ELISA试剂盒问题总结

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影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法

标试剂的批号是否相同，不同批号试剂不得混用。
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问题4：质控品灵敏度偏高。
处理意见：卫生部临检中心的质控品存在批间批内差异。实验室相关条件改变导致质控变化，
看阳性对照品是否有明显变化。
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问题5：多次实验灵敏度一直偏低。处理意见：A保存环境不规范。
B孵箱温度不足。 C温育时间不足。
(3)孵育过程中出现的问题
1.温箱孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底； 2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合，难以清洗彻底。 3.孵育时温度不符合说明书的规定范围。
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(4)洗板过程中易出现的几点情况
1.采用手工洗板,孔与孔之间液体容易交叉，切不可随意洗板。
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处理意见：D假阳性标本表现在临界值附近较多，通常与当时实验的水平有关，注意检查实验条件的波动。 E避免加样时间过长。 F由于试剂盒灵敏度过高而造成
临床假阳性偏高的结果。
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问题8：多次实验重复性差。处理意见：A加样后充分混均。
B尽可能使用同一加样器，装紧枪头。
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问题6：单次实验中出现假阳性处理意见：注意实验过程中的影响因素，特
别是实验中的洗板应设置浸泡 30---60秒时间。
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问题7：临床实验中出现假阳性偏高。
处理意见：A注意检查洗涤液中结晶部份是否完全溶解。
B注意检查实验中所使用的仪器设备是否定期校准。
C注意检查实验中所用的板、酶标试剂的批号是否相同，不同批号试剂不得混用。

ELISA 出现的问题及解决方法

ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。

2.试剂失效。

3.试剂过失效日期。

4.试剂开启时间过长，污染。

5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。

6.反应时间不足。

7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。

1.控制室温并确保试剂回至室温。

2.与我公司联系。

3.更换新批号的试剂盒。

4.试剂开启后尽快用完。

5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。

移液不宜过快，排放应完全。

吸头内壁要清洁，最好一次性使用。

6.准确计时。

7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。

9.样品添加了防腐剂，抑制了酶的反应8.测定蒸馏水配剂对酶联免疫的影响9.样品中不能添加防腐剂2整行或整列板孔最终反应产生颜色深，无梯度10.手工洗板时相对应的吸头与移液器接触不严，导致未吸上洗涤用水或吸上的水量不够。

11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。

10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。

如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。

曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。

11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。

3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。

洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。

12.注意加洗涤水的移液器吸头尖必须置于微孔板上方约1厘米处打出洗涤水，绝对避免注入板孔中的液体接触到或溅到移液器管尖上而将板孔线对比13.加完酶标记物之后的洗板机洗板步骤失败。

洗涤次数不够及注水量不够。

14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。

15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。

中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。

ELISA常见问题

1、ELISA试验的稳定性问题做ELISA实验时，结果老是重复性不上，相同的材料和相同的操作方法做出的结果就截然不同，上午做时其OD在1.5，下午做时就是0.9了，所以都没有办法下结论，为什么会差异这么大呀？（1）多设平行空孔，请别人代劳，以判断究竟是否操作问题（2）对于活性非常高的包被物和酶标记物，如果第一次选择的范围恰好在其平台位置边缘，那么在重复的时候，每次取样带来的微量误差就很容易导致大的偏差了，特别是线性比较好的原料试剂，这个就很正常了。

建议每次取样的时候只使枪尖一点点位于液面下，以免吸嘴外面沾有少量抗原or抗体or酶而使结果重复不上。

2、酶不稳定，有何高招？（1）保存浓度尽量高些，（2）另外可以添加牛血清白蛋白等蛋白保护剂，以避免其被吸附或沉降以及被蛋白酶所降解。

（3）加入50%甘油-20度保存、避免反复冻融。

（4）还可以加入防腐剂防止长菌（注意不能用叠氮钠，其对HRP活性有很大影响）（5）现在一些公司也有商品化的酶标保护剂供应，可以考虑一下酶类的稳定性与保存方法的很大关系。

干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可。

液态稳定性较差，贮藏时应注意以下几点：1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易降解、变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。

