微卫星产物变性与非变性PAGE-银染方法比较
非变性凝胶电泳技术
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
微卫星DNA标记在近交系大鼠HFJ和MIJ遗传监测中的应用
中 国 实 验 动 物 学报 ２ １ ０ ２年 ４月 第 ２ Ｏ卷第 ２期
Ａｅ ａ ｎｍ Ｓｉ ｉ， ｐｉ ２ １ ， ｏ．０ Ｎ ． ｔ ＬｂＡ ｉ ｃ Ｓｎ Ａ ｒ ，０ ２ Ｖ １２． ｏ２ ａ ｌ
３ ３
传检 测 已被证 明具 有 独 特 优 势 和 良好 前 景 。 。刘 军 须 等 ］ 自 ２ ０ 年 开始 ， 用本 实验 室饲 养 的一 ， ０１ 选 对 清 洁级 Ｗｉ ａ 大 鼠作 为 基 代 ， 育 近 交 系 ， 终 ｓｒ ｔ 培 最
【 关键 词 】 Ｈ Ｊ 鼠 ； Ｊ 鼠 ； 卫 星 Ｄ Ａ； Ｆ大 ＭＩ 大 微 Ｎ 遗传 监测
【 中图分 类号】Ｑ ５３ ９ －３
【 文献标识 码】Ａ
【 文章编 号】１０ ４８７ ２ １ ）２０ ３ －５ ０ ５ ４ （０ ２ ０ －０ ２０
Ｄｏ ：０ ３ ６ ／ ．ｓｎ １ ０ ｉ１ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ０ ５—４ ４ ． ０ ２ ０ ． ０ ８７ ２ １ ．２ ０７
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【 ｂｔａｔ ０ｂｅｔ ｅ Ｔ ｅｐｌ ｒｈｓ ｆｍｃｏａｅｉ ｏｉａ ｎ ｕ ｎ ｒ ｔ ｉｓｏ ｒｔ Ａ ｓ ｃ】 ｒ ｊｃ ｖ ｈ ｏｙ ｐ ｉ ｏ ｉ ｓｔ ｌｅｌ ｍｏｇｆ ｒ ｂｅ ｓ ａ ｆ ａ ｉ ｍｏ ｍ ｒ ｌｔ ｃ ｏ ｉ ｄ ｒ ｎ ｓ（Ｈ Ｊ Ｆ ，ＭＩ， Ｊ
微卫星标记遗传多样性的度量指标及影响因素
微卫星标记遗传多样性的度量指标及影响因素乔利英;袁亚男【摘要】本研究对微卫星标记分析畜禽遗传多样性的方法、步骤、度量指标、影响因素及影响因素的原因、解决对策等进行了分析讨论,并对微卫星标记在绵、山羊遗传多样性上的应用与研究进展作了概述,为遗传育种工作提供参考依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2010(000)001【总页数】5页(P107-111)【关键词】微卫星标记;遗传多样性;PCR;遗传变异;遗传距离【作者】乔利英;袁亚男【作者单位】山两农业大学动物科技学院,太谷030801;山两农业大学动物科技学院,太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q75家畜遗传多样性是动物遗传育种研究的基础,通过对其进行评估,可了解家畜品种的遗传结构、生活背景,分析其进化的历史及探讨品种濒危的原因和现状,提出合理的保种措施。
近年来,微卫星DNA(microsatellite DNA)在度量品种遗传多样性、估计品种间遗传距离及构建系统发生树等研究中显示出的优势,被认为是各类遗传标记中最有价值的一种。
本研究主要对微卫星标记分析畜禽遗传多样性的度量指标、影响因素及微卫星遗传多样性在绵、山羊上的应用与研究进展作了概述,为绵、山羊的遗传育种工作提供参考依据。
1 微卫星标记的检测程序从动物血液或组织中提取基因组DNA,选择特异性较高的引物通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术进行DNA扩增。
PCR技术的反应体系与条件的优化至关重要,特别是引物的特异性高低直接影响到分析结果的准确性。
然后在1%～2%的琼脂糖凝胶上检测有无产物带,再取检测阳性产物用6%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,用数字凝胶成像分析系统进行等位基因分型。
据研究,微卫星产物在非变性聚丙烯酰胺凝胶中,表现为有较多的非特异带,而在变性胶中微卫星扩增产物条带清晰,易于鉴定(曲鲁江等,2004)。
2 遗传多样性的度量指标及影响因素2.1 等位基因频率和等位基因数2.1.1 等位基因频率(allele frequencies)微卫星呈共显性遗传,其基因型直接反映表型。
蛋白非变性胶详解[最新]
![蛋白非变性胶详解[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/b55dbc6700f69e3143323968011ca300a6c3f621.png)
Native-PAGE原理非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)是在不加入SDS 疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于同工酶的鉴定和提纯。
未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。
实验方法非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。
一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。
分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。
酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会相阳极移动；而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离酸性蛋白。
