聚合酶链式反应扩增和扩增产物克隆
PCR扩增DNA片段及产物检测的方法20111123
聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段一、实验目的1．学习PCR基因扩增的基本原理和操作方法。
2．理解PCR基因扩增在分子生物实验技术中的重要性。
3．了解引物设计的一般要求。
二、实验原理多聚酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR )：原理类似于DNA的变性和复制过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。
这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。
如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。
PCR反应系统的组成：引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
三、试剂与器材1、试剂10×EX Taq Buffer (Mg2+ plus) ；dNTP Mixture (各2.5 mM)TaKaRa EX Taq聚合酶5U/μl；模板DNA (已预先稀释)；上、下游引物混合物（已预先稀释）2、器材微量移液器及吸头，硅烷化的PCR小管，PCR扩增仪(PTC－100)，台式高速冷冻离心机。
四、操作方法1．编辑设定PCR扩增程序。
2．PCR管中加入灭菌水、缓冲液、四种dNTP、引物、模板、聚合酶。
3．运行程序进行扩增。
4．电泳检测扩增结果。
五、关键步骤与注意事项1．试剂湿热灭菌，小管分装，防止污染。
2．所用的PCR扩增管、微量移液器的吸头都要灭菌。
taqdna聚合酶基因的克隆实验原理
taqdna聚合酶基因的克隆实验原理聚合酶是一种重要的酶，能够催化DNA双链解旋和合成RNA的过程。
在遗传工程和分子生物学研究中，对聚合酶基因的克隆实验具有重要意义。
一、聚合酶基因的克隆实验原理1.提取DNA：首先，需要从细胞中提取DNA。
这可以通过细胞裂解和蛋白酶处理、有机物或者无机盐提取法等多种方法来实现。
经过提取后，可以得到纯净的DNA溶液。
2. PCR扩增：在得到DNA样本后，可以利用聚合酶链式反应（PCR）技术对聚合酶基因进行扩增。
PCR技术利用聚合酶酶、引物和dNTPs等原料，通过多次循环的温度变化，将特定DNA片段迅速扩增成百万甚至亿万倍。
3.消化和连接：经过PCR扩增后，得到的DNA片段需要进行酶切消化和连接。
酶切消化是通过限制性内切酶对DNA分子进行特异性切割，得到所需的DNA片段。
连接则是利用连接酶将所需的DNA片段连接到载体上自由末端的操作过程。
4.转化：连接好的质粒需要通过转化技术导入到宿主菌中，通常使用大肠杆菌等细菌作为宿主。
转化是将外源DNA导入到宿主细胞内，并使其稳定存在并得以复制。
5.筛选：经过转化后，需要对宿主菌进行相应的筛选，找到携带了聚合酶基因的阳性菌落。
通常利用抗生素筛选法或者标记基因法来选出目的菌株。
6.提取和纯化：最终需要对筛选出的阳性菌株进行DNA提取和纯化，得到纯净的含有聚合酶基因的质粒DNA。
通过以上步骤，可以成功得到聚合酶基因的克隆质粒，并可以进一步进行表达、纯化、功能验证等实验。
二、聚合酶基因的克隆实验应用1.遗传工程研究：利用聚合酶基因的克隆实验，可以获得大量的聚合酶基因，从而对其进行结构与功能的深入研究。
这对于揭示聚合酶在DNA复制、转录和修复等生物学过程中的作用具有重要意义。
2.分子生物学研究：在分子生物学研究中，聚合酶基因的克隆实验可以用于构建基因工程载体、进行基因表达调控、开展蛋白结构与功能研究等，为分子生物学研究提供了重要的工具和材料。
PCR技术简介
Mg2+浓度对PCR扩增效率影响极大，浓 度过高可降低PCR扩增的特异性；浓度过 低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失 败，出现假阴性。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
Mg2+浓度引起假阴性解决方案： 设置一组反应，其中每一反应中
的其他离子浓度相同（如Tris.Cl,KCl 等），而MgCl2浓度不同（由 0.5~6mmol/L,每次增加0.5mmol/L)， 由此来摸索最佳Mg2+浓度。
PCR技术的应用
研究领域：
基因克隆；DNA测序；分析突变； 基因重组与融合；检测基因的修饰； 鉴定与调控蛋白质结构的DNA序列； 转座子插入位点的绘图；合成基因的构建；
构建克隆或表达载体； 检测某基因的内切酶多态性等。
PCR技术的应用
临床诊断： 细菌；病毒；螺旋体；支原体；衣原
体；立克次氏体；分枝杆菌等病原体 的鉴定； 人类遗传病的鉴定；
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
模板因素引起假阴性解决方案：