此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。

3、贮藏温度要求低，避免反复冻融。

3、ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？做夹心法ELISA试验中不加标本的OD值反而高于加人的阴性标本的OD值，是什么原因呀？最大的原因是封闭的效果不好，应该调整封闭液；可以尝试不同的封闭剂（BSA、胶脂奶粉、明胶等）、不同的封闭浓度、时间，试试哪个效果好阴性的里面的其他蛋白起到了封闭的效果4、边缘的阴性OD值老是比中间的偏高，什么原因呢？我做ELISA时，有一段时间在板的最后一条板孔的阴性的OD值经常比在中间的高，有时候高出0.1个OD，导致实验经常重复，但原因也找不到在哪里？这可能是由于ELISA的边缘效应造成的。

ELISA 出现的问题及解决方法

ELISA试剂盒可能出现的问题及解决方法问题及现象原因解决办法1整块板最终反应未产生颜色或整体吸光度值偏低1.室温过低或试剂未回至室温。

2.试剂失效。

3.试剂过失效日期。

4.试剂开启时间过长，污染。

5.移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸头内壁挂液太多或者内壁不清洁。

6.反应时间不足。

7.洗涤时冲击力太大，洗涤液浸泡时间太长，洗涤次数增加。

1.控制室温并确保试剂回至室温。

2.与我公司联系。

3.更换新批号的试剂盒。

4.试剂开启后尽快用完。

5.校正移液器，吸头要配套，每次装吸头要吻合紧密。

移液不宜过快，排放应完全。

吸头内壁要清洁，最好一次性使用。

6.准确计时。

7.减少洗涤冲击力，按说明书要求浸泡时间，准确记住洗涤次数8.蒸馏水水质有问题。

11.洗板机洗板时相对应的管路阻塞，导致未注入洗涤用水或水量不够。

10.洗板前检查吸头是否接牢固，是否高矮一致并且在一条直线上。

如果在安装吸头时感觉不易安装牢固请不要使用。

曾发现过有的国内厂商的吸头不直，不易安装牢固，请不要使用，避免造成实验失败。

11.检查管路是否阻塞，出水不畅并疏通，检查注水量是否充分。

3标准曲线不成良好的S型，请与盒中的质检报告曲12.加完酶标记物之后的手工洗板步骤失败。

洗涤用水被板孔中游离的酶标记物污染。

洗涤次数不够及注水量不够。

14.洗板后未立即进行下一步操作，中间间隔过长。

15.当板孔中含有两种以上的试剂时未能充分混均。

中游离的酶标记物带回到洗涤用水中。

ELISA实验可能出现的问题及原因分析

ELISA实验可能出现的问题及原因分析1.应该注意试剂4°c冷藏时水化层形成，蛋白分子分布异常；2.标本由于冷藏时Ig G聚合成多聚体，Fib非特异性吸附，反复冻融机械切力致使蛋白分子受损；3.加样时不准，枪头吸样时插入样本液面下2mm为宜；4.常采用的温度有43、37°c、室温、或者4°c等。

37°c最常用，4°c效果最好，但孵育时间有异；5.要注意内源如风湿因子，补体，高浓度非特异性免疫球蛋白，异嗜性抗体及某些自身抗体等；外源如标本溶血，细菌污染，储存时间过长及凝固等因素影响。

