鼠疫病原学及鼠疫实验室管理和运行资料

（1）取材前应准备好取材的所有器械、试剂和容器等， 如剪刀、镊子、手术刀、骨钳、穿刺针、注射器、生理 盐水、酒精、灭菌广口瓶、试管等。以及消毒处理、个 人防护的器械和药品等；
（2）取材应选取病变损害最明显的部分采集。肝、脾、 肺分别置于灭菌广口瓶中，心血置于灭菌试管中；取口 腔和鼻腔分泌物于灭菌试管中；若尸体已腐败，可取股 骨、胫骨、胸骨、肋骨骨髓。
培养基的最适pH值为6.9～7.1，但是pH值在5.8～8.0范 围内鼠疫菌均可发育。 鼠疫菌虽然在普通培养基上生长良好，但是发育缓慢， 一般需要24～48小时才能形成肉眼可见的灰白色小菌落， 如果培养基质量差或者接种菌量过少，发育至成熟菌落的 时间将会更长。
鼠疫菌在普通培养基上的发育，其群体形态具有一定 的稳定性，在最适温度条件下在普通培养基上经16～18小 时培养可见形状不一，呈碎玻璃样小菌落，24～48小时后 形成肉眼可见灰白色小菌落。在显微镜下，成熟的菌落中 心发暗、突起，有黄褐色粗糙颗粒，菌落周边围绕一圈宽 窄不等、边缘不整、薄而透明的锯齿状花边。鼠疫菌的这 一发育过程及成熟菌落的形态特点，是细菌学诊断的重要 依据。
（4）取材时注意每取完一个脏器后均应将剪刀、镊子经来 苏尔棉块、清水棉块、干棉块一一擦拭干净，用火焰灼烧， 最后沾酒精过火焰冷却后备用； （5）病、死动物的材料应采取两份，一份自检，一份送自 治区疾控中心鼠防科复检。 2.2 活体动物的取材：捕获活体动物原则上只采取肝、脾 或有病变的组织进行检查。每份材料需独立存放于灭菌小 瓶内。
三、鼠疫病原学检验
（一）鼠疫细菌学检验和鉴定程序 常规的鼠疫病原体检验包括：菌体形态检查、细菌 培养、鼠疫噬菌体裂解试验和动物试验四步，通称“四 步检验”。
Ⅰ 鼠疫菌体形态检查
1 涂片 在收集到检验材料之后要尽快地涂片，剪取腺体 、肝、脾、肺、心，用脏器切面在洁净载玻片上压印，或 取骨髓、脑脊液及各种渗出液、痰等用接种环直接涂片， 或挑取可疑菌落用生理盐水研磨涂片。 2 固定 在紧急情况下，允许加热固定，但如果用甲醇（ 或95%酒精或95%酒精和乙醚各半）固定，可以促进鼠疫菌 两端浓染效果更好，并能杀死鼠疫菌。将可疑鼠疫材料涂 抹在载玻片上，晾干或制成压印涂片，浸在固定液中，固 定5～10分钟，取出晾干染色。
（三）检验标本（菌种）的包装与运输 1）准确详细填写送检单。应包括：标本（菌种）种类、 标本（菌种）数量、采集地点、采集时间、采取标本名称 、采集者、送检者、菌种检验者、菌种检验时间、送检单 位等。 2）按照国家生物安全的相关规定，将装有材料的容器（ 试管、小瓶等）用石蜡或胶布密封，外裹以塑料布，再用 浸有消毒液的棉花包裹后装入特制的容器内并附上详细送 检报告单，指派2名人员（其中1名为专业人员）用当地最 快的交通工具运送。
4 镜检 在显微镜下，查找典型鼠疫菌，即两端钝园、两 极浓染、卵园形，革兰氏阴性小杆菌（菌体长1～2um,宽 0.5～0.7um）。显微镜标本对鼠疫菌的鉴别诊断有一定帮 助，仅根据鼠疫菌的形态，不能做最后确诊。
Ⅱ 细菌培养 鼠疫菌培养可根据待检标本的种类和新鲜程度选用不 同的培养基进行分离培养，腐败材料最好经皮感染实验动 物，待接种动物死亡或7日处死后取材培养。 1 培养基:培养基是细菌培养获得准确结果的基础,必须在 营养成分、酸碱度、透明度及高压灭菌等方面严格把关。 并进行质量控制。
