鼠疫实验室检测技术

扩增出16SrRNA基因 基因396bp片段加载体重组而成，产物 片段加载体重组而成， 扩增出 基因 片段加载体重组而成 长度645 bp ，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。 使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。 长度 应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠 方法来检测鼠疫菌， 应用多重 方法来检测鼠疫菌 疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别， 疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具 有较高特异性。 有较高特异性。
GICA双抗体夹心法—测抗原
标本 T区：特异性单 克隆抗体 (F1McAb)
吸水纸
G区：金标特异性抗体 (鼠型F1McAb)
C区：羊抗 小鼠Ig
免疫荧光技术(IFT)
标记物-荧光素(如异硫氰荧光素 FITC) 荧光素标记抗体检测相应抗原-直 接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰 为异硫氰 酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体 单克隆抗体。 酸荧光黄标记鼠疫 单克隆抗体。 方法：固定好的玻片标本用1%牛 方法：固定好的玻片标本用 牛 血清PBS浸洗 分钟，流水冲洗。 浸洗5分钟 血清 浸洗 分钟，流水冲洗。 适量（ 用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧 适量 ） 光染色，室温作用30分钟 分钟， 光染色，室温作用 分钟，流水 冲洗。干燥， 冲洗。干燥，荧光显微镜油镜观 察，鼠疫菌染上翠绿色荧光 Yersinia pestis 免疫荧光染色
多重PCR扩增结果
鼠疫PCR 鼠疫多重PCR
Baidu Nhomakorabea
内部对照质粒与不同浓度EV菌 PCR扩增结果 多重PCR扩增结果
鼠疫菌质粒检测
鼠疫菌的三个寻常质粒： pPCP1— 6Mda(9.5kb) 编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素 原活化因子； pCD1—45 Mda(70kb)编码Ⅲ型分 泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV 及一系列耶尔森菌特有的Yops； pMT1— 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。 91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY—长 度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码Ⅳ 型分泌系统的基因。 质粒DNA提取---碱裂解法和热裂解法 质粒电泳分析
RIHA微量法结果：
酶联免疫吸附试验(ELISA)
测抗体. 测抗体
双抗原夹心法：F1抗原包被反应板， 双抗原夹心法： 抗原包被反应板， 抗原包被反应板 加入待测标本28℃反应1.5h洗板， 洗板， 加入待测标本 ℃反应 洗板 加入HRP-F1抗原 ℃反应 洗板， 抗原28℃反应1h洗板 洗板， 加入 抗原 加入底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min后加 加入底物 蔽光反应 后加 终止液(2mol/L硫酸 。 硫酸)。 终止液 硫酸 间接法： 已知F1抗原包被反应板 抗原包被反应板， 间接法： 已知 抗原包被反应板， 加标本37℃反应1h洗板，加入酶标 加标本 ℃反应 洗板， 洗板 二抗37℃反应1h洗板 洗板， 二抗 ℃反应 洗板，加入底物 (如OPD或TMB)蔽光反应 蔽光反应30min显 如 或 蔽光反应 显 色后加终止液。 色后加终止液。 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每 孔的吸光度值(A) 孔的吸光度值 测抗原 双单抗夹心法： F1-McAb包被反应 双单抗夹心法： 包被反应 加入标本28℃反应1.5h洗板，加 洗板， 板，加入标本 ℃反应 洗板 洗板， 入HRP-F1McAb 28℃反应 洗板， ℃反应1h洗板 加入底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min后加终 加入底物 蔽光反应 后加终 止液。 止液。 双抗体夹心法(改良法 美国CDC鼠疫 改良法-美国 双抗体夹心法 改良法 美国 鼠疫 诊断技术实验室操作手册)：鼠疫免疫 诊断技术实验室操作手册 ： 血清特异性抗体( 包被反应板， 血清特异性抗体 F1Ab)包被反应板， 包被反应板 加标本37℃反应1h洗板 洗板， 加标本 ℃反应 洗板，加小鼠 F1McAb 液37℃静置 洗板，加 洗板， ℃静置1h洗板 HRP标记的羊抗小鼠 标记的羊抗小鼠IgG 37℃反应 标记的羊抗小鼠 ℃反应1h 洗板,加底物 洗板 加底物OPD蔽光反应 蔽光反应30min显色， 显色， 加底物 蔽光反应 显色 加终止液。 加终止液。 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的 吸光度值(A) 吸光度值
鼠疫噬菌体试验
在培基上密集平行划线培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴 于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线 自然流下，置20℃培养24h,有明显的噬菌带。 在18~22℃鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假 结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异 性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。 鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作 细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右 即可获得结果。 分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫 菌。
鼠疫PCR反应体系
PCR反应体系 总量 反应体系(总量 采用其它总量时， 反应体系 总量25µl)采用其它总量时， 采用其它总量时 下列配方按比例改变。 下列配方按比例改变。 13.5µl 无菌去离子水 10×反应缓冲液 2.5µl × 4×dNTP混合物（每种 混合物（ 2µl × 混合物 每种2.5mM） ） 引物（ 、 、 、 ） 引物（1F、1R、2F、2R） 各1µl 内部对照模板(IC) 1µl 内部对照模板 1µl 待测标本 Taq DNA 聚合酶 1µl
一、鼠疫菌菌体形态检查
典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长 典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长1~2µm，宽 ， 0.5~0.7µm,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染 中段膨大， 中段膨大 两端钝圆， 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。 革兰氏染色阴性。 革兰氏染色阴性。 染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压 印片，可见到两端钝圆、 印片，可见到两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫 压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌， 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（ 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红 ）、美兰染色 菌体染成兰色， 美兰染色（ 色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明 ）、姬姆萨染色 菌体染成色，荚膜染成色） 姬姆萨染色（ 显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）
胶体金免疫层析法(GICA)
