微生物检验其他革兰阴性杆菌及检验

第二十六章其他革兰阴性杆菌及检验本章考点：1.概述：概念2.嗜血杆菌属●生物学性状●临床意义●微生物学检查3.军团菌属、鲍特菌属、布鲁菌属一、嗜血杆菌属（一）简述：嗜血杆菌属是一类无动力、无芽胞的革兰阴性小杆菌，常呈球杆状，有时呈杆状、长丝状等多形态。

嗜血杆菌属包括16个菌种，其中与临床有关的为9个种，即流感、副流感、溶血、副溶血、嗜沫、副嗜沫、杜克、埃及、迟缓嗜血杆菌。

嗜血杆菌须在人工培养基中加入新鲜血液才能生长，故称嗜血杆菌。

因新鲜血液中含有X和V因子。

X 因子是血红蛋白中的一种血红素及其衍生物，为高铁血红素，是细菌合成过氧化氢酶、过氧化物酶、细胞色素氧化酶的辅基。

V因子是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），存在于血液和某些植物组织中，是脱氢酶的辅酶。

（二）流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌，简称流感杆菌，不是流感的病原菌。

1.生物学性状：（1）形态与染色：大小为（1.0～1.5）μm×（0.3～0.4）μm。

急性感染标本，如脑脊液中多为短小球杆菌，恢复期病灶或长期人工传代培养后可呈球杆状、长杆状、丝状等多形态性。

毒力株（粘液型菌株）在营养丰富的培养基上，6～8h有明显荚膜，在陈旧培养物中荚膜消失。

无鞭毛，无芽胞。

革兰染色阴性，但着色较浅。

用石碳酸复红或美蓝单染色，呈现两端浓染现象。

（2）培养特性：需氧菌。

最适生长温度为35℃，最适pH为7.6～7.8。

初次分离培养时，最好在5%～10%C02环境中，以促进其生长。

在普通培养基中须加入X和V因子，才能生长。

血液中的V因子通常处于抑制状态，经80℃～90℃热10min破坏红细胞膜上的不耐热抑制物，可使V因子释放，故流感嗜血杆菌在巧克力琼脂平板上生长较佳。

培养18～24h后生长直径为0.5～0.8mm、圆形、光滑、湿润、边缘整齐，呈露滴状的小菌落。

48h后可形成直径1.0～1.5mm灰白色较大的菌落。

有荚膜菌株的菌落呈轻度粘稠。

当流感嗜血杆菌与金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上共同培养时，由于后者能合成较多的V因子，可促进流感嗜血杆菌的生长。