1.配制有效而稳定的消化处理液; 2.提取程序固定,不宜随意改动； 3.模板DNA的溶解液应固定不变。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活：
1.酶本身的质量问题(供应商的问题）； 2.酶存放时间太长； 3.酶存放方式不当，或其他意外原因； 4.忘记添加Taq酶。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
酶失活引起假阴性解决方案：
1.检查加样程序及过程，看是否忘记加Taq 酶；
2.更换新的Taq酶; 3.新旧两种Taq酶同时使用。
PCR出现假阴性原因分析及解决方案
引物：
1.引物质量； 2.引物浓度； 3.两条引物的浓度是否对称等。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
PCR
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要 求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好 有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。 ⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明 显同源性。 ⑧引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最 低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错 配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 。
聚合酶链式反应，简称PCR（Polymerase Chain Reaction），指在引物指导下由酶催化 的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增 反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特 异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物 学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、 DNA测序、分子系统遗传学等。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 ②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩 增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效 果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分 布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补， 特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异 的扩增条带。
二、退火 模板DNA与引物的退火（复性），模板 DNA经加热变性成单链后，温度降低至 55℃左右，引物与模板DNA单ห้องสมุดไป่ตู้的互补序 列配对结合。
三、延伸 DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，dNTP为反应原料靶序列为模板 ，按碱基配对与半保留复制原理，合成一 条新的与模板DNA链。
pcr扩增产物的分析
它利用DNA双链复制的原理，在DNA聚合酶的作用下，通 过高温变性、退火、延伸等步骤，实现DNA的快速扩增。
03
PCR技术可以在短时间内将微量的DNA片段扩增至上百万 倍，极大地提高了DNA的获取效率。
PCR技术的应用领域
基因克隆和基因组分析
PCR技术是基因克隆和基因组分析的重要工具，可以用于 基因的快速克隆、基因突变检测、基因组测序等。
产物的定量分析
标准曲线法
通过制作标准曲线，可以定量PCR产物。标准曲线可以是 已知浓度的标准品，也可以是同源基因的PCR产物。
相对定量法
通过比较目标基因与内参基因的PCR产物量，可以计算出 目标基因的相对表达量。常用的内参基因包括β-actin和 GAPDH等。
绝对定量法
通过比较已知浓度的标准品与目标PCR产物，可以计算出 目标产物的绝对量。这种方法需要精确的标准品和可靠的 校准曲线。
06
未来展望
新技术发展对PCR扩增产物分析的影响
纳米孔测序技术
利用纳米孔在单分子水平上 检测DNA序列，具有高通量 、高速度的优点，有望替代 传统的凝胶电泳和荧光定量
PCR技术。
微流控芯片技术
将PCR反应和产物分析集成在 微流控芯片上，实现快速、
准确、自动化的PCR产物分析 ，提高检测效率。
数字PCR技术
03
PCR扩增产物的检测方法
凝胶电泳检测
1 2
原理
