实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌快速检测中的应用

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实时荧光PCR在食源性致病菌食物中毒应急处置中的应用

ｇｅｔｈｅｒ．Ｖｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍ０ｌｙｔｉｃｕｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｅｉｇｈｔｐａｔｉｅｎｔａｎｄｔｈｒｅｅｆｏｏｄ—ｓａｍｐｌｅｓｏｕｔｏｆｔｈｉｒｔｙ—ｓｉｘｓａｍｐｌｅｓｂｙｒｅａｌ —ｔｉｍｅｌｆｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰＣＲａｎｄｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｕｈｕｒｅｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｓｅｒｏｔｙｐｅｏｆ１１ｓｔｒａｉｎｓｏｆｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｗａｓ０３：Ｋ６．Ｃｏｎ－ｃｌｕｓｉｏｎＴｈｉｓｃａｓｅｏｆｆｏｏｄｐｏｉｓｏｎｉｎｇｗａｓｃａｕｓｅｄｂｙｖｉｂｒｉｏｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄｆｒｏｍｒａｗｉｆｓｈｔｏｃｏｏｋｅｄ—
ｐｏｉｓｏｎｉｎｇｃａｕｓｅｄｂｙｆｏｏｄ—ｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ．ＭｅｔｈｏｄｓＡｃｃｏｒｄｉｎｇＦｉｅｌｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙｓｔｕｄｙｆｏｒｏｎｅｃａｓｅｏｆｆｏｏｄｐｏｉｓｏｎｉｎｇ，

实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用

实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种精确、快速的检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。

本文将讨论实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用，并介绍其原理和优势。

一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术基于传统的PCR原理，通过不断复制并扩增DNA片段，然后采用荧光信号检测系统实时监测PCR过程中的DNA合成数量。

在PCR过程中，引物与靶DNA片段结合并引发DNA合成，同时荧光探针与靶DNA片段结合释放出荧光信号。

荧光信号量与靶DNA的初始数量成正比，通过实时监测荧光信号的强度，可以实时定量测量靶DNA的含量。

二、实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用1. 快速检测细菌的存在：实时荧光定量PCR技术可以在较短的时间内检测出细菌的存在与数量。

