茶多糖的纯化及结构分析

茶多糖的纯化及结构分析

周裔彬1,2　汪东风2　宛晓春1　杜先锋1

(1安徽农业大学食品科学与工程系茶叶生物化学重点实验室　合肥　230036;

2中国海洋大学食品学与工程学院　青岛　266003)

摘　要　从茶多酚生产的下脚料中,通过有机溶剂洗涤和凝胶色谱分离,得到一种水溶性多糖。经高效液相色谱分析,为单一茶多糖,其相对分子量为(10～1015)×105;气相色谱分析表明,糖基由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和鼠李糖组成,其摩尔比为6197∶5134∶8111∶2176∶1114;比色法测其总糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量分别为90%、8152%、27165%。红外光谱和核磁共振分析表明,该多糖是由单糖通过β2糖苷键连接的,多糖链上络有糖醛酸、氨基或蛋白基团,同时含有α和β异头碳;x2衍射分析显示,随多糖纯度的提高,茶多糖更易结晶,且有不同的晶体聚合物出现;DSC的分析表明,随茶多糖纯度的提高,热焓增加,峰温向高温漂移。

关键词　茶多糖复合物　纯化　结构分析

Puri fication and Structural Analysis of T ea Polysaccharide

Zhou Y ibin1,2,Wang D ong feng1,Wang X iaochun1,Du X ianfeng1

(1K ey Laboratory of T ea Biochemistry,Department of F ood Science and Engineering,

Anhui Agricultural University,Hefei230036;

2Institue of F ood Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao26603)

Abstract　A water s oluble tea polysaccharide was obtained by washing with organic s olvents and is olating with gel chromatographic separation from the byproduct of tea polyphenols.A single peak of tea polysaccharide(TPS)with the relative m olecular weight(10～1015)×105was identified by HP LC.The results of G C indicated that TPS consists of glucose,galactose,arabinose,mannose and rhanose with a m olar ratio of6197∶5134∶8111∶2174∶1114;the content of total saccharide,protein and acid polysaccharide were90%,8152%and27165%,respectively.The result of IR and13C NMR showed that TPS was com posed of m onosaccharide linked byβ2glycosidic bond,there were uronic acids,amido or proteinic groups andαandβis omer in the polysaccharide chain.The analysis of x2diffraction indicated that TPS easily crystallized and formed the different crystallization as raising the purification of TPS.The analysis of DSC showed that the enthalpy and the peak tem perature of TPS increased with the purification.

K eyw ords　T ea polysaccharide,Purification,S tructural analysis

茶多糖主要存在于粗茶叶或茶多酚生产的下脚料中,是一种复合多糖[1,2]。目前,茶多糖的提取、纯化、组成、结构分析及生理活性等方面的研究报道所利用的茶多糖原料均来自各种茶叶[3,4]。本文以茶多酚生产中的下脚料为原料,通过纯化,对其纯度、分子量、组成、结构及结晶性、热力学等性质进行分析,以期为茶多酚下脚料的开发利用以及对茶多糖的深入研究和应用提供参考。

1　实验部分

111　材料和主要仪器

茶多糖自海南群力茶叶生化公司购得。

标准单糖、标准葡聚糖21(Dextran21,MW:190,000～230,000)、Dextran22(MW:66,700)、Dextran23

国家自然科学基金项目(20776002)资助

2007206217收稿,2008201221接受

(MW:15,000～20,000)、Dextran24(MW:10,500)、Blue Dextran(MW:2,000,000)、交联葡聚糖(凝胶) SephadexG2150、Sepharose24B和葡萄糖醛酸均为Sigma公司产品。甲苯氨蓝(Amresco公司),考马斯亮蓝G2250(Fluka公司);其余均为市售分析纯试剂。

BSZ2160自动部分收集器,Agilent1100series高效液相色谱,Aglient6890N气相色谱仪,NETZSCH 200PC差示扫描量热仪,日本DΠMax2Y B型X2衍射仪,Nicolet170SFT型红外光谱仪,Varian Infinity plus 300W B固体核磁共振谱仪,Bruker DRX300MH z核磁共振谱仪。