6、在使用ELISA试剂盒时应注意：2-8℃保存（特殊情况除外）、同一品种不同批号试剂不能混用、不同品种试剂盒显色剂不能混用。

常见问题及分析1阳性对照不显色漏加阳性对照阳性对照孔忘加酶或忘加显色剂阳性对照受污染2、阳性对照显色浅（HBeAb HBcAb阴性对照显色浅）试剂和保存不当、活性下降在使用前试剂盒未放置在室温平衡温育时间不够或孵育温度过低洗板浸泡时间过长、洗板次数过多使用不正确的洗液洗液中含有防腐剂同时残留量过多洗板后酶标板被干透读数时使用波长不正确滤光片不清洁或滤光片位置错误读数时酶标板放置位置错误阳性对照活性下降酶标失活3、阴性对照显色（HBeAb、HBcAB除外）实验过程受污染阴性对照污染酶滴在孔壁上4、整板不显色试剂和保存不当、已经失活忘记加酶、可检查滴瓶内酶量忘记加抗原或中和试剂忘记加显色剂A或显色剂B5、阳性对照读数不正常加入标本后未进行必要的混匀标本稀释错误加样量不正确冷冻标本未完全溶解混匀标本中含有防腐剂6、血清本底高试剂盒灵敏度高加样时使用同一枪头、交叉污染孵育时间过长或温度过高洗板次数不足，浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔洗板机管道中有霉菌生长洗液瓶混用洗板机洗板头阻塞或洗板机洗板头位置错误配置洗液的去离子水或蒸馏水被污染终止液浓度不够，没有充分混匀，或终止液被污染读数时酶标板底部有水蒸气凝结酶标仪偏差7、假阳性结果实验器具被污染血清中出现纤维蛋白凝集血清标本中出现过多的红细胞血浆标本处理不当标本中含有灰尘、颗粒或细菌等标本被反复冻融加标本后进行不正确的振荡沿孔壁上加入标本，加样后出现过多的气泡酶标滴加在孔壁上，洗板未洗净混用洗液或洗液稀释错误洗液瓶中、管道或配置洗液的水中有霉菌洗板次数不足或浸泡时间短洗板时洗液量少或残留量多洗板时洗液量过多、串孔读数时酶标板底部有水蒸气凝结洗液瓶、废液瓶混用读数过程中板孔中有气泡酶标仪偏差8、同一板内重复性差标本混匀不充分试剂混匀不充分标本与酶结合物混匀不充分加样技术差异加样器故障或加样器被污染加样时间过长导致孵育时间不同孵育器内部的温度不一致，造成酶标板孔间的孵育温度差异读数时酶标板孔间有气泡9、HCV血清本底高灵敏度高样本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本10、HIV阳性对照低误将阳性对照稀释阳性对照未混匀加液量不足11、HIV血清本底高标准变更，灵敏度提高标本稀释液加液量不足100ul枪头深入血清过深，致使外壁沾有血清导致加样偏多（>10ul）同一孔加了两次样本。

ELISA常见问题

ELISA常见问题Author:Elabscienceviews:2361. 产品有哪几种规格？可检测多少个样本？产品分为48T和96T两种规格。

每次实验的标准曲线一般设7个不同浓度，加上空白孔，标准曲线一共需要8个孔。

因此，一个48T试剂盒最多可以测定40个样本（不做重复且一次用完），一个96T试剂盒最多可以测定88个样本（不做重复且一次用完）。

可以根据实际样本数量和实验计划选择合适的产品规格。

2.48T和96T的试剂盒有哪些不同？48T和96T的试剂盒，每个孔的反应体系都是完全一样的。

不同的是试剂盒中各组分的规格，详见说明书。

3. 产品的稳定性如何？产品在研发前期已通过严格的稳定测试，发货前亦须通过检测并提供质检报告，在市场上深受广大客户的赞许！4.贵公司有没有酶活性检测的试剂盒？酶活力的测定实际上就是测定酶促反应的速率。

酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位来表示，单位是U/g或U/ml。

酶活力的测定方法：⑴测定完成一定量反应所需的时间，⑵测定单位时间内酶催化化学反应量。

主要通过产物的增加量或底物的减少量来测定。

常用的方法有：⑴分光光度法，⑵荧光法，⑶同位素测定法，⑷电化学法。

ELISA的方法一般是对可溶性抗原或抗体进行定性和定量的检测，所以酶活性是不能用ELISA来检测的。

5.一次ELISA实验需要多长时间？双抗体夹心ELISA法一次实验需要4-4.5小时，竞争ELISA法一次实验需要2-2.5小时。

6.血清样本如何处理？全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

7. 血浆样本如何处理？应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，于1000×g离心15分钟，仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8. 尿液样本如何处理？用无菌管收集。

elisa常见问题汇总

ELISA实验中常见的问题及解决方法如下：
加样误差：包括加样本及试剂量不准、孔间不一致。

解决方法包括校正移液器，吸嘴要配套，装吸嘴时要紧密；重复某一样品时，加样时间尽可能与上次接近；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。