因此，在葡萄球菌菌落周围生长的流感嗜血杆菌菌落较大，离葡萄球菌菌落越远的菌落越小，此称为卫星现象，这有助于对流感嗜血杆菌的鉴定。

在液体培养基中，有荚膜的菌株呈均匀混浊生长，无荚膜的R型菌株则为颗粒状沉淀生长。

（3）生化反应：本菌对糖发酵不稳定。

一般分解葡萄糖只产酸，不分解乳糖或甘露醇，对麦芽糖、蔗糖或糊精的发酵不稳定。

所有菌株还原硝酸盐。

有荚膜菌株产生吲哚。

典型菌株不溶血。

产生自溶酶，可被胆汁溶解。

根据流感嗜血杆菌产生吲哚，尿素酶及鸟氨酸脱羧酶反应，将其分为8个生化型。

2.致病性：致病物质为内毒素、荚膜、菌毛和酶类。

主要通过呼吸道感染，引起原发性或继发性感染。

原发性感染多由b型荚膜强毒株引起，为急性化脓感染，如脑膜炎、鼻咽炎、咽喉会厌炎、化脓性关节炎、心包炎及败血症等。

继发感染主要在流感、麻疹、百日咳、肺结核等感染后发生，多为无荚膜菌株引起。

如慢性支气管炎、中耳炎、鼻窦炎、肺炎等。

3.微生物学检验（1）标本采集：根据感染部位不同采集标本，如痰液、脑脊液、鼻咽分泌物及脓液等。

（2）检验方法1）直接镜检：痰液、脓液等标本可直接涂片，脑脊液可取离心沉淀物涂片，革兰染色镜检。

如查到革兰阴性短小杆菌或多形态杆菌，结合临床症状，作初步诊断。

2）分离培养与鉴定：将血液、脑脊液标本先增菌培养后，再转种巧克力琼脂平板或选择性巧克力琼脂平板，经37℃培养24～48h。

根据菌落形态、涂片染色、卫星现象，X、V因子需求与否，定种，再作生化试验和荚膜肿胀试验分型。

3）如何提高流感嗜血杆菌的阳性率：①初次培养应在5%～10%C02环境。

②生长需要X、V因子，故在培养基中应添加此因子。

③应用选择性培养基，如巧克力琼脂中加一定量抗生素，1ml培养基中含万古霉素50μg，杆菌肽300μg，氯林可霉素1μg，嗜血杆菌分离率可达96.7%。

4.治疗：若β-内酰胺酶阴性则首选氨苄青霉素、阿莫西林，次选TMP-SMZ，二、三代头孢菌素，红霉素，氨曲南，β-内酰胺酶阳性提示对青霉素，氨苄西林和阿莫西林耐药。

（三）其他嗜血杆菌二、军团菌属1.命名和分类：1976年在美国费城召开的全美退伍军人会议期间，暴发流行一种严重肺炎，与会者149人，有34人死亡。

从死者肺组织中分离到一种新菌，1978年美国疾病控制中心将其命名为军团菌。

《伯杰系统细菌学手册》（1984）定为军团菌科，军团菌属。

目前军团菌属包括39个种和61个血清型，从人体分离的已有19种，其中主要致病菌为嗜肺军团菌。

2.生物学性状：为一群革兰阴性杆菌，常规染色不易着色，有端生或侧生鞭毛。

无芽胞。

属需氧菌，氧气含量减少时，生长速度减慢。

最适生长温度为36℃，在含有2.5%～5%C02环境中生长良好，营养要求较苛刻，且生长缓慢，初次分离需L-半胱氨酸，培养基中含铁盐可促进生长。

在费-高（F-G）培养基上，培养3-5天可见针尖大小的菌落，在紫外线照射下可发黄色荧光，菌落周围呈现褐色。

在活性碳-酵母浸出液琼脂（BCYE）培养基中培养3～5天形成1～2mm圆形凸起，灰白色有光泽的菌落。

本属细菌触酶阳性，部分菌株氧化酶阳性，不分解糖类，多数菌株产β-内酰胺酶。

本菌具有0、H抗原，H抗原无特异性，0抗原具有特异性。

本菌在自然界广泛存在，人工管道的水源中常存在此菌，如医院空调冷却水中常有此菌，对常用化学消毒剂敏感。

3.微生物学检查：合理采取相应标本，如下呼吸道分泌物、胸水、活检肺组织及血液等。

直接涂片意义不大。

胸水和下呼吸道分泌物，可以直接接种于活性炭-酵母浸出液琼脂。

血液标本可接种于双相培养基。

组织标本应先以无菌手续研磨制成标本悬液后接种。

环境中的标本先离心浓缩后接种，也可将标本先感染动物，然后将脏器研磨分离培养，将分离培养后的菌落进行革兰染色镜检，进行氧化酶和触酶试验，明胶液化试验及β-内酰胺酶试验。

也可利用PCR技术及荧光抗体染色进行鉴定。

由于该菌营养要求很苛刻，培养难度相对较大，故临床上常利用血清学诊断方法检测军团菌抗体IgG、IgM。

但军团菌的血清学反应与其他一些细菌，如假单胞菌属等有交叉反应，应引起注意。

4.临床意义：军团菌主要为嗜肺军团菌引起军团病，轻症型类似流感，病人有发烧、头痛、无力等症状。

重症型是以肺部感染为主要特征，常导致多器官损害，最终导致呼吸衰竭死亡。

5.结果评价及治疗原则：从临床标本中，尤其是呼吸道标本中分离出军团菌，应确定为军团菌感染，应积极采取治疗措施，一般治疗方案为红霉素加氨曲南。

氨基糖苷类抗生素、青霉素、头孢菌素类抗生素对本菌无效。

三、弗朗西斯均属（略）四、鲍特菌属百日咳鲍特菌和副百日咳鲍特菌是百日咳的病原菌，为革兰阴性小杆菌，营养要求很高，血平板及巧克力平板不生长，常用鲍-金培养基进行分离培养。