工作液配制1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase，144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O；-20℃贮存；6. 10％APS；7. 0.25％考马斯亮蓝染色液:Coomassie blue R-250 2.5g，甲醇ml，HAc 100ml, dH2O 450ml；8.考马斯亮蓝脱色液:100ml甲醇，100冰醋酸，800ml dH2O电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）1. 碱性非变性胶17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C）4.25ml 0.5ml3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml5. 水3.2ml6. 10％APS 35ul7. TEMED 15 ul8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约80min。
银染PCR(一)
银染PCR(一)作者：阎丽，肖冰，宋卫兵，耿炎，赖卓胜【关键词】大肠癌;线粒体DNA;D MutationanalysisofmitochondrialDNAincolorectalcarcinomatissuesbysilverstainingPCRSSCP 【Abstract】AIM:ToanalyzethemutationsofmitochondrialDNAincolorectalcarcinomatissues.METHODS:Sliversta iningPolymeraseChainReactionSingleStrandConformationPolymorphism(PCRSSCP)techniqueands equenceanalysiswereusedtodetectthepointmutationchangesontheDloopregioninmitochondrialD NAin40colorectalcarcinomastogetherwiththeadjacentnormaltissues.RESULTS:Amongthe40colorec talcarcinomas,pointmutationswerefoundin7colorectalcarcinomatissueswiththemutationrateof18%（7/40）.Amongthe9pointmutations,3pointmutationswerefoundinacolorectalcarcinomaofDukes stageDandtheother6pointmutationswerefoundin6colorectalcarcinomasofDukesstageC.CtoTmutat ionatnp498andatnp16298werefoundin7colorectalcarcinomaswithpointmutations.CONCLUSION:A certaindegreeofpointmutationsisfoundintheDloopregionofmitochondrialDNAincolorectalcarcino matissues,andtheoccurrenceofmutationsmaybeassociatedwithcolorectalcarcinomasusceptibilitya ndmalignantgrade,butwhetherthemutationshavecarcinogenicityneedsfurtherstudy. 【Keywords】colorectalcarcinoma;mitochondrialDNA;Dloop;mutation【摘要】目的：研究大肠癌组织线粒体DNA的突变情况.方法：用银染PCRSSCP技术结合测序的方法检测40例大肠癌组织及其癌旁正常组织的线粒体DNAD环区的点突变情况.结果:40例大肠癌组织中检测到7例点突变改变，突变率为18%（7/40），在检测的9个突变位点，3个突变位点存在于DukesD期的1例大肠癌中,其他6个突变位点分别存在于DukesC期的6例大肠癌组织中,其中498位C→T,16298位C→T两个突变位点在检测到点突变的7例大肠癌组织中均检测到.结论：大肠癌组织线粒体DNAD环区存在一定程度的点突变，突变的发生可能与大肠癌的易感性和恶性程度有一定相关性,但是否是大肠癌的发病机制尚有待进一步研究.【关键词】大肠癌;线粒体DNA;D环区;突变0引言目前认为肿瘤的生物学特征不仅取决于核内遗传物质，与核外线粒体DNA的改变也有非常重要的关系〔1-2〕，国内外多项研究发现线粒体DNA的D环区可能为线粒体DNA突变的热点所在，但不同的肿瘤，有关该区突变的频率报道存在明显差异〔3-4〕.为了进一步研究大肠癌组织线粒体DNA的D环区是否存在共性的突变位点，并探讨这些共性的突变位点是否与大肠癌的发生机制有一定相关性，我们用银染PCRSSCP技术结合测序的方法对40例大肠癌组织及对应的癌旁正常组织的线粒体DNA的D环区进行研究.1材料和方法1.1材料200310/200405，经南方医科大学南方医院手术切除证实为大肠癌患者的组织标本40（男22,女18）例,年龄32~75(平均53.6)岁,Dukes分期：B期6例，C期28例，D期6例.