实验四 大肠杆菌发酵培养基的优化

四、比浊法测定发酵液菌浓
细菌培养物在生长过程中，由于原生质含量 的增加，会引起培养物混浊度的增高。细菌 悬液的混浊度和透光度成反比、与光密度成 正比，透光度或光密度可借助光电比浊计精 确测出，因此可用光电比浊计测定细胞悬液 的光密度（OD值），表示该菌在特定实验条 件下的细菌相对数目，进而反映出其相对生 长量。
本实验以菌体生物量为指标，用四因素三水 平的正交试验确定大肠杆菌的最优培养基。
实验步骤
一、培养基的配制
1.将酵母浸膏、蛋白胨、氯化钠作为培养基的主要影响因素， 每一因素设定3个水平，进行三因素三水平的正交试验，试验 设计如表1
表1 正交试验表设计
因素水平 A酵母浸 膏/% 1 0.2 2 3 0.5 0.8
结果
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
2）方法二 直观分析
直观分析法是通过对每一因素的平均极差来分析问题。 所谓极差就是平均效果中最大值和最小值的差。有了极差， 就可以找到影响指标的主要因素，并可以帮助我们找到最佳 因素水平组合。 极差的大小反应在所选择的因素水平范围内该因素对测定结 果影响的程度。极差大的因素在所选择的因素水平范围内对 测定结果的影响最大，在测试过程中必须严格控制。
因素 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 A 1 2 3 1 2 3 1 2 3 B 1 2 3 3 1 2 2 3 1 C
结果
（4）分析试验结果 ）
1）方法一：直接比较
因素 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1 2 2 2 3 3 3 A 1 2 3 1 2 3 1 2 3 B 1 2 3 3 1 2 2 3 1 C
OD值
大肠杆菌发酵培养基的优化
实验目的
1.掌握发酵培养基的配制方法 2.熟悉用正交试验优化发酵培养基的方法 3.学习比浊法测定发酵液菌浓的方法
实验原理
一、培养基的配制方法
1.确定培养基的基本组成 2.确定所用原材料的种类 3.确定所用原材料的浓度配比关系
二、培养基优化方法（原材料种类和浓度配比优化）
OD值
二、灭菌 锥形瓶培养基：标记，加棉塞、报纸包扎。 1ml移液管2支 121℃，灭菌20min
三、接种 将菌种（教师预先培养好）摇匀后用无菌移 液管吸取0.5ml悬液，接到每一组培养基中 （接种量要完全一样）
四、发酵 将三角瓶置于恒温摇床中，37℃， 120rpm培养12h
五、比浊法测定各发酵液OD值 取下摇瓶，以空白培养基为对照，于600nm 处测定各摇瓶中发酵液的OD值，填入表中。 注意：如果OD值过大，需将发酵液作一定稀 释后再测定。
B蛋白胨 /%
1(0.5) 2(1) 3(1.5) 1(0.5) 2(1) 3(1.5) 1(0.5) 2(1) 3(1.5)
C氯化钠 /%
1(0.2) 2(0.5) 3(0.8) 2(0.5) 3(0.8) 1(0.2) 3(0.8) 1(0.2) 2(0.5)
D pH
1(6) 2(7) 3(8) 3(8) 1(6) 2(7) 2(7) 3(8) 1(6)
1.单因素法 2.正交试验法 3.均匀试验设计
三、正交试验法
1.概念
利用已经设计好的表格--正交表--来安排试验并进 行数据分析的一种方法。 它是从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行 试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐 整可比”的特点，是一种高效率、快速、经济的 实验设计方法。
2.基本工具——正交表 记号：Ln（tm）