传统的培养方法需要一定的时间来培养细菌，而实时PCR技术几乎可以立即提供结果，帮助及时采取相应的措施。

2. 检测细菌的耐药性：实时荧光定量PCR技术可以检测出细菌对抗生素的耐药性。

通过检测细菌的特定基因或突变，可以判断其对不同抗生素的敏感性，为合理使用抗生素提供指导。

3. 检测细菌的毒力：实时荧光定量PCR技术可以检测细菌的毒力相关基因，帮助研究人员判断细菌的致病能力。

4. 监测细菌感染动态：由于实时PCR技术具有快速、准确等优势，可以用于监测细菌感染的动态变化。

在临床诊断中，可以通过实时PCR技术监测患者体内细菌的数量变化，从而评估治疗效果。

三、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR技术可以检测到非常低浓度的细菌。

在样品中只存在几个细菌时，也能够准确检测出来。

2. 高特异性：实时荧光定量PCR技术通过特异性引物和探针的设计，可确保只扩增目标细菌的DNA片段，并排除其他DNA的干扰。

3. 高准确性：实时PCR技术通过实时监测PCR过程中的荧光信号，可以快速、准确地确定细菌的存在与数量。

实时荧光定量PCR在细菌性食源性疾病中的应用

Ｏｏｙｏｅｅ）是李斯特菌属的一个种，由于该菌具有耐热（０（）、耐ｎｃｔｇｎｓ６＂２低温（＂、耐化学试剂、易交叉污染等特性，很难消除［０。近年４Ｃ）１］来，单增李斯特菌引起的食源性疾病暴发频繁，引起了国际上的高度关注和广泛重视。闫冰等以单核细胞增多性李斯特菌的必要毒力基因ｈｙ为目ｌＡ的基因，设计引物和Ｔｑａ探针进行Ｒ－Ｃ检测。结果表明，所用引物和ａＭｎＴＰＲ探针能较好的扩增目的基因，而对其他食源性致病菌无交叉反应，此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查［１。１］７）空肠弯曲菌。空肠弯曲菌（ａｐｌｂｃｅｊｊｎ）是一种重要的ｃｍｙｏａｔｒｅｕｉ人兽共患病病原体在发展中国家，该菌是引起婴幼儿感染性腹泻最常见的病原菌；在某些发达国家，该菌作为急性腹泻的致病菌甚至超过了沙门菌与志贺菌［２。沈小明等以其保守区域设计特异性引物与探针建立了基１］于Ｔｑａ探针的Ｒ－Ｃ技术，特异性好、敏感性高、能够稳定地对空肠弯ａＭｎＴＰＲ曲菌进行定性、定量分析检测，在检验、疾病控制等领域将有广泛的应用
前景［３。１］
从而实现对起始模板的定量及定性分析。Ｒ— Ｃ根据其化学原理可分为两ＴＰＲ类：一类为双链ＤＡ异的荧光染料，常用的是ＳＢＧｅｎＩ；第二类为荧Ｎ特ＹＲｒｅ

PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用

PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用作者：余慧来源：《食品界》2018年第10期迄今为止，食源性致病微生物引起的中毒事件屡屡发生，也一直是困扰世界各地的食品安全问题之一，这不仅与致病性微生物本身的特性有关，同时更与致病性微生物的检测方法相关。

传统的致病性微生物检验步骤是前/增菌培养、分离纯化培养、形态学鉴定、生理生化鉴定及血清学鉴定，这个过程手续繁琐、需时较长、不能满足人们要求。

此时，PCR （Polymerase Chain Reaction）技术以灵敏度高、特异性强和时效高等特点凸显其优势，为各种有针对性致病微生物快速检测提供了技术支持。

本文将从近年来PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用来展开论述。

国内食源性致病微生物检测技术现状目前，国内大部分标准采用的是传统方法，它是提供高重复性、国内外公认的方法，也是用于解决纠纷的标准方法，但其缺点也显而易见，近年来，商检行业标准率先采用PCR技术应用到食源性致病菌的检测中来，例如《SN/T1870- 2016出口食品中食源性致病菌检测方法实时荧光PCR法》采用的是实时荧光PCR技术；《GB4789.6- 2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验》的国家强制性标准中首次明确应用到了PCR技术。

这些标准的实施给外界释放出一个信号——PCR技术越来越广泛的在食源性致病菌中得到应用，也是未来食品微生物检测发展的主要趋势。

PCR技术在食源性致病微微生物检测中的应用PCR技术。

（1）PCR技术的原理、特点及应用。

PCR技术即聚合酶链式反应技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

PCR经过十多年的发展与应用，现已成为生命科学领域最常用的PCR技术之一。

PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，针对性强，配备预先设定特定程序的PCR仪，操作简单，快捷、准确性高。

蔡亦红等通过设计1对特异性引物，优化PCR扩增条件，建立了快速、稳定的检测福氏志贺菌的PCR方法，能够快速的实现对食品中的志贺菌的诊断和监控。

PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用

综上所述，PCR技术在食源性病原微生物检测中发挥重要作用。然而，为了进一步提高PCR技术的准确性和可靠性以及降低检测成本，还需要开展更多的研究工作。未来的研究方向应包括优化PCR反应条件和引物设计方法，发展多重PCR技术和其他联用技术以提高检测效率，以及研究新的DNA测序技术以获得更准确的检测结果。随着科学技术的发展和人们食品安全意识的提高，相信PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用将越来越广泛。
四、技术原理
四、技术原理
食源性病原微生物快速检测技术的主要原理是核酸探针杂交和生物芯片技术。核酸检测法是一种基于基因组DNA的检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点，可快速筛查出目标病原微生物。生物芯片技术则可将多个核酸检测反应集成在一张芯片上，实现高通量、高效率的检测。此外，还有一些新型的快速检测技术，如基于免疫磁分离技术和荧光定量PCR的联合方法等。
PCR技术在食源性病原微生物检测中的应用
01 引言
目录
02
食源性病原微生物感染的危害
03 PCR技术原理和应用
04 结论
05 参考内容
引言
引言
食源性病原微生物是指通过食物传播的病原体，包括细菌、病毒、寄生虫等多种微生物。这些微生物在食物中繁殖，可能导致人类食物中毒、传染病爆发等问题，对人类健康和公共卫生安全构成严重威胁。为了确保食品安全，食源性病原微生物的检测技术显得尤为重要。近年来，聚合酶链式反应（PCR）技术因其高灵敏度、高特异性等优点，在食源性病原微生物检测中发挥越来越重要的作用。
参考内容
内容摘要
随着食品安全意识的不断提高，食源性病原微生物的检测技术也日益受到。本次演示将介绍食源性病原微生物快速检测技术的核心主题、引入关键词、背景介绍、技术原理、应用发展以及结论与建议。

PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用

现代食品/XIANDAISHIPIN 21PCR 技术在快速检测食源性致病菌中的作用The Role of PCR Technology in Rapid Detection of Foodborne Pathogenic Bacteria◎ 庄　璐（金华市食品药品检验检测研究院，浙江　金华　321000）Zhuang　Lu(Jinhua Inspection and Research Institute for Food and Drug Control, Jinhua　321000, China)摘　要：现阶段，我国正以飞快的速度发展，食品微生物检测也由传统的培养方法向分子水平过渡。

通过对聚合酶链式反应（PCR）技术的研究分析可知，可以利用这种先进的快速检测技术来检验食品中的食源性致病菌，本文归纳总结了几种不同的PCR 技术，旨在提供一些关于食品微生物的快速监测技术。

关键词：PCR 技术；食源性致病菌；检测；应用Abstract：China is developing at a fast pace and the detection of food microorganisms is also moving from the traditional cultivation method to the molecular level. Based on the polymerase chain reaction (PCR) for certain research analysis, can be verified in food borne pathogens using rapid detection technology which is advanced, this paper summarizes several different PCR technology, aims to provide some food on microbial monitoring technology.Key words：PCR technology; Foodborne pathogenic bacteria; Detection; Application 中图分类号：R155.5改革开放以来，我国现代科学技术以惊人的速度发展，人们的生活水平也在逐渐提高，最直接的结果就是人们越来越重视食品，有着越来越高的要求，但近年来，食品安全问题一直威胁着人们的生命健康，这一问题已经受到了人类的高度重视。

荧光定量PCR检测食源性致病菌的应用探讨

础上发展起来一种新的核酸定量技术，即实时荧光定
量ＰＲ技术（ｅｌｔｕｒｓｅｔｕｎｉｔｅＣ）Ｃｒａ—ｉｆｏｅｃｎｑａｔａｖＲ。ｍｅｌｔｉＰ自２世纪９年代由美国Ｐ司提出实时ＰＲ检测０ＯＥ公Ｃ
光基团染料和受体荧光基团染料。外来光源激发供
能量传递探针）和分子信标（ｏｃｌｅｏ）Ｍｌｕｒａｎ等ｅａＢｃ
荧光探针。
ＦＴ探针是罗氏的专利，又称双杂交探针，在ＥＲ
上游探针的３端标记供体荧光基团，下游探针的５端标记受体荧光基团。在ＰＲＣ退火阶段，通过荧光能量共振传递（ｕｒｃｎｅｅｎｃｅｅｙｒｓｒｌｅｅｓｎｇｔｎｅｆｏｓｃｒｏａｅｎｒａｆ，ＦＴ）ＥＲ检测受体荧光基团发出的荧光。检测信号是
所激发的荧光信号；随着ＰＲ的进行，ａ酶链延伸ＣＴｑ
中遇到与模板结合的探针，其５一３外切酶活性就会切割探针，荧光监测系统就可接收到荧光信号，即每扩增一条ＤＡ，就有一个荧光分子形成，实Ｎ链现了荧光信号的累积与ＰＲＣ产物形成完全同步。近年来，Ｔｑａ探针有了更新的发席ＴｑｎＭＧａＭｎ－ａＭａＢ
及的Ｔｑａ探针外还有ＦＥａＭｎＲＴ杂交探针（荧光共振
食源性致病菌检测提供了特异性强、灵敏度高、操作简便的检测技术平台，其准确、快速的优点尤为
突出。一些食物中毒样本如呕吐物、粪便可在２～３小时出检测结果。因此在过去的１年里，它已成为Ｏ微生物学诊断最强有力的工具。国内外的许多大学和研究机构对食源性主要监

定量PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用_杜巍

定量ＰＣＲ技术在食源性致病微生物检测中的应用杜巍（国家信息中心博士后科研工作站，北京１０００４５）摘要：食源性致病微生物是影响食品质量和安全的主要因素之一，建立和完善食品中致病微生物快速定量检测技术具有重要的现实意义。