线粒体DNA提取试剂盒购自杭州Vgene公司;2×PfuPCRMasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒购自清华大学天为时代公司；银染PCRSSCP试剂购自广州威佳生物试剂公司.1.2方法按照线粒体DNA提取试剂盒上的步骤提取40例大肠癌及癌旁正常组织的线粒体DNA,根据大肠癌线粒体DNAD环区的全长设计四对引物，分别为引物1:5＇GATCACAGGTCTATCACCCTATTAAC3＇,引物2:5＇GGTTTGGCAGAGATGTGTTTA3＇扩增355bp的片段，引物3：5＇GCTTCTGGCCACAGCACTTA3＇，引物4:5＇GCCCGTCTAAACATTTTCAG3＇，扩增313bp的片段，引物5:5＇CTTTCATGGGGAAGCAGATT3＇，引物6:5＇TGTTGGTATCCTAGTGGGTGA3＇，扩增258bp的片段，引物7：5＇CTATCACACATCAACTGCAACTC3＇，引物8：5＇CATCGTGATGTCTTATTTAAGG3＇，扩增342bp的片段，根据四对引物用PCR仪扩增线粒体DNAD环区的全长.成功扩增后取10μLPCR产物，加入8μL变性缓冲液（800g/L去离子甲酰胺，20mmol/LEDTA,0.5g/L溴酚蓝，0.5g/L二甲苯晴蓝）混匀,96℃变性10min,冰上骤冷,立即上样行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺=291),0.5×TBE为电泳缓冲液,10mA 恒电流电泳5h,直至溴酚蓝接近凝胶底部为止，取出凝胶，固定、银染、显色、摄片.将检测到突变的大肠癌的PCR片段纯化,经上海博亚生物技术有限公司进行测序后，将测序结果与基因数据库（/BLAST/）的大肠癌线粒体DNAD环区的序列进行比对分析.2结果2.1线粒体DNAD环区扩增与电泳依据设计的四对引物成功扩增了大肠癌线粒体DNAD环区全长序列，其中引物3，4与引物7，8扩增的大肠癌线粒体DNAD环区序列如图1A，B所示.A：引物3，4扩增的mtDNAD环区PCR产物电泳图(312bp);B：引物7，8扩增的mtDNAD环区PCR产物电泳图(342bp).图1引物3，4与引物7，8扩增的mtDNAD环区电泳图（略）2.2银染SSCP检测将扩增的大肠癌和癌旁正常组织的线粒体DNAD环区的PCR产物行银染SSCP检测，结果发现7例大肠癌组织存在点突变，突变率为18%（7/40），突变位点分别存在于引物3，4和引物7，8扩增的mtDNAD环区的PCR片段中，其中在引物3，4扩增的PCR 片段中检测到的2处点突变，如图2A，B所示.A：13N，13T，14N，14T，15N，15T，16N，16T的SSCP结果提示13T发生点突变;图B:29N,29T,30N,30T,31N,31T,32N,32T的SSCP结果30T发生点突变.图2引物3，4扩增的PCR片段银染SSCP结果图（略）2.3线粒体DNAD环区的突变SSCP阳性的大肠癌组织的PCR扩增片段进行测序，结果发现498位C→T,16298位C→T这两个突变位点在所有SSCP阳性的PCR扩增片段中均检测到，其他突变位点为无规律随机突变的位点.。
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
D N A非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤Hessen was revised in January 2021DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED4、5xTBETris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。
微卫星DNA非变性PAGE银染法的分析探讨
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关键词 ： 卫星 Ｄ Ａ；Ｃ ； 微 Ｎ Ｐ Ｒ 非变 性聚丙烯酰胺凝胶； 银染
中图分类号 ：１２ Ｓ ３
文献 标识码 ： Ａ
文章编号 ：０ １ ３０２０ ） １０ —４３ （０６ ０ ４５ ４ ６—０５ —０
Ａｎ ｌ ｓｓ ａ ｄ Ｅｘ ｌ ｒ ｔｏ ｓ ｏ ｉ ｅ ｔ ｉ ｉ ｇ Ｔｅ ｔｏ ｎ — ｅ ａ ｕ ａ ｔ ａ ｙ ｉ ｎ ｐ ｏ ａ ｉ ｎ ｆＳ ｌ ｒ Ｓ ａ ｎ ｎ ｓ ｆ Ｎｏ —ｄ ｎ ｔ ｒ ｎ ｖ
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SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离与银染检测技术实验报告
实验报告一、实验目的和要求1.了解SSR标记的检测方法；2.了解PAGE银染检测SSR的原理；3.掌握PAGE银染检测SSR的技术。
二、实验内容和原理1. 根据DNA大小及类型的不同，可通过电泳进行分离。
聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，适宜于微卫星等位基因间的差别检测。
2. 银染方法的建立始于1979 年对蛋白质的染色，以后逐渐应用于核酸。
