拮抗罗非鱼养殖水体中海豚链球菌功能性微生物的筛选

生物灾害科学 2014, 37(1): 26-32 Biological Disaster Science, V ol. 37, No. 1, 2014 swzhkx@ DOI：10.3969/j.issn.2095-3704.2014.01.005拮抗罗非鱼养殖水体中海豚链球菌功能性微生物的筛选瞿建宏1，陈辉2，吴伟1,2*（1. 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/中国水产科学研究院内陆渔业生态环境与资源重点开放实验室，江苏无锡 214081；2. 南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081）摘要：以罗非鱼链球菌病的病原——海豚链球菌（Streptococcus iniae）为目标菌株，研究了多株分离自罗非鱼养殖水体具有净化水质功能的微生物对其的拮抗作用。

结果表明：通过初筛获得了11株对海豚链球菌具有拮抗功能的微生物菌株，其中7株拮抗效果较为显著，分别属于芽孢杆菌(B0903, B0910, B0916)、乳杆菌(L0914, L0917)、假丝酵母(C0909)和诺卡氏菌(N0906)。

对这7株菌株从生长优势、共凝集率、净化水质能力等三方面进行进一步的筛选，发现7株菌株的生长系数均大于海豚链球菌，L0917、C0909、N0906的倍增时间显著低于海豚链球菌，且L0914、C0909、N0906能与海豚链球菌产生共凝集作用，共凝集率分别为3.03%、4.11%和1.85%。

7株菌都具有一定的净化水质的能力，但C0909、L0914对氨氮的去除率显著低于菌株N0906。

研究显示，诺卡氏菌N0906较适宜作为罗非鱼养殖中控制养殖生态环境和链球菌病害的微生态菌株。

关键词：拮抗；海豚链球菌；罗非鱼；养殖水体；微生物中图分类号：S965.125 文献标志码：A 文章编号：2095-3704（2014）0026-07Research on Screening of Antagonistic Bacteria against Streptococcus iniae inTilapia Cultural WaterQU Jian-hong1, CHEN Hui2, WU Wei1, 2(1. Freshwater Fisheries Research Center/Key Laboratory of Inland Fishery Eco-environment and Resources, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuxi 214081, China; 2. Wuxi Fisheries College, Nanjing AgriculturalUniversity, Wuxi 214081, China)Abstract: Eleven strains of antagonistic bacteria against Streptococcus iniae were isolated from the preserved bacteria with the ability of purification of stimulant aquaculture wastewater isolated from the tilapia cultural water. The most compatible strains were chosen for the growth curves, co-agglutination assay and ability of cleanse effects in the aquaculture wastewater. The result showed: 7 isolated strains had more advantages in RI than Streptococcus iniae, and shorter doubling time were found in L09017, C0909 and N0906 indicating the growth advantages in the intestine of Streptococcus iniae; 3 (L0914, C0909, N0906) of 7 strains had co-agglutination effects with Streptococcus iniae and their co-agglutination ratios were 3.03%, 4.11% and 1.85%, respectively; all 7 strains had the ability of cleanse effects on the aquaculture wastewater, but C0909, L0914 had fewer advantages in degrading ammonia-nitrogen than N0906. In conclusion, N0906收稿日期：2014-02-28基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金资助项目（No.CARS-49）和农业科技成果转化资金项目（2012GB23260567）作者简介：瞿建宏，女，副研究员，主要从事渔业生态环境保护的研究；*通信作者：吴伟，研究员，E-mail: wuw@。

2014年第1期瞿建宏等：罗非鱼养殖水体中具拮抗海豚链球菌功能的微生物的筛选・27・was more moderate to be used as the bio-control bacterium against Streptococcus iniae in tilapia and had good development and research values.Key words:antagonism; Streptococcus iniae; Tilapia; aquacultural water body; microorganisms罗非鱼原产于非洲，因具有生长快、个体大、病害少、肉质营养丰富等特点，广受世界各国消费者和养殖业者的青睐，已成为世界性养殖的经济水产动物，被FAO列为人类六大主食品之一[1]。

