颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA———颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径①

颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA———颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径①李先茂　曾位森②　张亚历　(第一军医大学南方医院消化病研究所,广州510515) 中国图书分类号　R392111 文献标识码　A 文章编号　10002484X(2003)1220818204[摘　要]　目的:颗粒酶B(G ranzyme B,G raB)对核内物质具亲和力,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量G raB聚积,观察G raB是否直接作用于基因组DNA。

方法:通过抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT2PCR克隆G raB cDNA,构建G raB原核表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;异丙基212硫代2β2呋喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS2PAGE)分析表达产物。

表达产物经亲和层析纯化后,观察其对基因组DNA的功能。

结果:表达产物以可溶性分子形式存在于菌体中,具有良好的抗原性和特异性,特异性底物检测有活性,且具有直接作用于部分断裂的基因组DNA,使其发生进一步裂解的活性。

结论:G raB直接作用于部分断裂的基因组DNA,这可能是G raB诱导细胞凋亡新的作用途径。

[关键词]　颗粒酶B;基因克隆;原核表达;凋亡G ra B w ork directly on the genome DNA fragmentsLI Xian2Mao,ZENG Wei2Shen,ZH ANG Ya2Li.The Instititue o f Gastroenterology,Nanf ang Hospital,the Fir st Military Medical Univer sity o f P LA,Guangzhou510515,China[Abstract]　Objective:T o develop an inducible system for expression of G raB in E.coli for the purpose of investion of its function on genome DNA fragment.Methods:Amplified granzyme B cDNA by RT2PCR via extracting lymphocyte total RNA.Identified with endonuclease cut and DNA sequence analysis,the gene was inserted into E.coli expression vector pT rcHis2A,the pokary otic expression plasmid pT rcHis2AΠG raB was constructed and trans formed into T OP10F.R esults:A fter8h of IPTG in duction,the G raB was expressed15%of total proteins by S DS2PAGE.Western blot assay proved the expressed hG raB to be of g ood antigenicity and high specificity.The recombinant protein purified by affinity chromatography has effect on G raB substrate.G raB was found to w ork directly on the genome DNA fragments,prom oting its split.Con2 clusion:It is found that there may exist certain novel pathway for G raB2induced apoptosis.[K ey w ords]　G raB;G ene cloning;G ene expression;Apoptosis G raB是杀伤性淋巴细胞内杀伤颗粒特有的丝氨酸蛋白酶。

它是细胞介导的细胞毒作用中重要的效应分子,在抗病毒免疫、肿瘤免疫、自身免疫和移值免疫等方面都发挥极为重要的作用。

G raB除在胞浆中激活caspases级联反应启动凋亡外,还可直接迁移至细胞核,切割NuM A和PARP(体外、体内)、DNA2PK cs(体外)等一系列核蛋白,启动或促进核凋亡事件。

G raB对核内物质具亲和力,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量G raB聚积1。

我们观察G raB能否直接作用于基因组DNA。

1　材料与方法111　材料　原核表达载体pTrcHis2A及宿主菌①本课题受国家自然科学基金(39870723),广东省组织工程团队项目资助②第一军医大学细胞生物教研室,广州510515作者简介:李先茂(1972年-),男,博士;指导教师:曾位森,男,讲师,主要从事肿瘤细胞的凋亡研究工作。

T op10F购自Invitrogen公司。

大肠杆菌H B101、Jurkat 细胞株由南方医院消化科保存。

限制性内切酶、T4DNA连接酶、P fu DNA聚合酶、M M LV、dNTP、DTT、丙烯酰胺和双叉丙烯酰胺均购自Promega公司;G raB 单抗购自Dako公司;Trizol试剂、T alon Metal A ffinity Resins购自Clontech公司;G raB的底物Z2Ile2G lu2Thr2 Asp2AFC购自Calbiochem公司。

112　方法　取正常成人外周血,用淋巴细胞分离液进行分离,Trizol试剂提取细胞总RNA经RT2PCR获得G raB cDNA,所用引物序列如下:上游引物:T AG2 G ATCC ATC ATCGGGGG AC ATG AGG;下游引物:T A2 AAG CTTT AG TT AG T AG CG TTTC ATG。

反转录反应的体积为25μl,含10×Bu ffer215μl,细胞总RNA5μg, 4×dNTP1m olΠL,六核苷酸随机引物10pm ol,RNasin 10U,M M LV逆转录酶50U,42℃反应1小时。

取反转录产物3μl为模板做PCR。

G raB的PCR反应体系为50μl,含10×P fU酶Bu ffer5μl,4×dNTP200μm olΠL,上下游引物各1μm olΠL,P fU DNA聚合酶・818・中国免疫学杂志2003年第19卷3U。

循环参数为94℃30秒,58℃30秒,72℃1分钟,30个循环。

G raB原核表达载体的构建:用限制性内切酶分别消化G raB RT2PCR产物和原核表达载体框架pTrcHis2A,经琼脂糖凝胶电泳,回收相应片段,以T4DNA连接酶,16℃连接12～16小时,转化H B101,经碱法小量抽取质粒,并用限制性酶切和DNA序列测定进行鉴定。