温育时间或洗板不一致：导致显色底物孵育效果不佳。

解决方法包括检查时间是否一致；校正温育箱温度。

试剂问题：包括显色液变质或者试剂过期、试剂稀释有误，如加酶的浓度过高、蒸馏水受酶等污染。

解决方法包括检查试剂盒有效期；请按说明书所示稀释倍数配制；使用新鲜蒸馏水。

洗板问题：如果没有洗板机，需要注意洗板液添加后不要从孔中溢出，在加洗板液后，静置1-2min，甩干液体后，在吸水纸上大力拍干；重复三次。

封板膜使用不当：在孵育样品、检测抗体以及HRP酶标抗体时，都要盖好封板膜，减少挥发及污染几率。

每次使用后要更换新的封板膜。

未及时读数：加完终止液后，形成的黄色颜色会随着时间延长继续加深，建议在15 min内读数。

以上内容仅供参考，如果无法解决你的问题，建议咨询专业人士获取帮助。

ELISA试剂盒常见问题

1. 产品有哪几种规格？可检测多少个样本？产品规格为96T。

每次实验的标准曲线一般设7个不同浓度，加上空白孔，标准曲线一共需要8个孔。

因此，一个96T试剂盒最多可以测定88个样本（不做重复且一次用完）。

板条可拆卸，可满足您少量多次实验需求。

2. 产品的稳定性如何？产品在研发前期已通过严格的稳定测试，发货前亦须通过检测并提供质检报告，在市场上深受广大客户的赞许！3.一次ELISA实验需要多长时间？双抗体夹心ELISA法一次实验需要3.5-4小时，竞争ELISA法一次实验需要2-2.5小时。

4.血清样本如何处理？全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 血浆样本如何处理？建议选择EDTA或者柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，于1000×g离心15分钟，仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6.细胞上清液样本如何处理？检测分泌性的成份时，用无菌管收集。

离心20分钟左右（1000×g）。

仔细收集上清。

7.细胞裂解液样本如何处理？检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml 左右。

通过反复冻融或者超声破碎，以使细胞破坏并放出细胞内成份。

离心10分钟左右（5000×g）。

仔细收集上清。

保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8.组织样本如何处理？用预冷的PSB (0.01M,pH=7.4)冲洗组织，以去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。

将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样本对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。

推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。

为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。

ELISA试剂盒常见问题解答

ELISA试剂盒常见问题解答TOP1：标曲显色过强无明显梯度1、主要怀疑点：洗板不充分：1.1、机器洗版：确保机器设置的针头能吸干孔中液体，并且加液针头能加液大于350ul，加液针头没有被异物或者结晶盐堵住。

1.2、手动洗板，严格按照步骤，使用干净灭菌的枪头和加样槽，使用无氧化剂的吸水纸。

加350ul洗液，静置90秒，在吸水纸上拍干孔中液体后再加入下一步洗液或者试剂。

1.3、特别注意，在加入TMB前的洗板步骤极其重要，残留的HRP酶会直接导致TMB显色。

2、次要怀疑点：2.1、TMB 已经污染，检测TMB是否透明无色，如果偏蓝就是污染了。

2.2、检查配制洗液的水是否污染，要求使用的水是双蒸水，三蒸水或无离子水，水中的Fe3+,Cu3+,Co3+等过渡金属，以及HClO都会氧化TMB。

2.3、酶标板受潮，长霉，或者试剂过期。

2.4、环境污染，空气中有导致显色的物质或者粉尘。

Top2：显色较弱或不显色，没有说明书提供的数据阳性强可能原因分析：1、检查标准品是否受潮或者拿错2、检查试剂是否按照说明书中要求的保存条件保存，特别是浓缩检测抗体和浓缩SABC，如果放在-20度，融化后会严重影响其活性。

3、移液器是否校准，可以用去离子水较准移液器，1000ul=1.0g 100ul=0.1g 10ul=10mg4、37度培养箱是否校准温度（建议用水银温度计放入水杯中，平衡12小时以上进行测量）。

5、SABC工作液和TMB在孵育前进行37度平衡半小时。

6、未严格按照说明书纸质版提供的方法操作。

7、试剂盒过期。

Top3：复孔做的不好，CV值差异大可能原因分析：1、复孔OD450数值在0.5-2.5之间计算的偏差相对较小，小于0.5会由于操作误差导致计算的CV值偏高，复孔样品数量在5-10个最佳。