近几年来，随着罗非鱼养殖规模的不断扩大，养殖密度不断提高，罗非鱼病害时有发生，其中链球菌病是罗非鱼主要的病害之一。

据研究，养殖生态环境的恶化，特别是养殖水体中氨氮、亚硝酸盐含量的增加，是罗非鱼链球菌病爆发的诱因。

不良生境不仅可直接危害养殖鱼类，使鱼体的免疫力下降，增加了细菌的易感性，而且也为病原菌的增殖和传播提供了有利条件[2]。

因此，从环境控制角度，寻求一种既能优化养殖水体环境又可抑制病原菌爆发性生长的有效方法显得意义重大。

传统的鱼病防治方法是使用药物防治，抗生素等化学药物的使用一方面带来了显著的防治效果，但同时也会因使用不当造成病原菌的耐药性增强、药物残留等问题。

既破坏了生态平衡，又造成了水产品质量安全问题，而以微生态制剂为主的生物防治方法，避免了抗生素等化学药物带来的潜在危害，满足了环境友好型水产养殖的要求，日益受到养殖业者的高度关注。

在水产养殖中，微生态制剂不仅可以作为添加剂添加于饲料，还可以直接添加于水体中[3]，起到净化养殖水质、优化养殖水域生态结构、抑制水体中病原菌的生长、提高养殖生物的免疫力，使养殖活动良性循环发展。

目前已有乳杆菌（Lactobacillus sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）等微生态制剂被应用于水产养殖的病害防治中，但针对某种特定的鱼类和病原体的微生态制剂的研究几乎未见报导。

本文试图从自罗非鱼养殖水体中分离得到的具有净化水质功能的微生物菌株中筛选出对罗非鱼链球菌病原——海豚链球菌具拮抗功能的菌株，并从生长优势、共凝集、净化水质的能力等方面进一步筛选得到最适的拮抗菌株，以期为罗非鱼链球菌病的生态防控提供有效方法和适宜菌株，为罗非鱼的健康养殖提供技术支撑。

1 材料与方法1.1 试验材料芽孢杆菌（Bacillus sp.）、乳杆菌（Lactobacillus sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）、假丝酵母（Candida sp.）、诺卡氏菌（Nocardia sp.）等由中国水产科学院淡水渔业研究中心环境保护研究室分离鉴定并提供；海豚链球菌（Streptococcus iniae）由广西壮族自治区水产科学研究院保存并提供。

1.2 试剂及仪器试剂：蛋白酶K（≥250 µg/mg）、胰蛋白酶（≥2 500 µg/mg）、Tris-Hcl缓冲液、革兰氏染液，由上海生工生物工程有限公司生产；硫酸铵、氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠、氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碘化钾、氢氧化钾、硫酸镁、碳酸钙、硫酸锌、硫酸铁、酒石酸钾钠、二氯化汞、4-氨基苯磺酰胺、N-（1-萘基）-乙二胺二盐酸盐，均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；丙酮、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚，均为分析纯，由上海联试化工试剂有限公司生产；BS 培养基、MRS培养基、PDA培养基、BHI培养基，由北京陆桥生物技术有限公司生产。

仪器：0.02 mm游标卡尺、PHS-3TC PH酸度计、Eppendorf移液枪、AL 204电子分析天平、Sigma 2-16K台式高速冷冻离心机、Agilent 7530型紫外分光光度计、Nikon 90i光学显微镜、ELx808酶标仪、SANYO MIR-153型高低温恒温培养箱、ZHWY200B恒温振荡摇床、TOMY Autoclave SS-325型全自动高压灭菌器、ZHJH-1214双面气流式无菌工作台、一次性细菌微孔滤膜器（膜孔径为0.22 µm），一次性灭菌注射器（2 mL、5 mL），打孔器等。

培养基：芽胞肝菌、假单胞肝菌采用BS培养基；乳杆菌采用MRS培养基；假丝酵母、诺卡氏菌采用PDA培养基；海豚链球菌采用BHI培养基。

・28・生物灾害科学第37卷第1期1.3 试验方法1.3.1 菌株的活化和纯化 在紫外无菌操作台从4℃冷藏保存的菌种斜面上取一环菌苔，接种于50 mL 灭菌的液体培养基中，于28℃恒温振荡培养24 h，取菌液在含固体培养基的平板上划线，置平板于恒温28℃培养箱内培养48 h。

从平板上挑取单菌落，进行革兰氏染色镜检，合格后将单菌落接种于灭菌的斜面固体培养基上，经培养后于4℃冰箱保存备用。

1.3.2 拮抗海豚链球菌的功能微生物筛选 参照Tramer等[4]的抑菌圈方法进行。

采用BHI液体培养基培养海豚链球菌，28℃培养24 h，吸取0.1 mL培养液于无菌平皿中，待经115℃灭菌的BHI固体培养基冷却至40℃左右后，倒入平板，与菌液混匀后放置于无菌室约1 h，取出并倒置放于4℃冰箱中1 h。