定量ＰＣＲ能快速、敏感、特异而准确定量，深入有效地利用该技术，必将有力促进食源性致病微生物快速检测工作的发展。

关键词：定量ＰＣＲ；致病微生物；快速检测Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｎ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｑ－ＰＣＲ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＦｏｏｄｂｏｒｎｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍＤＵＷｅｉ（Ｓｔａｔｅ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００４５，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｗａｓ　ｏｎｅ　ｏｆｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｔｈａｔ　ｃｏｕｌｄ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｓａｆｅｔｙ　ｏｆｆｏｏｄ．　Ｉｔ　ｗａｓ　ｂｅｅｎ　ｏｆ　ｒｅａｌｉｓｔｉｃ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｓｈｏｕｌｄ　ｂｅｄｅｓｉｇｎｅｄ　ａｎｄ　ｃｏｓｕｍｍａｔｅｄ．　Ｑ－ＰＣＲ　ｗａｓ　ｒａｐｉｄ，　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　，　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ａｃｃｕｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．　Ｉｆ　ｉｔ　ｃｏｕｌｄｂｅ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｕｔｉｌｉｚｅｄ，　ｔｈｅ　ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ　ｗｏｕｌｄ　ｍａｋｅ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｑ－ＰＣＲ）；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ；ｒａｐｉｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ中图分类号：Ｑ８１９文献标识码：Ａ文章编号：１００２－６６３０（２００６）０４－０２６０－０４由沙门氏菌、弯曲菌、大肠埃希氏杆菌、李斯特菌等食源性致病微生物引发的食品污染，是影响食品质量和安全的主要因素之一。

PCR技术在快速检测食源性致病菌中的应用

ＰＣＲ技术在快速检测食源性致西南宁市邕宁区疾病预防控制中心，广西南宁５３０２９９Ｅ—ｍａｉｌ：５２４４１７７４７＠ｑｑ．ｃｏｎ）ｒ
摘要：食品污染引起的疾病是目前世界上公共卫生问题之一，食源性致病菌是食物中毒和食源性疾病暴发的重要因素，是食品安全的重要风险隐患。如何快速准确检测食源性致病菌是控制食物中毒和食源性疾病暴发的关键环节。笔者介绍并分析ＰＣＲ技术在食源性致病菌快速检测中的应用。
随着生活水平的提高，食品安全问题受到人们越来越多的重视，已经成为社会关注的热点之一。据世界卫生组织（ＷＨＯ）统计，２００５年世界范围内有１５０万人死于腹泻等疾病，其中有７Ｏ为食源性因素造成＿１］。在我国食源性疾病暴发事件中，微生物性食物中毒的暴发事件数和患者数最多，占总数的４ｏ．ｏ９和６１．９２ｌ＿２］，食源性微生物是导致食源性疾病的主要原因。传统的检测方法繁琐复杂、周期较长，不能实现有
要前提。ＰＣＲ技术即聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）是

实时荧光定量PCR技术在食源性细菌检测中的应用效果评价

ｑａｔｔｅｅｓａｓｎｉｎｙｉｅｔｎａｔｉｕｕｅｄｈｎｒｅｅｃｏｓ（ｕｎｔｉＲａａｗｓｉｉｃｔｇｒａｃｒｃｌｒａｅｅｅＰＲｄｔｔｎｓｙＰ＜０５【ｏｃｓｎｉｖＰａｓｙｇｆａｌｈｈｂｅａｔｔｇａｈｌｎｌｅｉａａ．）Ｃｎｌｉ】０．ｕｏ
ＰＲ技术阳性检出率９．％。实时荧光定量ＰＲ检测法阳性检出率显著高于细菌培养检测法和普通ＰＲ检测法，比较均有ｅ０１ｅｅ相
显著性差异（＜．）【Ｐ０５。结论】０实时定量荧光定量ＰＲｅ技术准确、快速、简便、特异性强，在食源性细菌检测中，能为突发食源性
摘要：【目的】探讨应用实时荧光定量ＰＲｅ技术在食源性细菌检测中应用效果。方法】【分别应用细菌培养法，ｅ检测法，ＰＲ实
时荧光定量ＰＲ方法对９７ｅ８例群体食源性食物中毒腹泻患者和疑似患者的粪便或呕吐物２８份样品进行食源性病原体检０４
测。结果】【检测２８个感染性腹泻标本，０４细菌培养法阳性检出率４．普通ＰＲ检测法阳性检出率６．采用实时荧光５％，２ｅ３％；４
【ｅｏｓＧｒｉｈｒｐｌｅｓｃａａｔｎＰＲａｄｅ —ｍｕｒｃｃｑａｔａｖｅｃｎｌｅｅｔｔＭｔｄ】ｅｃｕ，ｏｍｒｅｈｉｒｃｏ（ｅ）ｎａｔｅｏｓｎｅｕｎｔｉＰＲｔｈｏｇｗｒｕｄｏｅｃｈｍｕｅｙａｎｅｉｒｉｆｅｅｌｌｉｔｅｅｏｙｅｓｔｄｅ