3. 银染原理：扩增DNA经电泳分离后，Ag+可与之形成稳定的复合物，在甲醛的作用下被还原成银颗粒，呈现棕褐色谱带。
三、实验仪器与材料1、实验材料：已准备的12个水稻材料的PCR产物。
2、实验耗材：PCR管、枪头（tip）、1次性塑料手套等；仪器设备：PCR仪、电泳仪、垂直电泳槽及制胶装置、凝胶成像系统/扫描仪、移液枪、塑料托盘等。
3、试剂及配制：①引物（10mM）：根据含有SSR的序列设计而合成的，用无菌双蒸水配制所需浓度。
②dNTP溶液（2mM）：将采购的溶液分装，直接稀释到所需浓度即可。
③Taq DNA聚合酶（5U/μl）：直接采购。
④10 x PCR缓冲液：直接采购。
⑤DNA分子量标准：直接采购。
⑥0.5mol/LEDTA ：在800ml水中加入186.1g EDTA-Na.2H2O，搅拌并用氢氧化钠调PH至8.0，定溶至1L，分装后高压灭菌备用。
⑦TBE电泳缓冲液（Tris-硼酸5×贮存液）：Tris 碱54g/L和硼酸27.5g/L溶于蒸馏水，加入20ml (pH8.0)0.5mmol/L EDTA，定溶到1L。
用时稀释5倍。
⑧上样液（6×）：溴酚兰0.25%、二甲苯青0.25%、蔗糖40%的混合液。
⑨封胶液：1g琼脂糖放于100ml TBE煮沸溶解、混匀。
⑩30%丙烯酰胺（100 ml）：将丙烯酰胺29克和N、N-亚甲叉双丙烯酰胺1克用蒸馏水溶解，定容至100ml。
或从公司直接采购的40%（Acr:Bis=29：1）溶液。
棉花微卫星标记的PAGE_银染快速检测
收稿日期:2000-06-24,3论文联系人基金项目:国家自然科学基金(39830240,3980089),国家转基因植物研究专项(J 992A 2023)资助项目作者简介:张 军(1968-),男,在职博士研究生,工作单位为山东省农业科学院.棉花微卫星标记的PA GE 银染快速检测张 军,武耀廷,郭旺珍,张天真3(农业部农作物种质资源与育种重点开放实验室,南京农业大学农学系,南京210095)摘要:利用一种简便、快速的PA GE 银染方法检测了异源四倍体棉花栽培种陆地棉与海岛棉之间的微卫星多态性,并检测到了微卫星在陆地棉品种间的多态及微卫星标记位点在陆地棉品种间的复等位性。
关键词:棉花;微卫星;PA GE ;银染中图分类号:S 562.035.3 文献标识码:A文章编号:100227807(2000)0520267203Fa st Screen i ng of M icrosa tell ite M arkers i n Cotton w ith PAGE sil -ver Sta i n i ng ZHAN G Jun ,W U Yao 2ting ,GUO W ang 2zhen ,ZHAN G T ian 2zhen (A g rono m y D ep a rt m en t ,N anj ing A g ricu ltu ra l U n iversity ;K ey L abora tory of C rop Ger m p las m and B reed ing ,M in istry of A g ricu ltu re ,N anj ing 210095,Ch ina )Abstract :Po lym o rph is m of m icro satellite m ark 2ers betw een cu ltivars of allo tetrap lo id co tton species (Gossyp ium h irsu tum L .)and the seais 2land co tton (G .baba rd ense L .)w as screened u s 2ing a rap id and si m p le m ethod of PA GE silver stain ing .T he po lym o rp h ic and m u ltiallelic char 2acter of m icro satellite m arkers am ong up land co tton cu ltivars w ere iden tified as w ell .Key words :co tton ;m ico satellite ;PA GE ;silverstain ing微卫星(m icro satellite )或短串联重复(STR )又称简单序列重复(SSR )。
银染aav纯度鉴定原理
银染aav纯度鉴定原理银染（Silver Staining）是一种常用的蛋白质染色技术，非常适用于核酸电泳分析和研究。
而纯度鉴定是确保蛋白质样品中目标蛋白的含量高，且无杂质的重要步骤。
在银染aav （Adeno-Associated Virus，腺相关病毒）纯度鉴定中，我们可以采用以下原理：1.样品制备：将含有目标aav的样品进行破碎和裂解，释放出其中的蛋白质。
经过离心等步骤，得到蛋白质上清液。
这是进行纯度鉴定的起点。
2.蛋白质凝胶电泳：将样品中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。
通常使用的是SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）技术，它能够使蛋白质在电场中按照分子量进行迁移。
3.银染法：将经过电泳分离的蛋白质在凝胶上进行银离子反应，形成深紫色或黑色的沉淀，从而可视化蛋白质的分布情况。
银染法对蛋白质含量敏感，且具有较高的分辨能力。
4.分析结果评估：通过观察银染后的凝胶，我们可以根据目标aav蛋白与其他蛋白质之间的迁移距离和沉淀程度，来初步评估样品中目标蛋白的纯度。