2、操作时按照标准动作进行加样，比如要求枪头不能碰触到孔壁内侧和底面，枪头尖部的残留液体可以触碰到液面，使之流入样品孔。

ELISA操作常见问题解决办法

ELISA操作常见问题解决办法ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。

但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。

引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。

下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。

1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。

因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。

一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。

2．试剂盒平衡试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温（约25℃），一般需在室温放置20～30分钟以上。

平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。

冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。

4．加样在现在的ELISA商品试剂盒中，必然有使用微量加样器加入样本的步骤。

注意的关键点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。

加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。

出现气泡则反应液界面有差异。

所以，有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。

5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。

ELISA检测中存在的问题及对策

影响试剂盒质量的因素
2．试剂盒的方法学设计双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
待测抗体
E E
酶标抗原
E
底物
显色
洗板
洗板
温育
E E
E
E E
E
固相抗原
影响试剂盒质量的因素
间接法测抗体（抗HCV、Tp)
待测抗体
E E E
酶标抗体
底物
显色
温育
E
E
洗板
洗板
E
E
E
E
固相抗原
影响试剂盒质量的因素
ELISA试剂的选用和质检
上海心语生物科技有限公司
影响试剂盒质量的因素试剂盒的选用试剂盒的质检方法目前试剂盒存在的问题
影响试剂盒质量的因素
1．原材料 (1)固相材料商品ELISA试剂盒中基本上都使用聚苯烯塑料微孔板，其对 ELISA 试剂盒的影响在于孔间的显色差异。 (2) 抗原 -- 自然抗原、合成抗原和基因重组抗原。纯度：纯度不高可致试剂盒的特异性不强。立体结构：合成抗原一般都是多肽抗原，缺乏完整抗原所具有的立体结构决定簇，用于相应的抗 HCV 和抗 HIV 抗体的检测有可能导致结合上述决定簇的抗体漏检。
双抗体夹心法测抗原-两步法
待测抗原
E E E
酶标抗体
底物
显色
固相抗体
E E
温育
温育
E
E
E
E
影响试剂盒质量的因素
双抗体夹心法测抗原-一步法
待测抗原
E E E
酶标抗体
底物
显色
固相抗体
E
E
E
E
E

ELISA常见问题及措施分析

样本不可使用NaN3。如有怀疑，可复检。
目测结果正常，但酶标仪读值偏低
读取吸光值时使用了错误的滤光片
TMB为底物时应在450nm波长读取吸光值，并以650nm作为校正波长。
标准曲线不佳 /重复性不好
结果描述
可能的原因
建议或预防措施
严格按照说明书标准品配制进行
标准品配制有误
终止后，整
除去残余的缓冲液。
板结果显现孵育时间过长
严格按照说明书操作。
均一的黄色或淡黄色；或标曲有线
酶标记物污染了吸头及盛放显色剂容器或阳性对照污染了微孔
吸取不同的试剂时应更换吸头，配置不同的试剂组分时，应使用不同的储液器皿。操作时请使用移液器。
性但背景过
高
检测抗体或Avidin-HRP的浓检查浓度计算是否正确或进一步
加液时，过多残留于孔壁上
加液时，吸头在不碰到孔底的前提下尽量沿着孔壁下方加液。
吸取不同的试剂时应更换吸头，
耗材重复使用
配置不同的试剂组分时，应使用
不同的储液器皿。
操作时细心，注意不要触碰底部。
微孔底部被划伤或存在污垢擦拭酶标板底部，以去除污垢或
指纹。
阈值附近时阴时阳
同一样品做3个复孔，以2个（含 2个以上相同结果为准）。
enzyme-linked immunosorbent assay
酶联免疫吸附测定（ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。
但在实际操作及分析中，总会出现各种问题，本次就ELISA 常见问题分析汇总，希望对科研菌的实验有所帮助。
加样时交叉污染

（2017版）ELISA试剂盒实验常见问题大全

（1）问：小鼠乙酰胆碱Elisa试剂盒后期数据处理中空白的OD值有什么作用？答：可以将标准品和样本的OD值同时减去空白的值进行计算，或者都不减，保持同一水平就行。