实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用

ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＲｅａｌ－ｔｉｍｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｆｏｒｔｈｅ
ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＦｏｏｄ－ｂｏｒｎｅＰａｔｈｏｇｅｎｉｃＢａｃｔｅｒｉａ
３．ＦｏｏｄＳａｆｅｔｙＫｅｙＬａｂｏｆＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＪｉｎｚｈｏｕＬｉａｏｎｉｎｇ１２１０１３，Ｃｈｉｎａ；
．
Ｅｎ￣ｎｅｅｎｎｇａｎｄＴｅｃｈｏｌｎｏｇｙＲｅｓｅｒｃａｈＣｅｎ￣ｒｆＦｏｏｏｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｒｏＰｃｅｓｓｉｎｇｎｄａＳａｆｅｔｙＣｏｎｔｒｏｌｆｏＬｉａｏｎｉｎｇｒｏＰｖｉｃｅｎ
２．ＣｏｌｌｅｇｅｆｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＣｈｅｍｉｃａｌＥ，
ｅ
ａｎｄＦｏｏｄＳａｆｅｔｙ，ＢｏｈａｉＵｎｗｅｍ，ＪｉｎｚｈｏｕＬｉａｏｎｉｎｇ１２１０１３，Ｃｈｉｎａ；
ＬＶＹａｎ－ｆａｎｇ，ＭＡＣｈｕｎ－ｙｉｎｇ，ＵＪｉａｎ — ｒｏｎｇ（Ｊ．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，ＢｏｈａｉＵｎｗｅｍ，ＪｉｎｚｈｏｕＬｉａｏｎｉｎｇ１２１０１３，Ｃｈｉｎａ；

PCR技术在食源性致病菌检测中的应用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｗｉｔｈｈｅｔｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。ｍｉｃｒｏｂｉｌａｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｉｎｆｏｏｄｉＳｂｙｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ
ｍｅｈｏｔｄｓｔｏｈｅｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌｇｒａｄｕａｌｌｙ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｆｏｄｂｏｏｍｅｐａｔｈｏｇｅｎｓｂｙｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ
文章编号：１６７１ — ９６４６（２０１４）０６ａ一００４５ — ０３
ＰＣＲ技术在食源性致病菌检测中的应用
赵小珍，武婷，张书敏
０３０００６）（山西省分析科学研究院，山西太原
摘要：科技发展日新月异，食品中微生物检测方法正在由传统的培养方法逐渐向分子水平迈进。通过分析利用聚合酶链式反应技术（ＰＣＲ）检测食源性致病菌的先进技术，对几种不同的ＰＣＲ技术研究进展进行归纳总结，旨在为食品微生物的快速检测提供参考。
ｔｅｃｈｎｏｌｏｙ（ｇＰＣＲ）ｉＳｉｎｔｒｄｕｏｃｅｄ．ＡｎｄｓｅｖｅｒｌａｄｉｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｄｓｏｏｆＰＣＲｔｅｃｈｎｏｌｏｙｇａｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅＦｅｎｃｅｆｏｒ

实时荧光定量PCR技术在食品检验中的应用

■食品技rr^Tiw 【利描术研究实时荧光定量PCR 技术在食品检验中的应用□李秋阳姚瑶北京出入境检验检疫局摘要：实时荧光定量PCR 技术是基于定性PCR 技术而形成的一种核酸定量技术，这种技术能够达到定量DNA 模板的效果，同时，灵敏度比较高，具有准确性、特异性强等特性。

