实验一附录 植物转基因载体的介绍

2.研究基因的功能 研究基因的功能
（1）基因的过量表达 （2）RNAi载体：基因的抑制表达
3.利用转基因植物生产外源蛋白质 利用转基因植物生产外源蛋白质
（1）异源蛋白药物：利用哺乳类动物细胞产生蛋白药物是极其昂贵的， 而植物生长成本较低，农田里可换得大量蛋白质药物。目前这方面的 项目仍在实验室里进行：如人的脑腓肽、人血清蛋白、及小鼠的单克 隆抗体等。举例说明：小鼠的抗体轻链和重链基因分别在两种烟草植 物中表达。然后两种植物品系杂交，产生的子代植物表达小鼠的重链 轻链两种蛋白。从烟草的叶子里可检测到完整的抗体分子，含量为叶 细胞蛋白总量的1.5%。实验还表明，植物的蛋白分泌系统能够识别小 鼠抗体前体的信号肽顺序。 （2）食用或工业用油：首批大规模生产并取得商业效益的非食用性转基 因植物产品是工业用油，其中包括制造肥皂和去垢剂的月桂酸（12个 碳原子）。科学家们仅表达一个特殊的基因就使油菜生产月桂酸而不 是通常的18个碳原子的不饱和脂肪酸。这个实验田试验结果极其成功， 经济效益显著。此外，利用油菜易于生长及产量高的特点，人们还致 力于用它生产其它工业用油。如，作用润滑油及尼龙生产的原料芥酸； 用于麦淇淋生产的6－十八碳烯酸等等。 （3）高分子材料：通过转基因植物获得的高分子原材料范围极其广泛。 包括：可被生物降解的聚羟丁酯塑料（PHB）以及天然棉花与聚酯的 混合纤维等。
Ti质粒转化植物细胞的战略 质粒转化植物细胞的战略
天然的Ti质粒不能作为表达载体使用的理由：
1.
生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止 了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。 有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生 长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有 机碱合成基因（tmt）。 Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位 点。 Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增， 须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记，使用植物 细胞启动子及末端polyA信号，加入多聚人工接头（多克隆位点） 以利于外源基因的克隆。
植物转基因载体的介绍
根癌农杆菌
农杆菌细胞呈杆状，0.8×1.5-3.0µM，以1-4根周生鞭毛运动。 常有纤毛，不形成芽孢，革兰氏染色呈阴性。菌落无色素， 随着菌龄的增加，光滑的菌落逐渐变成有条纹，但也有许多 菌株生成的菌落呈粗糙型。 根癌农杆菌广泛存在于双子叶植物中。一般认为单子叶植物 对农杆菌不敏感，但是近年来的研究表明，农杆菌对单子叶 植物也有浸染能力。
Ti质粒的结构 质粒的结构
Ti质粒大约在160～240kB之间。其中T-DNA大约在15kb30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在 Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。
T-NAi载体
pZY载体 载体
植物转基因技术的应用
1.转报告基因研究植物基因的表达与调控 2.研究基因的功能 3.利用转基因植物生产外源蛋白质 4.改良植物品种
1.报告基因研究植物基因的表达与调控 报告基因研究植物基因的表达与调控
植物对环境中的光、重力等因素尤为敏感。这些因素均可 诱导基因的表达。利用报告基因环境因素的变化对基因表 达的影响，是植物分子生物学的重要内容。 在植物中常用的报告基因有：
植物细胞转化的双元系统
目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双 元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重 组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农 杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共 整合系统所不同的是，含外源基因的质粒 可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆 菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动 Ti质粒上的Vir基因（在Helper质粒） ，随 后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到 植物细胞中。 双元载体主要包括两个Ti质粒，即微型Ti 质粒和辅助Ti质粒。
常用载体的构造
花椰菜花叶病毒Cauliflower mosaic virus 35S启动子(CaMV 35S) 胭脂碱合成酶Nopaline syntheses terminator 3'转录终止子(NOS) 标记基因新霉素-3‘-磷酸转移酶Neomycin phosphotransferase-Ⅱ(NPTⅡ)，抗卡那霉素
2.
3.
4.