将构建好的pTrcHis2AΠG raB转化T OP10F,37℃培养过夜,挑取单菌落于LB 液体培养基(50gΠL氨苄青霉素)5ml中,37℃恒温摇床300rΠmin,培养至A=015～016,加IPTG30℃继续培养8小时,取1ml以4℃6000rΠmin离心进行鉴定。

G raB表达产物的S DS2PAGE分析:取离心沉淀1ml菌液加入1×S DS2PAGE上样缓冲液,置沸水中煮10分钟,加样于12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳,约2小时后进行考马斯亮蓝染色。

凝胶用薄层扫描仪扫描,计算重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白的百分比。

免疫学鉴定:表达产物采用Western blot 进行分析,具体步骤参见文献2进行。

G raB的纯化:用裂解液(50mm olΠL P BS,300mm olΠL NaCl)悬浮细菌,超声破碎离心取上清,加入装有T alon Metal A ffinity Resins的柱子。

用013m olΠL NaCl冲洗,再加0115m olΠL咪唑洗脱,行P BS缓冲液透析。

纯化蛋白行S DS2PAGE并用薄层扫描仪扫描计算重组蛋白的纯度。

G raB活性鉴定在荧光分光光度仪下检测表达的G raB(溶于P BS)与带荧光标记的G raB底物(1mgΠml)结合时荧光强度,对照组为等质量的带荧光标记的G raB底物(溶于P BS)。

G raB对基因组DNA的作用LOVO细胞于1640培养基中37℃、5% C O2条件下培养,酚氯仿法抽提LOVO细胞基因组DNA,超声破碎基因组DNA。

部分断裂基因组DNA 与G raB,或与10μl P BS共同37℃孵育3小时,琼脂糖凝胶电泳观察结果。

2　结果211　G raB的克隆　RT2PCR产物电泳741bp处得到相关片段(见图1)。

G raB原核表达载体的构建(见图2)。

采用Sanger法测序结果显示插入的G raB 基因方向正确、无碱基错误和缺失。

对菌体和上清的S DS2PAGE分析结果显示,上清无特异条带产生; IPTG诱导的菌体超声破碎上清蛋白,在27ku处有一条带明显的区别于未加IPTG诱导的菌体对照组,这与G raB分子量基本一致,而且G raB表达量占菌体总蛋白15%以上,纯化蛋白的纯度在80%以上(见图3)。

Western blot结果显示,G raB表达菌体在27ku 处有一条特异性条带,IPTG诱导表达的菌体的G raB 表达量明显比未用IPTG诱导表达的多,证实表达产物具有G raB的抗原性(见图4)。

生物学活性检测显示表达的G raB(溶于P BS)与带荧光标记的G raB 底物(1mgΠml)结合时荧光强度明显增强,1μg表达的G raB的荧光强度增强9169±0113。

212　G raB对基因组DNA的作用　部分断裂基因组DNA经重组G raB消化后进一步裂解,且具有剂量依赖性。

21211　G raB对断裂基因组DNA的作用见图5。

21212　不同剂量G raB对断裂基因组DNA的作用见图6。

图1　RT2PCR产物电泳图Fig.1　PT2PCR product electrophoresisresult图2　颗粒酶B原核表达载体的构建Fig.2　Construction of recombinant plasmid pT rc H is2AΠG ra B・918・李先茂等　颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA———颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径　第12期图3　重组蛋白G ra B 的SDS 2PAGE 分析Fig.3　SDS 2PAGE analysis of recombinant proteinN ote :11IPTG 2induce 8h ;2.Purity protein ;3.non 2induced ;4.IPTG 2induce12h ;5.IPTG 2induce 18h ;6.S tandard relative m olecular mass (M r )marker.图4　重组蛋白G ra B Western blot 分析Fig.4　Western blot analysis of recombinant proteinN ote :1.non 2induced ;2.IPTGinduced.图5　重组蛋白G ra B 裂解断裂基因组DNAFig.5　R ecombinant G ra B split genome DNA fragmentN ote :1.DNA mark ;21genome DNA fragment and 012μg G raB ;31genomeDNA fragment and 10μl P BS ;41genome DNA and 012μg G raB ;5.ge 2nomeDNA.图6　不同剂量G ra B 对断裂基因组DNA 的作用Fig.6　G ra B split genome DNA fragment with different doseN ote :11DNA mark ;21018μg G raB and genome DNA fragment ;31014μgG raB and genome DNA fragment ;41012μg G raB and genome DNA fragment ;51011μg G raB and genome DNA fragment ;610105μg G raB and genome DNA fragment ;7.DNA mark.3　讨论杀伤细胞识别靶细胞后,排放其特有的杀伤颗粒,诱导靶细胞凋亡。