本文先分析了实时焚光定量PCR 技术基本原理，接着具体阐述了食品检验中实时焚光定量PCR 技术的应用情况。

希望通过此次研究不断优化及完善实时焚光定量PCR 技术，使其更好地用于食品检验工作当中。

关键词：实时焚光定量；PCR 技术；食品检验在PCR 指数扩增过程中，借助强弱不同的连续监测荧光信号及时测定异性产物量，将此作为依据，测出目的基因拷贝数。

定量PCR 技术从产生开始至逐步完善，不再是最初的单一染料法，演变成特异性比较高的Fret、Taq m an 等探针法，随着 Taq m an 探针广泛使用，这种方法也被称为实时定量PCR 的方法。

1实时荧光定量P C R 技术基本原理PCR 反应循环次数越来越多，反应中生成的DNA 拷贝数呈指数级增长, 且逐步转入平台期，在此期间，实时荧光定量PCR 动态检测整体PCR 反应流程，不断分析及扩增有关荧光信号，紧随反应动态测出荧光信号变化，通这电脑自动绘制成_条曲线，以检测指数期特定点PCR 产物量，经过推断，得出模板最初含量[1]。

荧光阈值将PCR 反应开始前循环荧光信号前15 个用作荧光本底信号，通常超过荧光阈值检测到的荧光信号是一个值得信赖的信号，将其作为定义样本C t 值，也就是在PCR 循环时，各反应管中荧光信号至指定阈值过程中需要经历的循环数。

从研究情况看，各模板C t 值和该模板起始拷贝数是一种线性的关系，具体来说是一种对数线性关系，起始拷贝数与C t 值呈反比。

根据已经得知的起始拷贝数的标准样品便能绘制出标准曲线，所以，仅需要得到未知样品Ct 值, 便能算出样品的起始拷贝数。

22151301_实时荧光定量_PCR_在食品致病菌检测中的应用

食品科技数据显示，全球每年大约有超过50万人死于食物中毒，约6 000万人出现腹泻。

微生物食物中毒的发生率逐年攀升。

因此，进一步完善微生物检测手段，提升检测效率与准确性是当前的主要发展方向。

传统检测方法中，需要对细菌进行分离、培养与鉴定，整个过程耗费的时间比较长，准确性也不高，而实时荧光定量PCR技术因具备高效、快速，且准确性高等优势，被广泛应用于食品致病菌检测中。