利用凝胶电泳的分子筛效应，将不同大小的DNA 片段进行分离，通过染色后观察电泳结果判断 PCR产物的大小。
优点
操作简单、成本低，适用于大多数PCR产物检测。
3
缺点
分辨率有限，无法检测到分子量相近的片段。
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应的原理
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种在体外复制DNA序列的技术。
它基于DNA聚合酶的催化作用，通过反复进行DNA的变性、引物结合和扩增，从而大量复制
目标DNA序列。
PCR的原理包括以下几个关键步骤：
1. 变性（Denaturation）：将待扩增的DNA样本加热至高温
（通常为94-98°C），使 DNA双链解开成单链，使DNA分子的双链结构解开，断开了两个链之间的氢键结合，使得DNA
的链变为单链状态。
2. 引物结合（Annealing）：将反应体温度降低（通常在50-65°C之间），使DNA引物与待扩增序列的互补部分结合。
引物是一小段与目标DNA序列两端具有互补碱基配对的DNA
片段，可为DNA聚合酶提供起始序列。
3. 扩增（Extension）：在适合DNA聚合酶活性的温度下（通
常在60-72°C之间），DNA聚合酶结合引物的3'端，并在模
板DNA上合成新的DNA链。
该酶使用单链DNA作为模板，
应用碱基匹配规则将引物与模板DNA的互补碱基配对，并在
引物3'端依次添加适当的核苷酸，即进行DNA链的延伸。
以上三个步骤组成了PCR的一个循环。
每个循环都使目标
DNA序列得以扩增。
通过反复循环PCR的三个步骤，可以在
极短的时间内（通常数小时）从很小的起始DNA样本中扩增
出大量的目标DNA序列。
PCR技术在许多生物学研究领域得到广泛应用，包括基因测序、遗传突变检测、疾病诊断、DNA指纹鉴定等。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增一、聚合酶链式反应（PCR）的定义PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
二、聚合酶链式反应（PCR）的基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，一般是94℃，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外扩增特异性DNA片段的技术。
经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。
一、PCR基本原理：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR扩增靶DNA的过程类似于体内DNA的半保留复制，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
利用人工合成的一对寡核苷酸引物，分别与待扩增DNA片段的两侧翼序列互补，在DNA聚合酶催化下，以靶DNA序列为模板，四种dNTP为原料，经过高温变性、低温退火和中温延伸“三步曲”的循环，使靶DNA片段经过30个循环周期后达到百万倍的扩增。
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法
分子生物学实验方法是研究生物分子结构、功能和相互作用的技术手段。
以下是常用的分子生物学实验方法：
1. PCR（聚合酶链式反应）：PCR是一种通过体外DNA扩增技术来复制DNA 片段的方法，可以快速、高效地扩增特定DNA序列。
2. 基因克隆：通过将目标DNA片段插入到载体DNA中，形成重组DNA分子，再将重组DNA导入到宿主细胞中，从而得到大量目标DNA的方法。
3. 电泳：电泳是一种利用电场将DNA、RNA或蛋白质分子按照大小和电荷进行分离的方法。
常用的电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4. 蛋白质表达与纯化：通过在宿主细胞中表达目标蛋白质的基因，然后利用蛋白质的特异性结构、功能或抗体亲和纯化技术，从宿主细胞中纯化目标蛋白质。
5. 免疫沉淀：利用抗体与特定蛋白质结合来纯化对应的蛋白质复合物的方法。
6. 荧光显微镜：利用荧光探针标记目标生物分子，通过荧光显微镜观察和分析分子在细胞或组织中的位置和数量。
7. Northern blot和Western blot：用于检测和分析RNA和蛋白质的方法。
Northern blot可以检测特定的RNA序列，Western blot可以检测特定蛋白质。
8. 基因敲除和基因转染：通过基因敲除技术可以去除或禁止特定基因的表达，而基因转染技术可以将外源基因导入细胞中，从而改变细胞的表型。
9. 蛋白质相互作用分析：利用蛋白质相互作用分析技术，如酵母双杂交、质谱分析等，研究蛋白质之间的相互作用关系。
这些方法是分子生物学研究中常用的实验技术，可以用于从分子水平解析生物学问题，探索生物的结构和功能。
实验十二、PCR扩增和RAPD分析
D.