较高的纯度将表现为目标蛋白清晰的单个带状沉淀。
5.图像分析：使用图像分析软件可以量化评估银染结果，测量蛋白质带状沉淀的强度和宽度，进而计算出目标蛋白的相对含量。
这种定量分析可以更精确地确定aav样品的纯度。
总结而言，银染aav纯度鉴定基于蛋白质的分离和银染反应，通过观察和分析蛋白质在凝胶上的迁移和沉淀情况，可以初步评估目标蛋白的纯度，并通过图像分析软件进行定量评估。
这种方法可帮助研究人员确保aav样品中目标蛋白质的高纯度和可靠性，为后续实验和应用奠定基础。
单链DNA纯化对变性PAGE凝胶银染片段回收效率的提高_史金铭
收稿日期:2008-10-09;修回日期:2008-10-20作者介绍:史金铭(1978-),女,博士研究生;通讯作者:孙野青(1959-),女,教授。
基金项目:国家高技术研究发展计划支持(No 2006AA703503C )do i 10.3969/j issn 1008-9632.2009 05 074单链DNA 纯化对变性P AGE 凝胶银染片段回收效率的提高史金铭1,孙野青1,2(1 哈尔滨工业大学生命科学与工程系,哈尔滨150001;2 大连海事大学环境系统生物学研究所,大连116026)摘 要:为了提高变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)银染后片段回收的效率,本实验在传统的煮沸法的基础上加入单链DNA 纯化的步骤对水稻基因组CCGG 为点甲基化敏感限制性酶切多态性(M SAP )分析片段进行回收,并对加入该步骤后的再扩增的效率与传统煮沸法进行了比较。
实验结果显示,加入单链DNA 纯化步骤后的回收效率比传统煮沸法提高了约6倍。
改进后的方法可以有效地用于扩增片段长度多态性(AFLP )以及M SAP 等差异显示PAGE 凝胶银染DNA 片段的回收。
关键词:变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;条带回收;银染;M SAP 中图分类号:Q503文献标识码:B 文章编号:1008-9632(2009)05-0074-03扩增片段长度多态性(AFLP )技术作为一种分子标记技术最初应用于植物基因组的分析中。
目前这种技术在多个领域中有着广泛的应用,如:生物遗传多样性的分析,遗传图谱的构建,遗传育种的鉴定,物种分类和进化的研究,以及基因的定位和分离等[1]。
随着AFLP 技术的成熟和基于该原理的其它技术,如甲基化敏感限制性酶切多态性分析(M SAP)的发展,该技术已经成为应用前景最为广泛的分子标记实验技术[2~4]。
该技术产生的差异片段的回收和测序对于进一步分析差异位点的序列特征是最为重要的步骤。
片段能否回收以及回收的效率直接关系到差异片段的深入分析。
变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究
变性与非变性电泳对牛羊乳蛋白质差异比较研究宋宏新;刘静;张歌;李红心【期刊名称】《陕西科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)006【摘要】主要采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法（Native-PAGE）对新鲜牛羊乳及其酪蛋白清蛋白的区别进行分析检测，对比研究两种电泳方法测定结果的差异，并用两种方法分别检测了掺入不同浓度牛乳的羊乳样品。
结果显示SDS-PAGE法对牛羊乳酪白质的分离效果好，该条件下牛羊乳的区别主要是酪蛋白αs2-CN和αs1-CN ，而native-PAGE法则是对清蛋白分离效果较好，该条件下的主要区别是牛乳较羊乳多两条β-乳球蛋白。
两种电泳方法对掺入不同浓度的羊乳样品的检测阈值均为5％，但native-PAGE效果更明显。
%This experiment analysis and detection fresh cow and goat milk and casein protein , albumin protein by sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and native polyacrylamide gel electrophoresis (native-PAGE) ,comparative the results differ-ences of two electrophoresis methods .And were detected the goat milk samples doped with different concentrations of cow milk by both methods .The results showed that by SDS-PAGE casein protein are separated better ,and th e main differences are αs2-CN and αs1-CN , while native-PAGE separate albumin protein better ,and the main difference is that cow milk has two β-lactoglobulin ,but goat milk hasn′t .And the detection threshold of those two kinds of electrophoresis methods ofdetected the goat milk samples doped with different concentra-tions of cow milk is 5% .But the native-PAGE is more effective .