1）疑似患者的材料: ① 淋巴腺穿刺液：在含菌量高时，用白金耳划线培养， 如已用生理盐水稀释的穿刺液，则必须充分振荡，然后用 白金耳做划线培养。或用毛细管滴于培养基表面1～2滴， 再用白金耳划线。 ② 痰：痰的培养以稀释培养法较宜。用棉签采取的咽喉 分泌物可直接涂于培养基。 ③ 血液：直接培养。将 1 ml 血液加入 5 ml 肉汤内，培养 24小时后，再用白金耳取出，培养在平板上。 ④ 脓汁：培养法同痰液。
（ 1 ）用 3% 来苏尔液消毒解剖部位的皮毛，但不宜过湿， 以免来苏尔液进入体内，影响检验结果； （ 2 ）取材时应选取病变明显处取材，主要是腹股沟肿大 的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和心血等。 （ 3 ）若脏器腐败或残缺不全，则应取骨髓检验，其方法 是剥去骨外肌肉，再用酒精棉包裹，然后在近股骨头端用 骨钳剪断，以接种针取红骨髓检查。如骨髓已干枯，可用 灭菌注射器注入少许生理盐水抽取之，或将另一端打开， 用生理盐水直接冲入平皿内培养。
（二） 培养特性： 鼠疫菌为典型的异养菌，生长时需要多种有机物作为营养物 质，不过普通培养基就能满足鼠疫菌的生长。 鼠疫菌为需氧菌，也能在厌氧条件下生长，但适量供氧生长 最好，氧压过高反而对生长有害。在厌氧环境生长时，发育缓慢 且常出现变形。 鼠疫菌最适生长温度为28～30℃，在此温度下培育的菌落表 面干燥，易于用白金耳从培养基表面刮取，也较容易均匀地悬浮 在生理盐水中。在37℃条件下生长缓慢，培养出的菌落表面湿润、 粘稠，不易刮取，不易制成均匀菌悬液。
细菌学监测中常用培养基有： 1）营养琼脂培养基： 一般市场有售，按说明溶解于蒸馏水中，按一定量分 装克氏瓶内，15磅30 min高压灭菌后倒制平板备用。
2）LB培养基： 胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化钠 5 g、琼脂粉6 g （不同生产厂家的琼脂粉加量不同，需做预试验确定加入 量）、蒸馏水1 000ml。 制备时将所有成分加热溶解，用1 N氢氧化钠将pH调 至7.2；分装克氏瓶内，每瓶约300 ml； 15磅30 min高压 灭菌；待克氏瓶中培养基冷却至50℃左右，无菌条件下倒 制平板，每个平板倒入约15 ml，分离细菌时使用。
（二）鼠疫检验材料的保存 鼠疫材料的检验应遵循就近检验的原则，但在无条件时， 应采取以下方法妥善保存检验材料。
1 组织块的保存： （1）将组织块保存于生理盐水中，用石蜡密封容器，可保存 几日。 （2）将组织块保存于中性甘油保存液（中性甘油20 ml，蒸馏 水80 ml，碳酸钙2g）。将1～2 cm3的脏器小块放入5～10 ml 上述保存液中，可保存数日。
3 染色 分别用革兰氏染液、美兰染液进行染色。 1）革兰氏染色 将结晶紫染液加于已固定的标本上，染1分钟； 水洗后用卢戈氏碘液染1分钟； 水洗后用95%酒精脱色约0.5～1分钟，将玻片轻轻摇动直 到无紫色继续脱落为止； 水洗后用稀释石碳酸复红复染1分钟，水洗待干。 2）美兰染色 将染液加在已固定的涂片上，染3～5分钟，然后再水 洗，待干，镜检。
2 动物标本材料的采集:动物标本材料取材前必须做详细登 记，主要记录动物名称、捕获地点、捕获时间、捕获数量 和采集者等信息数据。取材时可根据标本的类型采取相应 的方法。
2.1 病、死动物的取材:病、死动物标本取材的原则是按先 皮下、后胸腔、最后腹腔的顺序进行取材，并在取材时观 察皮下淋巴结及各脏器的病理变化。取材注意以下事项：
