯化和浓缩处理，以保证PCR反应的准确性和灵敏度。
接下来，准备PCR反应体系。
PCR反应需要包括目标DNA或RNA 样本、引物（primer）、核酸酶、缓冲液、dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）和聚合酶等成分。
引物是PCR反应的关键，它们是用来引导DNA复制的短链DNA片段，必须与目标DNA序列互补。
然后，进行PCR反应。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR反应体系加热至高温（通常为94-98摄氏度），使DNA双链解旋成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至引物的退火温度，使引物与目标DNA序列结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至适合聚合酶活性的温度（通常为72摄氏度），使聚合酶沿着引物复制目标DNA序列。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析和检测。
凝胶电泳可以将PCR产物按照大小分离出来，从而确定目标DNA片段是否扩增成功。
实时荧光定量PCR可以实时监测PCR反应的进程，从而准确测定目标DNA或RNA的数量。
总的来说，核酸检测的PCR操作流程包括样本准备、PCR反应体系准备、PCR反应和PCR产物分析等步骤。
通过PCR技术，可以快速、准确地检测出目标DNA或RNA序列，为疾病诊断、基因分析等领域提供重要的实验支持。
62-EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法)
EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。
2.应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。
3.职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容4.1 实验原理及其临床应用本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB 病毒（EBV）DNA。
用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，4.2 标本采集4.2.1 使用标本类型：全血。
4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
标本运送采用0℃冰壶。
4.3 试剂准备4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。
核酸检测实验的操作规范和流程
核酸检测实验的操作规范和流程本文档旨在规范核酸检测实验的操作步骤，确保实验进行的准确、可靠和安全。
请根据以下流程进行操作。
实验前准备1. 确保工作台面干净整洁，并备齐所需的实验器材。
2. 检查实验器材的完整性和消毒情况。
3. 将试剂室保持洁净，并检查试剂的标签和有效期。
4. 穿戴实验室服装和个人防护装备，包括实验手套、防护眼镜和口罩。
核酸提取1. 取样前，将样本标识清晰地写在试管上，并确保与记录一致。
2. 使用无菌技术，使用专用取样器具采集样本，并放入已标识的试管中。
3. 使用适当的提取试剂盒，按照说明书的要求进行样本提取。
注意遵守实验室的安全操作规程。
核酸扩增1. 将样本提取后的核酸溶液，按照扩增试剂盒说明书的要求，加入扩增试剂反应体系。
2. 启动扩增仪器，设置好反应条件，如温度、时间等。
3. 按照试剂盒要求，制备必要的阴性对照和阳性对照。
4. 将样品、对照和负控物分别加入扩增试剂反应体系中，注意控制反应体系的杂交和污染风险。
PCR产物分析1. 终止扩增反应后，将PCR产物置于4°C冰上保存。
2. 使用凝胶电泳或其他适当的分析方法，对PCR产物进行分析验证。
确保正确的扩增结果，并评估目标基因的存在与否。
结果解读1. 根据PCR产物分析结果，判断目标基因的存在与否。
2. 结果解读应结合实验目的，结合相关样本信息，进行科学合理的判断和分析。
实验后清理1. 将使用过的试剂瓶、试管和其他实验器材分类清理，并正确处理。
2. 清洗工作台面，保持实验环境整洁。
3. 按照实验室废物管理规定，进行废物处理。
以上是核酸检测实验的操作规范和流程，请按照要求严格执行，确保实验结果的准确性和可靠性。
EB病毒PCR定量检测ppt课件
二十世纪末被国际抗癌联盟列为Ⅰ类致癌物
3
二、 EB病毒相关疾病
肿瘤性疾病 Burkitt’s lymphoma 伯基特淋巴瘤 （地方性，
100%） Hodgkin’s lymphoma霍奇金淋巴瘤（40%） Nasopharyngeal carcinoma鼻咽癌（地方性，
7
四、血浆EB病毒DNA水平与肿瘤负荷 -----术后监控
Clin Cancer Res. 2003 Aug 15;9(9):3254-9.
8
四、血浆EB病毒DNA水平与肿瘤负荷 ------复发监控
复发监控
N Engl J Med. 2004 Jun 10;350(24):2461-70.