（2）问：那我们算出来的ACH含量为什么出现负值？答：说明个别样本的浓度很低,当浓度接近第6个点的时候,直线方程就有可能计算出负值。

（3）问：小鼠乙酰胆碱ELISA试剂盒，组织标本切割标本后能用生理盐水稀释吗？还有稀释的倍数是多少?答：生理盐水也可以，加入量1:3。

（4）问：我想问一下，标准品浓度与标准品吸光度值之间是不是线性回归？检测出来的吸光度值很低一般都存在哪些原因？大部分在0.08左右？（大鼠5羟色胺（5-HT）Elisa试剂盒）答：是线性回归。

检测出来的值比较低，样本、稀释、操作等，原因很多，但只要在可操作范围就行。

（5）问：做出来的结果：标准品的吸光度呈线性回归，但是样品的吸光度都和本体吸光度值接近，正常未予干预的大鼠血浆都基本没有5-HT 表达，这是什么原因？（大鼠5羟色胺（5-HT）Elisa试剂盒）答：样本、稀释、室控和机器操作等，原因都可能造成吸光度都和本体吸光度值接近，好像荧光法里面有种试剂盒可以检测滴度。

（6）问：Elisa试剂盒的使用的方法是什么啊？答：采用双抗夹心法（目前暂行）（7）问：一个孔需要多少量的血清？答：一个孔上样量10-50微升。

（8）问:未处理的样本我需要邮寄多少的量？答：每个孔需要100ul（9）问：样本怎么保存？答：当天要用的样本保存4℃，隔天样本-20℃（近期一个月左右要用的样本），长期保存样本-70℃（一年或者更长时间多久都可以用），避免反复冻融。

（10）问：EP管是什么管？答：离心管。

（11）问：收集血清的时候用什么管？答：普通离心管即可。

（12）问：96t可以检测多少个样本？48t可以检测多少个样本？答：96t标准的可以检测85个样本，其他有10个标准品孔，1个空白对照。

96t单孔可以检测90个样，7个标准品控1个空白对照。

Elisa试剂盒错误用法总结

Elisa试剂盒错误用法总结
对于Elisa试剂盒的使用，总有解不完的疑问，比如说加样器不确；特别10ul以下的加样器，对成果影响；保温设备不良；洗刷用水不规范。

如何解决这些疑问呢：
1、加样不；没有混匀。

加样时必定要细心。

加样后，再查看，以防漏加、错加。

2、加样后，重复抽吸3次混匀，防止血清集合孔底，致使非特异性吸附。

洗刷洗刷不①每次灌水洗刷，应停止30秒钟；②选用吸水纸作为衬垫，每次洗刷后扣干孔内水分；
3、可选用塑料洗刷瓶。

加酶反响漏加滴加后，细心查看各孔成果判别①包含阴性对照孔在内，各孔显色普遍偏深；
②包含阳性对照在内，各孔均无显色；③阳性对照不显色，而其它样本显色正常；
4、有些标本显色不深，判别阳性艰难。

①可能是洗刷不充分；加样过量；温育时刻过长温度过高；按说明书从头操作。

如无改进，可与生产厂家联络；②可能是漏加样本或酶液；温育时刻过短温度过低；试剂保留不当活性降低；按说明书从头操作。

如无改进，可与生产厂家联络；③阳性对照漏加、错加或失效。

从头操作。

如无改进，可与厂家联络，索要对照品；④从头操作。

运用酶标仪，测定光吸收度，按P/N值规范判别。

ELISA试剂盒保留保留不规范必定要在2-8℃寄存。

不得过高，也不得冻存（冻存后，酶液将失效）。

对照品对照品为冻干品按对照管标明，参加相应体积的去离子水或蒸馏水复溶，充分溶解混匀。

可按说明书运用。

ELISA操作：Elisa实验结果不理想,应出现的问题总结

ELISA操作：Elisa实验结果不理想，应出现的问题总结ELISA操作：Elisa实验结果不理想，应出现的问题总结优化ELISA的重点之一在于洗涤。

洗涤步骤可降低未结合抗体所引起的背景信号，从而增加分析的信噪比。

每一步之间的洗涤确保只有特异的结合事件被保留，在最后一步产生信号。

而不充分的洗涤会导致差异和高背景，从而带来不理想的结果。

在做ELISA实验时，洗板有两种方法：手工法洗板和洗板机洗板。

二者没有本质的差别，只要操作合乎要求，均能得到正确、可靠的结果。

手工洗板手工洗板人为因素比较大，实验人员必须经验丰富，洗涤次数要足够，冲击力又不要太大，加入的洗液量以说明书为准，防止孔口内有游离酶未能洗净，同时防止孔与孔之间液体交叉。