二、实验步骤
1、PCR反应 、 反应： 反应 A. 取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂（共40.5µl）: 35µl H20 5µl 10XPCR反应缓冲液 4µl 25mmol/L MgCl2 4µl 4种 dNTP 0.5µl 上游引物（引物1） 0.5µl 下游引物（引物2） 0.5µl 模板DNA(约1ng) 0.5ul TaqDNA聚合酶（约2.5单位） 混匀后离心5秒钟
i. j.
1. PCR反应中的主要成分 反应中的主要成分
B. C. 4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）: 一般反应中每种dNTP 的 种三磷酸脱氧核苷酸（ 种三磷酸脱氧核苷酸 ） 终浓度为20-200µmol/L, 4种dNTP的浓度应相同。 模板：可以是DNA， 也可以是RNA；可以是线状或环状。 模板 一般反应中模板数量为102-105个拷贝。对单拷贝基因来说， 需要0.1µg的人基因组DNA，10ng 的酵母DNA， 1 ng 的大 肠杆菌DNA。扩增多拷贝基因时，用量更少。 TaqDNA聚合酶 一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为 聚合酶: 聚合酶 92 .5℃,130min; 95℃,40min; 97℃,5 min. TaqDNA聚合酶的 出错率为2X10-4酵/每轮循环。在100µlPCR反应中， 1.5-2 单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。酶量过高将使 产物非特异性增大，过少则产量下降。 反应缓冲液： 反应缓冲液：一般为10-50µmol/L Tris.Cl(20℃时pH8.3-8.8), 50µmol/L KCl 和适当浓度的Mg+。此外，可加入5mmol/L 的二硫苏糖醇(DDT)或100mmol/L的牛血清白蛋白(BSA),以 稳定酶活性
AFLP: Amplified fragment length polymorphism
聚合酶链式反应(PCR)基本操作步骤
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA 聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR 技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR 在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
PCR
PCR自测题一、名词解释1、PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板，引物，4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异性地扩增位于两段已知序列之间的DNA区段地酶促合成反应。
2、变性：于PCR反应体系中，通过加热使温度至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应模板。
3、退火： PCR反应中，经变性后将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA模板互补区域结合，形成杂交链的过程。
4、延伸：当反应体系温度升至70℃左右时，TaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的5‘→3’延伸反应，形成新生DNA链。
5、逆转录PCR：以mRNA为原始模板进行的PCR反应。
6、停滞效应：PCR中后期，随着目的DNA扩展产物逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即为停滞效应，又称平台期。
7、共享引物PCR：利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩增序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物，此种PCR常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。
8、多重PCR：在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。
9、反向PCR：利用连接酶将一段未知序列两端连接成环状，利用单一限制酶原点切开已知序列，据已知序列的碱基顺序设计3‘端和5’端引物扩增未知序列。
10、原位PCR：以组织固定处理细胞内的DNA或者RNA作为靶序列，进行PCR反应的过程，不必从组织细胞中分离模板DNA或RNA。
11、LCR：连接酶链反应，又称连接酶扩增反应，是以DNA连接酶将某一DNA链的5‘磷酸与另一相邻链的3’羟基连接为基础的循环反应, 特点是能准确分析基因序列中的单个碱基突变。
1、简述PCR反应的基本步骤。
PCR反应的基本步骤包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。
（1）变性（denaturation）：加热使双链DNA变为单链;（2）退火（annealing）：当温度降至引物的Tm值左右或以下，引物与DNA模板互补区结合，形成杂交链，这一过程称退火。
聚合酶链式反应(PCR)
聚合酶链式反应（PCR）第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA模板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些，故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
简述PCR基本反应步骤及结果
简述PCR基本反应步骤及结果PCR（聚合酶链反应）是一种重要的分子生物学技术，用于在体外扩增DNA片段。