检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以 GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。 双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗 (F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另 一株单抗(金标-F1McAb)显色。 双抗原夹心法测抗体： 双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1 抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1Ab)+金标记的 F1抗原(金标-F1Ag)显色。 夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫 抗原＋标 固定于膜上的鼠疫F1抗原 固定于膜上的鼠疫 抗原＋ 本中的相应抗体＋金标记的SPA显色。 显色。 本中的相应抗体＋金标记的 显色
Fluorescence antibody positivity is seen as bright, intense green staining around the bacterial cell
鼠疫菌特异性基因片断检测—PCR
目标基因：鼠疫菌的 和 特异性基因片段 目标基因：鼠疫菌的fra和pla特异性基因片段 引物序列和扩增产物的长度
间接红血球凝集试验(IHA)
鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化 处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原 致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试 验方法和结果判定均为常规操作。
IHA微量法结果：
反向血球凝集试验(RIHA)
用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1 抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。
鼠疫PCR
反应条件(扩增 预变性95℃ 反应条件 扩增) ：预变性 ℃ 5min，1个循 扩增 预变性 ， 个循 然后95℃ 环；然后 ℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 ， ℃ ， ℃ min，30个循环；最后 ℃ 5 min。共1小时 个循环； ， 个循环 最后72℃ 。 小时 40分。 分 电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5µl， 电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂 ，混均短 暂离心。 暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反 应产物8µl， 不超过5V/cm)电压 应产物 ，在80--100V(不超过 不超过 电压 缓冲液中电泳约1小时 下TBE缓冲液中电泳约 小时。凝胶成像仪读 缓冲液中电泳约 小时。 取结果并照相。 取结果并照相。
鼠疫菌染色检查(脏器压印片)
革兰氏染色 美兰染色
鼠疫菌染色
鼠疫菌涂片的革兰氏染色
鼠疫菌染色检查
Wayson stain(魏申氏 染色)呈现的两极浓染 特征 荚膜染色—墨汁负染色
二、鼠疫菌的培养特性
鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28℃ 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为 ℃，最适 pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原电位（Eh）约为 为 ，发育初期的最适氧化还原电位（ ） 100~150mV，接种后至少 以上才能形成肉眼可见的菌落， ，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落， 以上才能形成肉眼可见的菌落 一般24~48h形成肉眼可见的小菌落。 形成肉眼可见的小菌落。 一般 形成肉眼可见的小菌落 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。 ℃ 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37℃缺钙 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达 条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量 表现很强的表达 和分泌毒力蛋白V抗原 抗原（ ）。此现象称为低钙反应 和分泌毒力蛋白 抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受 ）。此现象称为低钙反应， 70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 质粒上的遗传基因控制。 质粒上的遗传基因控制 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养 光镜下呈透明的碎玻璃片状。 典型鼠疫菌培养 光镜下呈透明的碎玻璃片状 培养24h 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色， 以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗， 圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗 周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、 粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的 花边。 花边。
内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板 采用上述f1引物扩 为模板， 内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述f1引物扩 增出fra基因 基因249 bp片段，再以 片段， 基因引物： 增出 基因 片段 再以16SrRNA基因引物： 基因引物
F 5’-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3’ R 5’-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3’
目标基因 fra pla 引物序列 产物长度 249 bp 456 bp 1F 5’-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3’ 1R 5’-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3’ 2F 5’-ACTACGACTGGATGAATGAAAATC-3’ 2R 5’-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3’
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
典型鼠疫菌菌落形态 噬菌带
鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验
鼠疫菌培养特征 鼠疫噬菌体试验
三、鼠疫F1抗原、抗体检测
鼠疫F1抗原检测 鼠疫F1抗体检测 1.反向血球凝集试验(RIHA) 1.间接血球凝集试验(IHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 4.免疫荧光技术(IFT)
鼠疫实验室检测技术
鼠疫实验室检测
针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性 的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养 及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营 养需求、毒素检测、毒力测定等。 针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1 抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。 针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒 检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫 菌全基因组测定；插入序列的检测。