若某一因素k 或者k 最大， 若某一因素 3或者 1 最大，则说明所选择的该因素的水 平范围不合适， 对于因素C， 最大， 平范围不合适， 如：对于因素 ，k3最大，说明因素水平表 中所设计的最高水平0.6% 不一定为最佳。如果该因素的 值 不一定为最佳。如果该因素的R值 中所设计的最高水平 较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。 较大，影响较显著，则必须进行重复实验或对照实验。 其中对照实验条件应为： 其中对照实验条件应为： 试验1： 试验 ： A2 B2 C3 试验2： 试验 ： A2 B2 C4 C4应大于 3 应大于C 对照两者的结果，若试验1结果值大于试验 结果值大于试验2，则试验1 对照两者的结果，若试验 结果值大于试验 ，则试验 条件即为最优化条件。若试验2结果值大于试验 结果值大于试验1， 条件即为最优化条件。若试验 结果值大于试验 ，则应再改 变因素C的水平 继续做对照实验，直至达最佳结果。 的水平， 变因素 的水平，继续做对照实验，直至达最佳结果。
C
结果
X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9
(X1+X4+X7)/3 (X2+X5+X8)/3 (X3+X6+X9)/3
(X1+X5+X9)/3 (X2+X6+X7)/3 (X3+X4+X8)/3
极差
K最大- K最小
K最大- K最小
K最大- K最小
B ：然后对计算结果进行分析，分析各因素的主次和影响趋 势，找到最优试验方案。 比较RA 、RB、RC值，R值越大的因素，影响越大，控 制要越严格，R值越小的因素，影响越小。 对每一个因素，选择K值最大的水平为最佳条件。如对 于因素A 淀粉，若k2>K1>k3 ，即k2最大，根据因素水平表中 的设计，其水平为7%。表明7%为最佳的淀粉浓度。对于因 素B ，k2最大，对于因素C ，k3最大。 则实验的最佳实验条件为： A2 B2 C3，即最佳实验条件 为：淀粉为7%，黄豆饼粉5%，蛋白胨0.6%
B蛋白胨/% 0.5 1 1.5
C氯化钠 /% 0.5 1 1.5
D pH 6 7 8
2.按表2配制9组培养基入100ml锥形瓶中，每瓶25ml，（可四小 组分工合作）
表2 正交表实验方案
因素
实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9
A酵母浸膏 /%
1(0.2) 1(0.2) 1(0.2) 2(0.5) 2(0.5) 2(0.5) 3(0.8) 3(0.8) 3(0.8)
实验结果
填写正交实验表，分析数据，确定最优培养 基配方
表3 正交表实验结果记录及分析 因素
实验1 实验2 实验3 实验4 实验5 实验6 实验7 实验8 实验9 k1 k2 k3 极差R
A酵母浸膏 /%
1(0.2) 1(0.2) 1(0.2) 2(0.5) 2(0.5) 2(0.5) 3(0.8) 3(0.8) 3(0.8)
4.实验的基本步骤 （1）明确任务 确定指标 （2）制定因素水平表
1）确定因素（A、B、C……） 2）选择因素的变化范围 3）确定因素水平数 4）制定因素水平表 因素水平 1 2 3 A淀粉/% 5 7 9 B黄豆饼粉/% 3 5 7 C蛋白胨/% 0.2 0.4 0.6
（3）设计试验方案
1）选择正交表 2）表头设计（不混杂） 3）列出试验方案 4）进行实验
B蛋白胨ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ/%
1(0.5) 2(1) 3(1.5) 1(0.5) 2(1) 3(1.5) 1(0.5) 2(1) 3(1.5)
C氯化钠 /%
1(0.2) 2(0.5) 3(0.8) 2(0.5) 3(0.8) 1(0.2) 3(0.8) 1(0.2) 2(0.5)
D pH
1(6) 2(7) 3(8) 3(8) 1(6) 2(7) 2(7) 3(8) 1(6)
L：正交表的符号 n：表的行数（可安排试验的次数） t：表中的字码数（水平数） m：表的列数（最多可安排因素个数）
L8(27)
L9(34)
L16(45)
3.正交表的特点
试验点分布均匀、整齐可比 任何一列中各字码（水平）都出现，且出现的次 数相等 任何两列中各横行组成的数字对，包含着所有可 能的数字对，且各种数字对出现的次数相等
A： 首先计算各因素每个水平的平均效果和极差。
因素 实验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 1 1 1 2 2 2 3 3 3
(X1+X2+X3)/3 (X4+X5+X6)/3 (X7+X8+X9)/3
A 1 2 3 1 2 3 1 2 3
B 1 2 3 3 1 2 2 3 1