（3）疑似败血型鼠疫患者:该型患者除采静脉血1 ml以上 保存于无菌试管送检外，还应采集咽喉分泌物进行检验。 1.2 密切接触者取材 : 一般采用灭菌棉签自咽喉部取材检 查，同时可采取淋巴穿刺液。
1.3 疑似鼠疫尸体的取材 : 经流行病学调查和临床检查， 不能排除鼠疫的尸体应以细菌学检查作为最后诊断，取材 方法以解剖取材为主，不能解剖取材的可行局部解剖取材 或穿刺取材。取材时注意以下事项：
（3）如不能进行尸体解剖时，可行局部取材。可在尸体的 肝、脾、肺相应部位做局部小切口，采集相应的组织材料； （4）对鼠疫尸体在不能进行解剖取材时，也可行穿刺取材。 方法是将要行取材的淋巴腺、肝、脾、肺、心等脏器组织 部位皮肤经局部 70% 酒精消毒后，用腰椎穿刺针抽取淋巴 腺、肝、脾、肺、心等脏器组织液和心血，分别保存备检。 若尸体腐败时，则应从胸骨柄或髂骨抽取骨髓液送检。
（ 3 ）野外采集脏器材料时常将组织块放入中性油脂保存 液（液体石蜡 1 份；羊毛脂 1.5 份；凡士林或固体石蜡 1 份）。加热混匀后，置小广口瓶中高压灭菌后备用。 操作时应注意先将保存液溶化，待温度降至不烫手时 （约40～45℃）倒入放置脏器块的小瓶内，保存液应将脏 器块完全覆盖。该保存液在低温下保存时限不应超过一周。
2.3 昆虫材料的采集：可进行鼠疫检验的昆虫材料包括： 蚤类、蜱类、螨类、吸虱等，其中以蚤类为重点。在进行 昆虫标本材料采集时需注意以下事项：
（1）宿主动物要单只装袋，并注明采集时间、地点、宿主 名称和生境等。 （2）同体或同穴的昆虫在分类鉴定后，分组或单只拣入装 有蚤类保存液1/20万龙胆紫2%盐水的小瓶内送检。
2）尸体材料: ① 脏器：根据不同的脏器材料，采取不同的培养方法， 并做好详细标记。 用灭菌剪刀剪下一小块脏器材料，以镊子夹住，直接 点于培养基靠边处,然后用白金耳划线。 ② 骨髓：一般以接种针采取骨髓，直接划线培养。
3）病死鼠脏器材料: 培养的原则是单只培养、单只接种。 将新鲜脏器切面直接点种于琼脂平板靠边处，然后用 白金耳划线培养。点种后的脏器制成悬液接种试验动物。 对于较腐败的死鼠脏器，可直接用白金耳从脏器切面上取 材划线培养，或通过小白鼠后再进行细菌培养。
②如腺肿过小取组织液困难，可用无菌注射器抽取0.3～ 0.5ml灭菌生理盐水注入腺肿内，停留片刻后，再缓慢抽 取液体； ③如腺肿开放或有波动感，应在腺肿周围浸润部位穿刺 抽取组织渗出液。
（2）疑似肺鼠疫患者: ①疑似鼠疫患者如有咳痰时，应用无菌试管、平皿或广 口瓶收集痰液； ②患者无痰时用无菌棉签取咽喉分泌物装入无菌试管内 送检。
2 蚤类标本的保存： （1）活蚤的保存：将活蚤置于清洁的试管或小瓶中，用白 布封好瓶口。并放入几片无味的绿草，管底放少许干沙或 干燥的滤纸块（厚度约1 cm）置于阴暗处，避免接触消毒 液及有毒气体。
（2）保存液法：将蚤放入1/20万龙胆紫盐水中保存， （配方为2%氯化钠100 ml中加入1:1 000龙胆紫液0.5 ml ）。
二、鼠疫检验材料的采集、保存和运输 （一）鼠疫检验材料的采集： 1.人体标本材料的采集：凡疑似鼠疫患者，应争取在服用抗 菌药物前采取被检材料标本，各型鼠疫患者除采静脉血液 3～5 ml供细菌学及血清学检验用外，可按临床类型采取以 下检验材料标本. 1.1 疑似鼠疫患者和密切接者的取材： （1）疑似腺鼠疫患者： ①选取肿大淋巴结，局部皮肤经碘酒、酒精消毒后用注射器 刺入腺体中央，抽取适量组织液，保存于灭菌试管中或直接 培养在斜面或平板上；