实时荧光定量PCR技术在传统PCR反应过程中加入荧光基团，持续监测荧光信号的变化情况，并将获得的基因初始量和已知量进行对比，从而完成实时荧光定量。

与传统PCR相比，有了质的飞跃，从定性到定量，灵敏度、速度以及准确性方面都显著提升。

1　金黄色葡萄球菌的检测金黄色葡萄球菌是导致食物中毒的一种致病菌，人畜都可能会被感染，感染症状以局部感染、脑膜炎、肺炎等化脓性感染为主，严重危害人们的身体健康。

与传统检测方法相比，实时荧光定量PCR技术具有明显的优势。

根据金黄色葡萄球菌基因序列设计引物与探针，采用基因重组技术建立实时荧光定量PCR方法以及金黄色葡萄球菌重组质粒标准品即可进行检测。

李丹丹[1]建立了快速检测黄色葡萄球菌的实时荧光定量PCR方法，并对样品进行了检测，其阳性率和国标法基本一致，具有很高的特异性与灵敏度。

随着技术的快速更新与完善，人们用于检测的手段和方法也会越来越高效化。

2　沙门菌的检测沙门菌是一种常见的致病菌，其主要是通过食品或污染水等渠道感染人类与动物，会造成胃肠炎、败血症、伤寒等相关疾病。

传统检测方法通常需要4-7 d的时间，需要耗费大量的时间与精力。

通过荧光定量PCR方法扩增沙门菌的基因片段，可高效准确的对其进行检测，其整体特异性是非常强的。

曹冬梅[2]根据伤寒沙门菌的基因序列设计引物与探针，对伤寒沙门菌进行了全面的检测与分析，且有效鉴定出了绝大多数的伤寒沙门菌，所检测的结果与传统方法检测结果一致。

相关学者通过实时荧光定量PCR快速检测沙门菌，所需时间较短，检测速度大幅度提升，同时检测精准性与质量也有了明显的改善[3]。

PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用

PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用
庄璐
【期刊名称】《粮食流通技术》
【年(卷),期】2017(005)009
【摘要】现阶段,我国正以飞快的速度发展,食品微生物检测也由传统的培养方法向分子水平过渡.通过对聚合酶链式反应(PCR)技术的研究分析可知,可以利用这种先进的快速检测技术来检验食品中的食源性致病菌,本文归纳总结了几种不同的PCR 技术,旨在提供一些关于食品微生物的快速监测技术.
【总页数】2页(P21-22)
【作者】庄璐
【作者单位】金华市食品药品检验检测研究院,浙江金华321000
【正文语种】中文
【中图分类】R155.5
【相关文献】
1.实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用 [J], 李敏;綦国红
2.PCR技术在快速检测食源性致病菌中的作用 [J], 庄璐;
3.PCR技术在快速检测食源性致病菌中的应用 [J], 何维凤
4.多重PCR技术在快速检测食源性致病菌中的研究进展 [J], 于世成
5.食源性致病菌检测中PCR技术的应用 [J], 何军霞;田香红
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定量PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用

定量PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用赵君剑【摘要】食源性疾病发病率的提高及食品安全问题对人们健康造成的危害,引起世界范围内加强对食品安全、卫生及质量的关注.通过聚合酶链反应(PCR)技术在食源性致病微生物检测中的应用,提高了检测的有效性,PCR技术的发展也经历了多个发展阶段,即常规PCR检测、多重PCR检测、荧光定量PCR检测阶段.本文主要对荧光定量PCR检测技术进行分析,探讨定量PCR技术在食源性致病微生物检测中的应用.【期刊名称】《甘肃科技》【年(卷),期】2017(033)003【总页数】2页(P76-77)【关键词】食源性致病微生物检测;聚合酶链反应;荧光定量PCR【作者】赵君剑【作者单位】甘肃省文县疾病预防控制中心,甘肃文县 746400【正文语种】中文【中图分类】G633.91实时荧光定量PCR（Real-timePCR）是在传统PCR技术应用基础上发展的核酸定量技术。

RealtimePCR技术具有准确性高、特异性强、灵敏度高、误差小、操作简单、可定量检测等特点，在应用中产物扩增及检测闭管均一步完成，减少交叉污染、环境污染几率，在目前食源性致病菌检测工作中应用较广泛。

较常规PCR及多重PCR技术相比，Real-time PCR技术在一定程度上对化学原理进行改进，RealtimePCR技术可直接通过电脑软件实现在线实时监测PCR扩增，直接获得最终检测结果，无需再次对扩增产物进行检测，有效避免污染，因此认为RealtimePCR技术具有灵敏度高、特异性好、环保等特点。

Real-timePCR技术主要指在常规PCR应用基础上增加荧光标记探针或荧光染料来达到其特定功能。

荧光标记探针在Real-timePCR技术中应用的原理为，使用PCR扩增时需加入一对引物，同时加入特异性荧光探针，该探针是寡核苷酸，即探针两端分别为报告荧光基团与猝灭荧光基团，检测后若探针保持完整，报告基团发射出的荧光信号会被猝灭基团吸收，检测开始前期探针与DNA任意单链结合，当PCR扩增时Taq酶外切酶活性将探针酶切有效讲解，导致报告荧光基团与猝灭荧光基团分离，借助荧光检测系统可直接接收到荧光信号，DNA链每扩增一条，就形成一个荧光分子，实现荧光信号与PCR产物的同步，荧光信号强度比例加大[1]。