112　实验方法

11211　茶多糖的粗提[6,7]和茶多糖纯化　把粗茶多糖充分溶解于去离子水中,离心除去沉淀。在得到的上清液中加入60%无水乙醇,搅拌、静置、离心取沉淀;而把上清液浓缩后再次加入85%无水乙醇,搅拌、静置、离心取沉淀。把两次沉淀合并,用无水丙酮和无水乙醇反复洗涤,然后于真空下干燥备用,可得60±015%的茶多糖样品。

取上述茶多糖配成1%浓度,先用SephadexG2100洗脱,洗脱液经285nm检测,取吸收峰附近的10管,用苯酚2硫酸法测各管的含量,确定主要多糖的洗出时间。将收集的主要茶多糖洗液浓缩,再经Sepharose24B洗脱,将峰值部位的一管样液分步收集、浓缩真空干燥,可得90±015%的茶多糖样品,此样品进一步纯化,经苯酚2硫酸法测定[5],其含量略有下降。

11212　茶多糖纯度和分子量的测定[8]　将5种标准的不同分子量的葡聚糖Dextran21、Dextran22、Dextran2 3、Dextran24和Blue Dextran分别配成1%的母液,各取1m L母液混合后定容至100m L,所得样液浓度为0104%。把经上述纯化的茶多糖同样配成相同的浓度。在样品经过<0145μm水膜后,直接经G4000FWX L(718×30cm)柱进行差示检测,进样量10μL,柱温75℃,流动相为超纯水,流速014m LΠmin,柱压14bar。

将标准混合液所得到的保留时间(R

)与已知分子量按lg(MW)2R T绘图,得标准分子量与保留时间

T

方程;根据相同条件下得到的茶多糖保留时间,按标准方程求出茶多糖的相对分子量。

11213　茶多糖的组成分析[8,9]　以酪蛋白为标准,采用考马斯亮蓝染色法测蛋白含量;以葡萄糖醛酸为标准,硫酸2咔唑法测糖醛酸含量。标准单糖、多糖糖基的水解物及衍生采用糖腈乙酸酯衍生物气相色谱法,色谱条件:DB225毛细管柱(30m×0132mm×25μm),火焰离子化检测器(FI D),载气(N

)流速为

2

1m LΠmin,柱温从160℃程序升温(5℃Πmin)至250℃。

113　茶多糖的结构分析

11311　茶多糖的红外测定[10]　用K Br压片,扫描范围为4000～400cm-1。

11312　茶多糖的13C NMR测定[11,12]　固体13C CPΠMAS NMR的实验条件为410mm固体核磁探头,转速18kH z,1HΠ19F100W功放,X核1000W功放,相位分辨率为0125°,频率分辨率为011H z,采样速率为8MH z,发射、接收切换为011μs,单脉冲延迟采样定量分析(1pda)。

液态13C NMR的分析条件是以重水(D2O)作溶剂,四甲基硅烷为内标样,采样时间为1103s,脉冲延迟8s,共振频率为75147MH z,脉冲角为65°。

11313　茶多糖的x2衍射测定[13]　宽角度x2射线粉末衍射的实验条件是电压100kV,电流50mA,x2射线管为铜对阴极(CuKα),Ni为过滤器,入射波长01154nm,扫描速率4°Πmin,发射狭缝013mm,防发散狭缝1°,扫描步长0102°,扫描范围2θ为5～35°。衍射图中的结晶区和无定形区(非结晶区)采用OriginPro715软件分析。

11314　茶多糖的热特性分析[14]　经真空干燥了的茶多糖样品先在含P2O5的干燥皿中放置2周,然后用70μL铝锅精确称取20mg样品,再用压盖机密封,以一个空铝锅作参照样。测量前用铟校正DSC仪,升温速率为5℃Πmin,扫描温度范围为30～160℃,吹气速度为20～30m LΠmin,保护气速率为60～70m LΠmin。

2　结果与讨论

211　茶多糖的纯度及组分分析