【总页数】5页(P109-113)【作者】宋宏新;刘静;张歌;李红心【作者单位】陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021;陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021;陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021;陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西西安 710021【正文语种】中文【中图分类】TS252.4【相关文献】1.玉米品种SSR标记毛细管电泳荧光检测法与变性PAGE银染检测法的比较研究[J], 易红梅;王凤格;赵久然;王璐;郭景伦;原亚萍2.变性与非变性PAGE在检测家蚕微卫星PCR产物中差异 [J], 连伟;翁宏飚3.棉花品种SSR标记变性与非变性PAGE检测法的比较研究 [J], 刘国栋;王芙蓉;张传云;陈煜;张景霞;杜召海;张军4.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中与杂合子相伴产生的非目的条带的鉴定 [J], 王晓通;连林生;赵春江;邓学梅;吴常信5.基于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的菜心SCoT分析 [J], 史卫东; 罗海玲; 康红卫; 琚茜茜; 张力因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种简便快速高效的DNA银染方法
一种简便快速高效的DNA银染方法郭大龙;张君玉;石春梅;张国海;白晓燕;高姗姗【摘要】以葡萄叶片为试材,对变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中DNA银染及显色方法进行了改良,改良后的方法省略了预处理、固定、用试剂终止显色过程等步骤.使用改进的显带方法得到的PAGE胶图片, DNA带型和背景具有更高的对比度和分辨率;同时操作简单,耗时短,使用试剂少.改良方法使PAGE中DNA银染显色全程时间缩短至15～20 min,且效果较好,可较好的替代常规的银染方法.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2010(000)007【总页数】3页(P74-76)【关键词】聚丙烯酰胺凝胶;银染;显色【作者】郭大龙;张君玉;石春梅;张国海;白晓燕;高姗姗【作者单位】河南科技大学,林学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,林学院,河南,洛阳,471003;华中农业大学,楚天学院,湖北,武汉,430205;河南科技大学,林学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,林学院,河南,洛阳,471003;河南科技大学,林学院,河南,洛阳,471003【正文语种】中文【中图分类】Q78聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)是分析蛋白质和核酸样品的一种常用的方法,在分子生物学及相关学科的研究中得以广泛的应用。
由于其具有较高的分辨率,尤其在AFLP、SSR、SNP等分子标记研究和遗传图谱构建等方面应用更多。
电泳后对样品的显示有许多方法,目标产物的检测主要采取显色法,目前大多采用同位素放射自显影法、荧光染料标记法、溴化乙锭和银染法。
放射自显影法具有灵敏度高、可靠性强等优点,但必须使用同位素标记,操作过程比较繁琐,且操作者易遭受同位素照射的危险,需特别的设备和防护措施,因而在应用中有一定的局限。
荧光染料标记法虽然消除了同位素对人的危害性,但同时也降低了检测灵敏度,且操作过程同样繁琐,需要有荧光显微镜等设备,成本较高。
利用微卫星标记分析两个吉富罗非鱼群体的遗传差异
利用微卫星标记分析两个吉富罗非鱼群体的遗传差异李建林;李红霞;唐永凯;俞菊华;于凡【摘要】[目的]评价不同吉富罗非鱼群体的遗传多样性,筛选出鉴别不同群体的分子标记,为吉富罗非鱼种质资源保护及其新品种选育提供理论依据.[方法]对48尾来自两个不同群体的吉富罗非鱼进行尾静脉采血,抽提其基因组DNA,应用微卫星标记技术判定其等位基因和基因型,然后采用GenAlEx 6.2、Cervus 3.0和Populations软件进行数据分析,计算有效等位基因数(Ne)等群体遗传多样性相关参数,对两个吉富罗非鱼群体进行遗传差异分析.[结果]从50对微卫星引物中筛选出23对扩增产物稳定、条带清晰、特异性好的引物,扩增出的DNA片段大小在110～388 bp.利用23个微卫星位点,从两个吉富罗非鱼群体中共检测到89个等位基因和163种基因型,平均每个位点的等位基因数(Na)3.8个、基因型7.1种.