它是由美国科学家基里尔·穆里斯和科利·索其皮斯在1983年发明的。
PCR在分子生物学研究、基因诊断和法医学等领域广泛应用。
PCR基本反应步骤PCR反应基本上由三个步骤组成：变性、退火和延伸。
1. 变性（Denaturation）PCR反应开始时，待扩增的DNA被放入PCR反应管中，并加入一种称为DNA聚合酶的酶。
然后，反应管中的混合物被加热到94-98摄氏度，这使得DNA的双链融解成两条单链。
这个步骤可以使DNA的两条链分离，为下一步的退火提供单链模板。
2. 退火（Annealing）在退火步骤中，将反应管中的温度降低到50-65摄氏度，以便引物（即引导PCR反应的DNA片段）与单链DNA模板结合。
引物是由设计师合成的，其序列与待扩增的DNA片段的两端序列互补。
这种互补性允许引物与DNA模板形成稳定的杂交复合物。
3. 延伸（Extension）在延伸步骤中，反应温度被设置为72摄氏度，这是聚合酶的最适工作温度。
在此温度下，DNA聚合酶加载到引物的3’端，并沿着模板DNA链合成新的互补链。
这个过程是有方向性的，新合成的DNA链与原始DNA模板链是反向互补的。
这三个步骤是一连串重复进行的，每一次PCR循环都可以使目标DNA的数量翻倍。
PCR的结果PCR的结果通常通过凝胶电泳分析来观察。
在凝胶电泳中，将扩增反应产物分离并可视化。
如果PCR反应成功，应该会产生一个或多个特定大小的DNA片段。
PCR产物的大小和数量取决于所使用的引物和目标DNA的特定序列。
通过选择正确的引物和调整PCR反应条件，可以实现选择性扩增特定的DNA区域。
通过PCR反应，可以扩增非常少量的DNA样本至足够数量来进行下一步的分析，如测序、克隆等。
总结PCR基本反应步骤包括变性、退火和延伸，通过这三个步骤，在体外可快速扩增特定DNA片段。
PCR介绍,生物学的聚合酶链式反应
生物学的聚合酶链式反应定义：一种在体外扩增DNA片段的重要技术。
当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-复性-延伸反应”的循环过程，痕量模板DNA可扩增至几百万倍。
聚合酶链反应或多聚酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），又称无细胞克隆技术(“free bacteria”cloning technique)，是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。
1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。
该方法一改传统分子克隆技术的模式，不通过活细胞，操作简便，在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10^7～10^8倍，大大提高了DNA的得率。
已广泛应用到分子生物学研究的各个领域。
PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。
它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。
PCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室Kary Mullis及同事于1985年发现并研制成功的；最早的应用报道是Saiki等1985年将PCR技术应用于β-珠蛋白基因扩增和镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
随后使用了1976年Chien等分离的热稳定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大为简化，并使PCR自动化成为可能；1987年Kary Mullis等完成了自动化操作装置，使PCR技术进行实用阶段。
复旦大学1988年起开始研制耐热性多聚酶，军事医学科学院马立人教授等在1989年研制成功了PCR自动装置，并且不断推陈出新，最近研制的PTC-51A/B型DNA 热循环仪体积小，造型美观，价格适宜，操作简单，尤为适宜国内应用。
PCR发明不到10年，却已获得广泛应用。
每年都有上千篇文章发表。
1991年，期刊“PCR方法与应用”（PCr Methods and Application）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。
pcr反应原理
pcr反应原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种用于从DNA中扩增特定片段
的技术。
它基于DNA的体外复制原理，通过逐渐产生PCR扩增产物的复制过程，从而快速生成许多相同的DNA分子。
PCR反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先，将
待扩增的DNA目标加热至高温（通常为94-96°C），使其变
性为两股单链。
然后，将反应体系温度降低至50-65°C，使引
物能够与目标DNA序列发生特异性结合，并启动DNA的延伸。
此时，引物通过一种特殊的DNA聚合酶（例如Taq聚合酶）在两条单链上合成新的DNA链。
这个过程被称为延伸，
其温度通常为72°C。
然后，反复进行循环变性、退火和延伸
步骤，以产生巨大数量的目标DNA序列。
PCR反应的产物是由扩增的DNA目标序列组成的DNA片段。
PCR的主要优点之一是其高度特异性，可以根据所使用的引
物序列选择性地扩增感兴趣的DNA片段。
此外，PCR速度快，灵敏度高，比传统的DNA克隆方法更为高效。
它已广泛应用
于许多领域，包括基因分型、疾病诊断、DNA测序、基因工
程等。
pcr产物检测的方法
pcr产物检测的方法1. 引言PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，能够快速、高灵敏地检测目标DNA序列。
PCR产物检测是利用PCR技术扩增目标DNA序列，并通过检测扩增产物来判断目标DNA的存在与否。
本文将介绍PCR产物检测的一些常用方法和技术。