具有多种毒素：即百日咳毒素、丝状血细胞凝集素、腺嘌呤环化酶毒素、气管坏死毒素、皮肤坏死毒素。

不发酵糖类，不产生H2S、吲哚，不液化明胶，不能还原硝酸盐，不能利用枸橼酸盐。

新分离的百日咳鲍特菌为光滑型称Ｉ相菌，具有菌体（O）抗原和荚膜（K）抗原，Ⅳ相菌相当于粗糙型，无荚膜，无毒力，Ⅱ、Ⅲ相为过渡相。

从Ｉ相到Ⅳ相的变异是形态、菌落、溶血性、抗原结构、致病力等全面变异。

该菌抵抗力弱，56℃30分钟、日光照射1小时可致死亡。

百日咳鲍特菌主要通过飞沫经呼吸道传播，引起百日咳。

传染源主要是早期患者和带菌者。

主要症状为阵发性剧烈咳嗽。

由于病程较长，故名百日咳。

病后或预防接种后，可获得持久免疫力，再次感染少见。

气管粘膜局部的sIgA抗感染作用重要。

五、布鲁菌属人畜共患感染性疾病的病原菌，革兰阴性小杆菌或球杆菌无动力，无芽胞和荚膜，需氧，对营养要求较高，在血琼脂平板上培养5～7天可形成微小、灰色不溶血菌落。

能利用葡萄糖等糖类，尿素酶阳性，硝酸盐还原试验阳性。

含有A抗原和M抗原。

检测：凝集反应，PCR检测，抗体检测。

临床意义：布鲁菌可通过人类皮肤、呼吸道和消化道进入人体而感染，引起人布鲁菌病，主要表现为菌血症。

进入人体后首先侵犯局部淋巴结，之后人血，再进入肝、脾、骨髓等器官，病人热型呈波浪热。

治疗：首选多西环素，次选TMP／SMZ，用药需4～6周。

本章练习题：军团菌病的传播是经A.食物B.空气C.血液D.皮肤接触E.动物媒介[答疑编号500735260101]『正确答案』B分离流感嗜血杆菌常用的培养基为A.血琼脂平板培养基B.巧克力琼脂培养基C.SS培养基D.TCBS培养基E.麦康凯培养基[答疑编号500735260102]『正确答案』B慢性波浪热患者分离布鲁菌阳性率最高的标本是A.血液B.粪便C.尿液D.痰液E.骨髓[答疑编号500735260103]『正确答案』E培养分离军团菌可以采用A.血平板B.罗氏培养基C.活性炭酵母浸液琼脂D.碱性平板E.沙保弱培养基[答疑编号500735260104]『正确答案』C对军团菌错误的是A.广泛存在于各种水环境中B.可以寄生在单核巨噬细胞内C.是引起医源性肺炎的常见病原菌D.治疗药物首选红霉素E.对外界环境抵抗力低[答疑编号500735260105]『正确答案』E白百破三联疫苗的组成是A.白喉类毒素、百日咳类毒素、破伤风类毒素B.白喉类毒素、百日咳死菌苗、破伤风类毒素C.白喉死菌苗、百日咳死菌苗、破伤风类毒素D.白喉死菌苗、百日咳死菌苗、破伤风死菌苗E.白喉类毒素、百日咳类毒素、破伤风死菌苗[答疑编号500735260106]『正确答案』B第二十七章衣原体及检验本章考点：一、概述（一）概念衣原体是一群体积较小，能通过细菌滤器，细胞内专性寄生，并有独特发育周期的原核细胞型微生物。

由于它具有一些与细菌类似的生物学特性，现归属于广义的细菌范畴。

（二）分类与命名1.传统分类法：按第九版Bergey细菌学分类手册，衣原体属于衣原体目、衣原体科、衣原体属。

二、生物学性状1.发育繁殖周期与形态染色：衣原体在宿主细胞内生长繁殖有独特的发育周期，可见到两种形态结构不同的颗粒。

（1）原体：呈球形或椭圆形，直径约0.3μm，外有胞壁，内含致密的核质，为成熟的衣原体。

姬姆萨染色呈紫色，Maechiavello染色呈红色。

在细胞外较为稳定，无繁殖能力，但有高度的感染性。

（2）网状体又称始体：呈球形或椭圆形，直径0.5～1μm，无胞壁，胞浆内无致密的核质，而有纤细的网状结构。

姬姆萨染色和Maechiavello染色均呈蓝色。

为衣原体发育周期中的繁殖型，代谢活泼，不能自胞外存活，无感染性。

衣原体原体和始体的性状比较衣原体的发育周期：2.抗原成分：衣原体的抗原性相当复杂，有属、种、型等特异性抗原。

（1）属特异性抗原：衣原体细胞壁LPS为属特异性补体结合抗原。