两个吉富罗非鱼群体的平均观察杂合度(Ho)分别为0.6383和0.5957,平均期望杂合度(He)分别为0.5759和0.5559;23个位点在两个群体中平均多态信息含量(PIC)分别为0.5131和0.4942,平均固定系数(FIS)分别为-0.1184和-0.0718;两个群体间的遗传距离(DA)为0.1287,平均遗传分化系数(FST)为0.135.UNH911、GM141、GM287、GM134等4个位点在两个群体中扩增的条带存在明显差异.[结论]两个吉富罗非鱼群体遗传多样性水平较高,均存在杂合子过剩现象,群体间遗传分化程度中等,具有较强的环境适应能力,且选育空间大.UNH911、GM141、GM287、GM134等4个微卫星位点可作为鉴别两个吉富罗非鱼群体的分子标记,也可用于分子标记辅助育种研究.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2015(046)001【总页数】6页(P138-143)【关键词】吉富罗非鱼;群体;微卫星标记;遗传多样性;杂合子过剩【作者】李建林;李红霞;唐永凯;俞菊华;于凡【作者单位】中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡 214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡 214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡 214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡 214081;中国水产科学研究院淡水渔业研究中心/农业部淡水渔业和种质资源利用重点实验室,江苏无锡 214081【正文语种】中文【中图分类】S965.125【研究意义】吉富罗非鱼（Genetically improved farmed tilapia，GIFT）是由国际水生生物资源管理中心（ICLARM）将原产于非洲的4个尼罗罗非鱼品系与亚洲广泛养殖的4个尼罗罗非鱼品系进行混合选育获得的优良品系（Eknath etal.，1993），具有生长速度快、耐盐性好、起捕率高、遗传性状稳定等特点（赵金良和李思发，2005），是目前我国罗非鱼养殖的主要品种。
蛋白质银染原理与方法
原理：蛋白质条带的银染是基于蛋白质中各种基团（如琉基、碳基等）与银的结合，检测极限是 2～5.0ng／蛋白条带。
① SDS-PAGE电泳。
注意：银染检测蛋白质的水平是在100ng左右，与CommassieBlue染色比较，银染加样量要少。
否则难以得到清晰的电泳分辨率。
②电泳结束后，戴手套将PAGE胶转移到干净的玻璃培养皿或TIP头盒盖中。
加入25ml FixingSolution（固定液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在固定液中。
③彻底弃去固定液，加入25mlIncubation Solution（保育液），室温振荡保温30min。
胶需要完全淹没在保育液中。
④彻底弃去IncubationSolution（保育液），用50ml去离子水洗3次，每次5min。
⑤准备：取2.5ml 10XSilvering Solution, 加入22.5mL水，混匀后使用。
⑥弃去洗涤的水，加入25mlSilvering Solution (银染液)。
室温振荡保温20min。
⑦彻底弃去银染液，加入25mLDevelopingSolution（显色液），室温振荡保温1~10min。
注意观察目的条带。
如果目的条带出现了，可以考虑终止显色。
显色时间不要过长，否则本底较深。
⑧彻底弃去显色液,加入25mLStopping Solution（终止液），室温振荡保温10min。
⑨彻底弃去StoppingSolution（终止液），用50mL去离子水洗3次，每次5min。
弃去洗涤的水，加入25mL PreservingSolution（保护液），室温振荡保温20min。
银染PAGE胶可以拍照保存，也可以室温玻璃纸干燥。
今天第一次银染，结果出来啥也没有，凝胶就像一块海带一样。
能不能提供详细的银染步骤呢？好像有好几种版本，哪位大侠有经验的希望能点拨一下？hotstoe wrote:1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶30秒.2. 0.1% 硝酸银染色10分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟.4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10克氢氧化钠+0.2克碳酸钠+2m甲醛溶液,定溶到500ml.这个染色方法挺好的,我用过.注意染色时间不能长.我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶30秒三次，2.0.1% 硝酸银染色10分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶1分钟（换2次去离子水）4.显色液显色15秒,换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定3分钟后再用去离子水洗涤2遍（整个试验比较费去离子水）。
病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白