洗涤结束后扣干亦非常重要，否则易造成假阳性。

每次洗完板后，在吸水纸上轻轻拍干，拍板时要垂直，避免交叉感染。

用力不能过猛，防止抗原抗体复合物脱离;吸水纸要一次性使用，应使用不易脱落碎屑的吸水纸为宜。

酶结合物不耐干燥，特别在较高的温度下更易失活，所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间，时间越长，吸光度值越低。

手工操作有浸泡式和流水冲洗式两种方法：浸泡式1. 吸干或甩干孔内反应液;2. 用洗涤液过洗一遍(将洗涤液注满板孔后，即甩去);3. 浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1～2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短;4. 吸干孔内液体。

吸干应，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干;5. 重复操作步骤3和4，洗涤3～4次(或按说明规定)。

在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。

微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。

洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。

聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。

浅析ELISA中的常见问题

浅析ELISA中的常见问题ELISA是蛋白定量的金标准，也是免疫学研究中最常用的实验方法之一。

很多人觉得ELISA很简单，其实不然。

ELISA中出现的各种问题，正是很多人对其认识不足而产生的。

今天跟大家分析一下ELISA 实验中的常见问题，希望对大家有所帮助。

一、标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。

标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。

在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。

单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。

二、标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。

推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。

如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。

对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。

三、标曲显色，样本不显色遇到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。

任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。

目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。

如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。

对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。

因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度最低的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。

而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。

需要指出的是，国内某些所谓的高敏ELISA试剂盒，并没有采用信号增强剂的方法，而只是简单地提高了抗体浓度，较普通ELISA其灵敏度的提升有限。

ELISA常见问题(答案)

ELISA 常见问题与回答Part One: 原理1.ROMER AgraQuant ®酶联免疫试剂盒原理？请解释具体原理AgraQuant ®2.不同类型的真菌毒素中是否存在交叉反应酶联免疫试剂盒使用的是直接竞争酶联免疫吸附技术。

目标待测物的特异性抗体被预先包被在微孔中，将样品萃取液与酶联偶合物充分混合均匀后加入抗体包被孔中，竞争性结合微孔中的特异性抗体；经过洗板去除未参加抗原-抗体反应的的待测物抗原。

加入显色底物，微孔中与特异性抗体结合上的酶联偶合物将使底物产生颜色反应，颜色变为蓝色，且颜色深浅与微孔中已结合的酶联偶合物成正比，与样品中或标准品中待测抗原含量成反比；加入反应终止液终止反应后，反应液颜色由蓝色转为黄色。

在450nm(OD450)滤镜及630 nm 示差滤镜下使用酶标仪对微孔板进行吸光度值测量。

利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，将样品的吸光度值与标准品的吸光度值进行比较以进行结果的判读。

颜色的强度与样品中待测物的含量成反比，即真菌毒素污染含量越高，孔里的颜色强度越低。

在各种不同类别的真菌毒素中的交叉反应是不存在的。

例如黄曲霉毒素试剂盒将不会检测到其他真菌毒素，例如赭曲霉素，付马毒素等；但是在同一类别的真菌毒素之间会产生交叉反应，例如T-2毒素试剂盒会对HT-2毒素存在交叉反应。

Part Two: 样品处理3.样品粉碎细度对检测结果是否有影响？真菌毒素取样的关键点是什么？样品的粉碎其目的更重要的是将基质混匀，以提高样品的代表性，通常推荐粉碎细度达到20目即可，但要确保样品混合的均质性。

真菌毒素取样的关键包括以下几点：1）使用适当的取样工具2）使用适当的取样方式在储存地点收集样品3）适当的取样量：一卡车或火车箱中取 3-10 磅样品4）在样品分析前应用纸袋或布袋储存在干燥凉爽的地方，以避免微生物或霉菌的生长5）送至实验室中检测的样品成品至少1公斤；原料至少2.5公斤6）全部样品粉碎后，进行二次取样。