植物细胞转化的共整合系统 一元载体系统） （一元载体系统）
T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含 有E.coli的选择标记和植物选择标记 Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子， 然后将重组质粒转化到农杆菌中， 质粒与Ti质粒上的同源序列发生同 源重组，将外源基因整合到Ti质粒 上，用于侵染植物细胞。T-DNA重 组分子整合到植物细胞染色体DNA 上，Km筛选转化细胞。
Ti质粒的结构 质粒的结构
1. T-DNA——transferred-DNA regions:是农杆菌浸染植物细胞 时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，故称 之为转移DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。 2. Vir区—virulence region：该区段的基因能够激活T-DNA转移， 使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区和Vir区在 质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒的三分之一。 3. Con区——regions encoding conjugations：该区段上存在着 与细菌间结合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在农杆菌 之间的转移。冠瘿瘤碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因 此称之为结合转移编码区。 4. Ori区——origin of replication：该区段基因调控Ti质粒的自 我复制，故称之为复制起始区。
1.大肠杆菌的β－葡萄糖苷酸酶（GUS）：当于在微生物及动物 系统中使用的β－半乳糖苷酶，只是其作用底物为葡萄糖苷酸。该酶 在脊椎动物和微生物中表达，植物细胞中几乎不表达。当gus基因转 入植物细胞内表达时，若与X－葡萄糖苷酸酶（X-gluc，与X-gal相 似），保温后，就会产生蓝色反应，借此可以预测报告基因的表达程 度，但是该酶不能分泌在细胞外，因此在测定酶活时，须将细胞杀死， 破碎。 2.昆虫的荧光素酶基因：荧光酶基因(luc)是O2和荧 光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用X-光 片或专门仪器进行检测。
农杆菌感染植物的原理
农杆根瘤菌之所以会感染 植物根部是因为植物根部 损伤部位分泌出酚类物质 乙酰丁香酮和羟基乙酰丁 香酮，这些酚类物质可以 诱导Vir（Virulence region) 基因的启动表达，Vir基因 的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根 瘤染色体上的操纵子基因 产物则与单链T－DNA结合， 形成复合物，转化植物根 部细胞。
一元载体和双元载体系统的比较
双元载体系统不需要共整合过程； 微型Ｔｉ质粒具有大肠杆菌的复制位点，可以在大 肠杆菌中自主复制，拷贝数增加１０－１００倍， 而且分子质量小，可以直接在体外进行遗传操作； 双元载体系统的构建简单； 微型质粒转化农杆菌更容易，构建频率高； 双元载体中不需要共整合过程，所以基因变异的可 能性降低； 双元载体转化农杆菌后，微型Ｔｉ质粒的稳定性要 差些，容易丢失。
Ti质粒的功能
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成植物激素IAA和一些细胞分裂素的活动； 诱发植物产生冠瘿瘤并决定所诱导的肿瘤的形态学特征和 冠瘿瘤充分； 赋予寄主菌株具有分解代谢各种冠瘿碱化合物的能力； 赋予寄主菌株对土壤杆菌所产生的细菌素的反应性； 决定寄主菌株的植物寄主范围； 有的Ti质粒能够抑制某些根瘤土壤杆菌噬菌体的生长和发 育，即具有对噬菌体的“排外性”。
4.改良植物品种 改良植物品种
（1）控制果实成熟的转基因植物 （2）抗虫害的转基因植物 （3）抗病的转基因植物 （4）抗除草剂的转基因植物 （5）改变花型及花色的转基因植物 （6）抗环境压力的转基因植物 （7）改良作物的品质 （8）雄性不育
双元载体系统
微型Ti质粒：含有T-DNA边界，缺失vir基因的Ti质粒，转化 的植物不会产生肿瘤。除含有T-DNA的左右边界外，还具 有广谱的质粒复制位点及选择标记基因。 辅助Ti质粒：含有Vir区的Ti质粒。实际上辅助Ti质粒是TDNA缺失的突变型Ti质粒，完全丧失了致瘤功能，因此是相 当于在共整合载体系统中的卸甲Ti质粒。主要作用是提供vir 基因功能，激活T-DNA转移。最常用的辅助质粒是根癌农 杆菌ＬＢＡ４４０４所含有的Ti质粒ｐＡＬ４４０４。
T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反 复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）生长素 tmr由一个基因组成iptz：分裂素 tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物（opines），即冠瘿碱。 opines有三个成员： octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物 章鱼碱 Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物 胭脂碱 Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物 农杆碱 据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能 利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根 癌农杆菌使用作为氮源及碳源。