中国水产科学 2012年5月, 19(3): 509−513 Journal of Fishery Sciences of China研究论文收稿日期: 2011−09−27; 修订日期: 2011−11−27.基金项目: 国家自然科学基金面上项目(31072232, 31172429).作者简介: 汪沐(1987−), 女, 博士, 主要从事水生动物分子病毒学与免疫学研究. E-mail: qdwm08@ 通信作者: 绳秀珍, 副教授. Tel: 0532-********; E-mail: xzsheng@DOI: 10.3724/SP.J.1118.2012.00509病毒铺膜印迹技术分离牙鲆鳃细胞上的淋巴囊肿病毒结合蛋白汪沐, 绳秀珍, 战文斌中国海洋大学 海水养殖教育部重点实验室, 山东 青岛 266003摘要: 利用非变性电泳与病毒铺膜印迹技术(VOPBA)分离了牙鲆(Paralichthys olivaceus )鳃细胞(FG)上淋巴囊肿病毒结合蛋白, 结果显示在FG 细胞膜上有分子量为135 kD 的蛋白与淋巴囊肿病毒特异结合; 对该蛋白切胶回收后进行SDS-PAGE 与双向电泳, 发现135 kD 蛋白由3个蛋白组成, 分子量分别为58.3 kD 、44.6 kD 及37.6 kD; 135 kD 蛋白SDS-PAGE 的VOPBA 显示, 仅出现37.6 kD 的蛋白带, 而58.3 kD 、44.6 kD 蛋白皆不与淋巴囊肿病毒结合。
结果表明牙鲆FG 细胞上135 kD 蛋白是淋巴囊肿病毒的结合蛋白, 其37.6 kD 蛋白具有病毒结合活性。
关键词: 非变性电泳; 病毒铺膜印迹技术; 病毒结合蛋白; 淋巴囊肿病毒中图分类号: S94 文献标志码: A 文章编号: 1005−8737−(2012)03−0509−05淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus, LCDV)属于虹彩病毒科(Iridoviridae )、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus ), 可引起140多种海、淡水鱼的淋巴囊肿病, 尤其在中国养殖的牙鲆中大量爆发, 造成严重的经济损失[1−3]。
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性 遗传 ， 定 性好 ， 比性 强 等优 点 ， 稳 可 目前 已广 泛应
用 于 动植 物 的遗 传 连锁 分 析 ［ １ 因定 ２、 ，基 ３ 多领 域 。 聚丙烯酰胺 凝胶 电泳 （Ａ Ｅ银染法 由于对 Ｄ Ａ ＰＧ） Ｎ 】遗传 、
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微 卫 星 序 列 （ ｃｏａｅ ｉ Ｎ Ｍ ）Ｌ 简 单 ｍｉ ｓｔｌｔ Ｄ Ａ， Ｓ ３ 称 ｒ ｌｅ
测 过 程 中 ， 性 与非 变性 聚丙烯 酰 胺凝 胶法 都 有使 变 用 。本 实验 用这 两种 电泳 方法检 测哲 罗鱼 的微卫 星 位点 ， 二者 在鉴 定 微 卫星 产物 方 面存 在 的差 异及 对
产 生原 因进 行 了分 析 。
序 列 重 复 （ｍ ｌ ｓｑ ｅｃ ｐａ，Ｓ ）是 广 泛 分 布 ｓ ｐｅ ｅｕｎｅｒ ｅｔＳ Ｒ ， ｉ ｅ
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微 卫 星产 物 变 性 与 非变 性 Ｐ Ｅ 银 染 方 法 比较 ＡＧ 一
张春 雷 ， 一佟广香 ｚ匡友谊 ２张超 ｚ， 家胜 ｚ ， ， 一尹
（． １ 云南农业大学动物科学技术学 院，云南 昆明 ６ ０ ０ ； ５ ２１ ２ ．中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 １０ ７ ； ５００ ３ ． 上海海洋大学水产与生命学 院，上海 ２ １０ ） ０ ３ ６
２ Ｈ ｉ ｎｊ ｎ ｉ ｒ ｉ ｅ ｅ ｅｅｒｈＩｓ ｔ ｅＣ ｉｅｅ ａｅ ｆ ｉ ｅ ｃ ｎ ｅ， ｒｉ ５ ００ Ｃ ｉ ； ． ｅ ｏ ｇ ａｇＲｖ ｓ ｒ ｓ ｓａ ｔｕ ， ｈｎ ｓ ｄ ｍｙ Ｆｓ ｒ Ｓ ｉ ｃｓＨａ ｎ１０ ７ ， ｈｎ ｌ ｉ ｅ Ｆ ｈｉ Ｒ ｃ ｎ ｉｔ Ａｃ ｏ ｈｙ ｅ ｂ ａ
关 键 词 ： 卫 星 ； 丙 烯 酰胺 凝 胶 电泳 ； 染 微 聚 银
中图 分 类 号 ： ５ Ｑ７ １ 文 献 标 识 码 ： Ａ
Ｔ ｅＥ ｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓ ｍｐ ｒｓｎ ｏ ｃ ｏ ａｅ ｉ ｒ ｄ ｃ ｉｇＤｅ ａｕ ｉｇａ ｄＮｏ ｅ ｈ ｌ ｒ ｐ ｏ ｅｉ Ｃｏ ａ ｉ ｆ ｃ ｓ ｏ Ｍｉｒ ｓ ｔｌｔ Ｐ ｏ ｕ ｔ ｎ ｎ ｔ ｒｎ ｎ ｖ ｌ ｌｅ Ｕｓ
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摘 要： 用哲 罗鱼 的微卫星引物对哲 罗鱼 的 ２个微卫星位点进行 Ｐ Ｒ扩增。将扩增 ＰＧ） 银染后发现微卫星扩增 产物在二者上的电泳结果存在 明显差异。在非变性凝胶 中存
在较多非特异条带 ， 而在 变性凝胶 中微卫星扩增产物条带清晰 ， 于鉴定 。 易
第２ ３卷第 １ 期
水 产
学
杂 志
Ｖｏ ． ３． ． １ ２ Ｎｏ １
Ｍ ａ ．２ ０ ｒ ０１
２ １ 年 ３月 ００
ＣＨＩ ＮＥＳ ＯＵＲＮＡＬ Ｆ Ｓ ＲＩ Ｓ ＥＪ ＩＨＥ Ｅ
文章 编号 ：０ ５ ３ ３ （ ０ ０）１ ０ １ — ４ １０ —８ ２２ １ ０— ０ １０