9
OS vs Plasma EBV DNA
100%） Gastric carcinoma胃癌（10%） 非肿瘤性疾病 Infectious mononucleosis传染性单核细胞增多
症（100%）
4
三、EB病毒与鼻咽癌
鼻咽癌（NPC）属于地方性肿瘤，约80%的患者 分布于中国华南地区及东南亚地区，发病率约为 20-30/100 000人,广东省的发病率最高,又称“广东 瘤”
Head Neck. 2012 Aug;34(8):1064-70
10
五、上市产品情况
公司
类型 灵敏度 线性范围
样品类型
之江生物 定性
全血
样本用量
艾康生物 定量 普瑞康生物 定量
100IU/ml
全血 血清或血浆
圣湘生物 定量
400拷贝/毫升 4.0×102~4.0×109
核酸检验操作规程制度范本
核酸检验操作规程制度范本一、总则为了确保核酸检验工作的准确性和可靠性，规范核酸检验操作流程，提高检验质量，根据国家相关法律法规和标准，制定本操作规程。
本规程适用于本实验室开展的所有核酸检验项目。
二、仪器与试剂1. 仪器：核酸提取仪、核酸扩增仪、实时荧光定量PCR仪、生物安全柜、离心机、核酸定量仪等。
2. 试剂：包括核酸提取试剂、核酸扩增试剂、内标、阴性对照、阳性对照等，均应符合国家相关标准和规定。
三、操作流程1. 样本接收与预处理（1）接收样本时，应检查样本的完整性、采集时间、保存条件等，确保符合要求。
（2）对样本进行预处理，如核酸提取、RNA/DNA转换等，操作过程中应严格遵守相关试剂盒说明书。
2. 核酸提取与扩增（1）按照提取试剂盒说明书操作，进行核酸提取，确保提取效率和纯度。
（2）将提取的核酸进行扩增，包括常规PCR、实时荧光定量PCR等，操作过程中应遵循扩增试剂盒说明书。
3. 结果分析与判定（1）根据扩增曲线、Ct值等数据，分析判断样本是否为目的基因阳性。
（2）对于可疑结果，应进行复检，确保结果的准确性。
4. 质量控制（1）定期进行室内质控，包括阴性对照、阳性对照、样本等，评估检测系统的稳定性。
（2）参加室间质评，与其他实验室进行结果比对，确保检验结果的准确性。
四、生物安全与废弃物处理1. 操作过程中应严格遵守生物安全相关规定，佩戴必要的防护用品，防止交叉污染和人员暴露。
2. 核酸检验废弃物，如试剂盒、离心管、吸头等，应按照生物危险废物处理规定进行处理。
五、记录与追溯1. 操作过程中应做好详细记录，包括样本信息、操作步骤、仪器参数、结果判定等。
2. 记录应真实、准确、完整，便于追溯和质量控制。
六、人员培训与考核1. 从事核酸检验工作人员应具备相应的专业知识和技能，并进行培训。
2. 定期对工作人员进行考核，确保其掌握操作规程和生物安全知识。
七、持续改进1. 定期对操作规程进行 review 和 update，根据实际工作需要和国内外相关标准更新。
荧光pcr检测操作流程
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PCR实验检测标准操作规范
PCR检测实验室操作规范一、PCR 实验室的设置及管理1．目的：建立实验室的合理设置和科学管理，防止实验污染，保证检测结果的可靠性。
2．适用范围：本程序适用于分子诊断室的设置、工作流程和日常管理等。
3．负责人：4．细则：4．1流感实验室为急传所的专业实验室，从事临床标本的基因扩增检测及相关科研工作等。
4．2 本实验室采用实时荧光定量（定性）PCR 技术作为病毒基因诊断的主要手段，实验室分为三个区：试剂准备区（第一区）、标本处理区（第二区）、扩增分析区（第三区）。
每一工作区配备专用的设备、仪器、辅助设施、耗材、清洁用品、办公用品、专用工作服，并有明显的区分标识。
标本的接收则在检验科标本接收处进行。
4．3 各工作区专用的仪器设备、办公用品、工作服、实验耗材和清洁用具等，不可混用。
4．4 各工作区配置、功能和内务管理见各相关SOP 文件。
4．5 严格遵守从“试剂准备区→标本处理区→扩增分析区”的单一流向制度，不得逆向进入前一工作区。
4．6 非本实验室工作人员，未经许可不得入内；进修、实习或其他科室人员因科研活动需要，进入实验区域（试剂准备区、标本处理区、扩增分析区）需首先熟悉本程序的各项规定并严格遵守执行，在本实验室人员监督指导下进行。
4．7 实验完毕后做好清洁消毒工作。
二、PCR 实验室工作制度1．目的：保持良好的工作环境，以确保检测结果的可靠性，防止交叉污染，防止差错、事故及纠纷的发生。
2．适用范围：所有本实验室人员。
3．负责人：4．细则：4．1 本实验室进行临床基因扩增检测及相关实验工作，不得进行其它实验操作。
4．2 各区的用品不得混用。
4．3 在各区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程。
4．4 试剂准备区只能进行试剂的贮存及配制等相关操作（见相关SOP 文件）。
4．5 标本处理区只能进行临床标本的保存，核酸提取、保存及其加入至扩增反应管和测定RNA 时cDNA 的合成（见相关SOP 文件）。
荧光定量PCR操作规程(组织)
附录1第一步：RNA的提取材料：灭菌过的枪头、匀浆器、EP管、去离子水；TRIzol Reagent、三氯甲烷、异丙醇、、无水乙醇、离心机。
步骤：1）将大约100mg组织加入研磨器，加入1ml的TRLzol Rengent研磨20-30min；直到看不到大块的组织。
2）将液体倒入灭菌后的EP管内，加三氯甲烷250 μl，上下颠倒充分混匀，静置5min，4℃离心，13000×g，10min。
3）取上清液500 μl于另一灭菌过的EP管内，加入等量的异丙醇，混匀后放入4℃的冰箱15min后取出，4℃离心，13000×g，10min；倾倒出上面的液体，留在管底的白色沉淀即为RNA。
5）加入75%的乙醇1ml，4℃离心，7500×g，5min。
6）将上面的液体倒出，只剩白色沉淀；再瞬时离心，尽量吸干管内的液体，晾干，再加入适量的去离子水加以溶解。
第二步逆转录准备材料：逆转录试剂盒（TOYOBO，日本）反应体系：5×RT Buffer 4 μldNTP 2 μlOliga(dT)20 1 μlRNase free H2O 1μlRnase inhibitor 1μlReverTra Ace 1μlRNA 10μl总体系20μl 反应条件：42℃20min95℃5min4℃5min第三步Real-time PCR材料：SYBR Green mix（TOYOBO公司，日本）、上下游引物、cDNA、ddH2O 步骤：1、反应体系SYBR Green mix 12.5μlPlus solution 2.5μl上游引物（10pmol/μl）1μl下游引物（10pmol/μl）1μlddH2O 5.5μlcDNA（10倍稀释） 2.5μl总体系25μl2、反应条件50℃2min；95℃2min95℃15s Array退火15s72℃45s72℃10min；3. 扩增程序图：。
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EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程（荧光PCR法）1.目的规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。
2.应用范围使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。
3.职责由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容4.1 实验原理及其临床应用本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。
用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，4.2 标本采集4.2.1 使用标本类型：全血。