2. 常用PCR产物检测方法2.1 凝胶电泳检测凝胶电泳是一种常用的PCR产物检测方法。
在凝胶电泳中，扩增产物经过电泳分离后，根据目标DNA的大小来判断扩增产物的存在和数量。
通常情况下，常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种类型。
琼脂糖凝胶电泳是最常见的凝胶电泳，它利用琼脂糖作为凝胶基质，通过电流使扩增产物迁移，并通过染色剂染色来观察单个DNA片段的电泳带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种较新的凝胶电泳技术，相较于琼脂糖凝胶电泳具有更高的分离能力和更低的背景噪音。
2.2 荧光定量PCR检测荧光定量PCR是一种应用广泛的PCR产物检测方法。
在荧光定量PCR中，扩增反应所需的引物会添加一个与荧光信号相关的分子，如SYBR Green或探针。
SYBR Green是一种DNA结合染料，能够与靶标DNA结合，通过测量荧光信号的强度来检测PCR产物的存在和数量。
探针是一种含有荧光基团和离子基团的DNA分子，通过引物结合的方式来检测PCR 产物的存在和数量。
荧光定量PCR检测方法具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，并且能够定量PCR产物的数量。
3. PCR产物检测的应用PCR产物检测方法在许多领域中被广泛应用。
3.1 医学诊断PCR产物检测在医学诊断中起着重要作用。
例如，在病原体检测中，通过PCR产物检测可以快速准确地检测出病原体的存在，对于疫情的监测和控制具有重要意义。
3.2 遗传学研究PCR产物检测方法在遗传学研究中广泛应用。
通过PCR产物检测方法，可以检测遗传突变、基因表达和基因多态性等遗传学变异，为遗传学研究提供基础数据。
3.3 食品安全检测PCR产物检测方法在食品安全检测中也有重要应用。
pfu和拷贝数的换算关系 -回复
pfu和拷贝数的换算关系-回复“pfu和拷贝数的换算关系”在分子生物学领域，我们经常会听到两个概念，即pfu和拷贝数。
它们在基因克隆、酶切、转染等实验中起着重要的作用。
那么，pfu和拷贝数之间是否存在着换算关系呢？本文将一步一步回答这个问题。
首先，我们来介绍pfu的概念。
pfu是指聚合酶链式反应（PCR）中一个能产生1 pfu的酶的量。
pfu是"热稳定聚合酶"（Taq聚合酶）的一种活性单位。
通常情况下，pfu的含量与实验中需要扩增的DNA长度和目标扩增产物的浓度有关。
pfu的含量越高，PCR反应的效率越高。
接下来，我们来讨论拷贝数的概念。
拷贝数是指一份DNA分子中所含有的同一基因序列的重复次数。
在分子生物学实验中，我们常常需要插入一定数量的目标基因或DNA片段到目的载体中。
拷贝数的确定对于控制重组DNA片段的数量非常重要，因为它直接影响到实验结果的准确性和重复性。
那么，pfu和拷贝数之间是否存在着换算关系呢？答案是存在的。
我们可以通过一些计算方法来将pfu转换为拷贝数，或者将拷贝数转换为pfu。
下面我们具体介绍一些常用的换算方法。
首先是将pfu转换为拷贝数。
在进行PCR等实验前，研究人员常常需要知道他们需要扩增的DNA片段在反应体系中的初始拷贝数，从而调整反应条件和实验设计。
我们可以通过以下公式将pfu转换为拷贝数：拷贝数= pfu / （体积* 反应体积）其中，体积表示反应液中所含总体积，反应体积是PCR反应体系中扩增反应的体积。
接下来是将拷贝数转换为pfu。
在实验设计中，有时我们需要将一定数量的DNA片段插入到目标载体中，从而得到特定拷贝数的重组DNA。
我们可以通过以下公式将拷贝数转换为pfu：pfu = （拷贝数* 分子量）/ (DNA长度* 660)其中，分子量表示目标基因或DNA片段的分子量，DNA长度是目标基因或DNA片段的长度。
660是一个经验值，代表了DNA的平均摩尔吸光系数。
pcr末端加a尾的目的原理
pcr末端加a尾的目的原理
PCR（聚合酶链式反应）是一种在体外合成DNA的技术，它可以扩增极微量的DNA片段，从而使其变得更易检测。
PCR扩增的DNA片段通常需要进行后续实验，如克隆和测序等，这就需要将其引入到相应的载体中。
为了方便这些实验的进行，需要在PCR扩增的DNA末端添加一些特定的序列。
PCR末端加A尾的目的是为了方便DNA的克隆，其原理是：在PCR 扩增过程中，聚合酶在扩增的DNA末端添加单一的腺嘌呤（A）核苷酸。
这样做的目的是在PCR扩增的DNA末端添加特定序列，使其与载体上的相应序列互补，从而方便DNA的克隆。
此外，PCR末端加A尾还可以防止DNA末端的丢失或缺失，从而增加DNA分子的稳定性。
在PCR扩增过程中末端的A尾与聚合酶结合相对稳定，不易受到脱氧核糖核酸酶的降解和外界环境的影响。
总之，PCR末端加A尾的目的是为了方便DNA的克隆和增加DNA 分子的稳定性。
它是分子生物学中常用的技术之一，有助于DNA分子的研究和应用。
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聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆第一节概述PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。
一、 PCR反应中的主要成份1. 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度 Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。
(6) 两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
(8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。
利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。
2. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH 将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4 种 dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg 的DNA。
当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。
4. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR 的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR反应中,1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA聚合酶, 灭活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。
(2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
(3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit 可用。
6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris〃Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris〃Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利.各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。
二、PCR反应参数1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解链,然后加入Taq DNA聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。
变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。
在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。
对于富含GC的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。
2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。
一般当引物中GC含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。
退火温度越高, 所得产物的特异性越高。
有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。
退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。
3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成2kb长的DNA。
延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。
4. 循环次数：当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。
一般而言25-30轮循环已经足够。
循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。
通常经25-30轮循环扩增后, 反应中Taq DNA聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。
扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。
其中：C为扩增产物量,C0 为起始DNA量, P为增效率, n为循环次数。
在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。
平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。
因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应，减少非特异性产物。
三、PCR产物的克隆在许多研究中,需要将PCR产物克隆,以获得目的DNA片段。
此时,所用PCR循环数应尽量小,以减少平台效应或非特异性扩增产物的干扰。
通常将PCR产物插入到载体中有下列一些方法。
1. 平末端连接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR产物3'端加上多余的非模板依赖碱基,在用平末端连接克隆PCR产物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶处理补平末端。
2. 在PCR产物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以PCR产物末端的多余碱基大部分都是A.。
利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上dT或ddT,使载体与PCR产物末端互补并进行连接.载体末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个ddTTP,而其5'端所含的磷酸基团可与PCR产物的3'端OH连接,连接产物在载体和PCR产物之间的双链上带两个切口,这种重组DNA仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复.目前一些公司已开发出可直接用于克隆PCR产物的带3'-T的T-Vector。
3. 粘性末端连接：利用引物中附加在5'端的限制酶位点,直接将PCR产物经适当的限制酶切割后产生粘性末端,与载体连接,产生重组DNA.如果下游两个引物中含有两个不同的限制酶位点.经酶切后定向克隆到载体中。