实时荧光定量PCR技术在食源性致病菌检测中的应用

Ｍａｎ探针法为６ｎｕｃ基因拷贝数／¨Ｌ。Ａｌａｒｃｏｎ等凹１进一步确认了这两种方法的检测水平可降低至１００和１０个细胞水平。若联合使用ＴａｑＭａｎ—ＭＧＢ探针，可降低本底信号强度，且可检测仅有单核苷酸差异的等位基因的表达水平。Ｐｒｏｄｕ等。１０。研究了浮选法、基质增溶和免疫磁性分离等样品前处理法对实验结果的影响，发现浮选法和基质增溶均允许在１—１０个细胞／ｍＬ水平上进行定量检测，均比平板接种法检测出更多的细菌细胞当量（ＢＣＥ），免疫磁性分离法制备的样品具有较高的特异性。２．２对大肠杆菌０１５７：Ｈ７的检测大肠杆菌０１５７：Ｈ７作为一种新型的食源性致病菌具有强致病性。常规培养法操作繁琐，检测周期长。目前，主要以大肠杆菌０１５７：Ｈ７的帕Ｅ、ｕｉｄＡ、ｅａｅ、ｓｔｘｌ、ｓｔｘ２基因作为靶基因，建立实时荧光定量ＰＣＲ法。李军等。１１。Ｆｌｉｃ（Ｈ７）基因序列进行同源性比较分析，选取保守序列设计特异性扩增引物，最低检测限为１０３ｃｆｕ／ｍＬ，特异性明显增强，对非大肠杆菌０１５７：Ｈ７血清型细菌、猪链球菌２型、副猪嗜血杆菌均无反应，重复性检测的变异系数小于２％。Ｗｅａｇａｎｔ等。１２。免疫磁性分离技术处理样品，检测限降至０．２ｃｆｕ／ｇ，有效避免漏检。Ｌｅｅ等ｎ纠用皂土包被的活性炭除去可能存在的ＰＣＲ抑制剂，最低检出限从１× １０３ｃｆｕ／ｇ降低至５ｃｆｕ／ｇ。Ｅｌｉｚａｑｕｔｖｅｌ等。１４３用叠氮溴化丙锭（ＰＭＡ）对样品前处理。由于ＰＡＭ可以透过死菌的细胞膜和胞内的ＤＮＡ形成共价碳氮键，对死菌ＤＮＡ在ＰＣＲ扩增时起到抑制作用，可避免假阳性结果产生。Ｄｉｎｕ等。１５。研究了ＰＭＡ—ｑＰＣＲ法、酶联免疫法在检测静止期（ＶＢＮＣ）的大肠杆菌０１５７：Ｈ７的差异。结果表明，使用ＰＭＡ—ｑＰＣＲ法检测结果与活菌显微镜计数法检测结果一致，而用酶联免疫法无法准确测定静止期细胞。２．３对沙门氏菌的检测传统的沙门氏菌检测需经过前增菌、选择性增菌、平板分离、生化试验和血清学鉴定等步骤，准备和收尾工作繁重，耗时长。以试剂盒或分子生物学方法提取细菌总ＤＮＡ作为模板的检测方法，操作复杂，成本高。目前主要以沙门氏菌的ｉｎｖＡ基因、ｓｓａＮ基因作为靶基

荧光定量PCR技术在检测食源性疾病与食品安全中的应用

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Vaitilingom等应用 RQ-PCR方法在 DNA抽提出3 h后检测出含2 pg的基因修饰物质或1 g待测样品中的基因组DNA，并在已确认的代表性食物产品中检测出“Maximizer” 玉米和“Roundup Ready” 大豆的含量。袁磊等 [16]将 RQ-PCR和基因组步移法相结合，建立起一套完整的定量检测抗虫抗除草剂玉
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物只扩增乳酸杆菌种。赵敏等以gyrB(促旋酶的
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刘雨果，等. 荧光定量PCR技术在检测食源性疾病与食品安全中的应用
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B亚单位)基因为靶目标扩增短乳酸杆菌，可快速鉴定从啤酒中分离到的短乳酸杆菌，而对其他乳酸杆菌均无扩增信号，进而克服了以16S rDNA为靶目标导致的假阳性，保障了实验结果的可靠性。 3.3 食品中转基因的检测
伴随转基因食品商品化开放规模的增大，许多国家对转基因产品制定了标准制度，对生物产品中含有的转基因成分的含量规定了上限，这要求定量检测技术要有更高的准确性和灵敏度。 RQ-PCR是目前能够满足这一要求的较为有效的检测方法。该方法可以定性检测是否为转基因产品，也可检测多组分的食品、饲料等加工产品中转基因成分的含量，并可鉴定转基因产品的品系。
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等根据细菌16S rDNA序列的特点，设计合成了针对啤酒污染的乳酸杆菌引物。对于致病菌而言，其毒力是由多基因决定的，如溶血素基因、内化素基
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广东医学院学报
2011 年第 29 卷
因，因此常从毒力基因中选择合适片段作为克隆杂交分析的引物和探针。 2.2 转基因产品检测中的引物设计
1 RQ-PCR技术的原理和特点