4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。
标本运送采用0℃冰壶。
4.3 试剂准备4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。
8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000 rpm离心5分钟，备用。
4.5.1.2 样本处理4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000rpm离心5分钟，上清备用。
4.5.2.1 加样：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
4.5.3 PCR扩增将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）×40 cyclics；EBV检测荧光素：FAM; 反应体系：50ul；荧光信号收集：55℃-45ses，末端收集。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。
打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。
如果不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。
(绿色)则说明卤钨灯已经打开；（黄色）则说明卤钨灯正在预热；（红色）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。
在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿色）。
4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。
4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard（标准品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。
对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。
方法为：点击，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。
也可以直接点击标准品的各个孔位，在一栏，手工输入浓度。
若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。
或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。
4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。
在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。
要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。
如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。
点击，导入以前设定的PCR程序。
（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。
可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。
若要去除，可将其拖出循环设定区域。
4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。
会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。
在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。
还可以选择勾选“Turnlamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。
4.5.3.10 PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。
可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。
点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。
左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。
右边的可根据自己的需要选择显示的界面。
是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。
4.5.3.11 分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。
点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序；2.每次程序中的循环数应该一致。
在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。
4.5.3.15 分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。
阳性质控品：EBV（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增长曲线。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。
4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。
4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。
4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。
4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：。
4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。
4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。
4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。
4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。
4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。
4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增加或者减少实验项目类型，通过右边的孔位选择，设置不同项目的区域，然后点击“Apply”保存。
4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选择“Abs Quant”；Step 2处，编辑标准品及样本。
4.5.4.12 标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反应孔，然后选择右侧的模板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type”选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。