微流蒸发光散射检测器与毛细管液相色谱的联用及其在银杏叶提取物分析中的应用

２０１３年８月Ｖｏｌ．３１　Ｎｏ．８Ａｕｇｕｓｔ　２０１３　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ７９５～７９９技术与应用ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１２３．２０１２．１２０４３＊通讯联系人．Ｔｅｌ：（０２１）３４２０５６７３，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｏｙａｎ＠ｕｎｉｍｉｃｒｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ．基金项目：国家自然科学基金项目（２１１７５０９２，２１１０５０６４）；国家重大科学仪器设备开发专项（２０１１ＹＱ１５００７２，２０１１ＹＱ１５００７２０４，２０１１ＹＱ１５００７２０７，２０１１ＹＱ１５００７２１０）；上海市自然科学基金项目（１２ＺＲ１４１３６００）；上海市经信委引进技术的吸收与创新计划项目（２０１０ＸＩ－００７）．收稿日期：２０１２－１２－２５微流蒸发光散射检测器与毛细管液相色谱的联用及其在银杏叶提取物分析中的应用赵　卉，　王玉红，　刘　芳，　王　彦，　谷　雪，　阎　超＊（上海交通大学药学院，上海２００２４０）摘要：将微流蒸发光散射检测器（μＥＬＳＤ）与毛细管液相色谱（ｃＬＣ）联用，应用于中药银杏叶提取物及其分散片制剂的分离检测领域。

首先对μＥＬＳＤ仪器参数进行优化。

通过调节漂移管温度与载气流量，提高了分析物的响应，并减小了噪声。

然后，搭建了ｃＬＣ－μＥＬＳＤ分离检测平台，其相对常规ＬＣ可大大减小实验试剂消耗。

流动相Ａ为０．０５％（体积分数，下同）三氟乙酸（ＴＦＡ）水溶液，流动相Ｂ为含０．０５％ＴＦＡ的甲醇溶液。

最优的洗脱梯度条件为：０～１０　ｍｉｎ，５％Ｂ～２５％Ｂ；１０～２５　ｍｉｎ，２５％Ｂ～３８％Ｂ；２５～３５　ｍｉｎ，３８％Ｂ；３５～４０　ｍｉｎ，３８％Ｂ～４２％Ｂ；４０～５５ｍｉｎ，４２％Ｂ～５０％Ｂ。

银杏叶提取物和复杂中药制剂银杏叶提取物分散片都得到了较好的分离，并在其中鉴定到紫外波段几乎无吸收的重要内酯类活性成分白果内酯以及银杏内酯Ａ、Ｂ和Ｃ。

测定了不同厂家银杏叶提取物中萜类内酯洗脱时间的相对标准偏差，结果均不大于２．４２％，表明该体系在目标物的分析上具有良好的重现性。

实验证明所建立的ｃＬＣ－ＥＬＳＤ体系在复杂中药体系的分离检测中有良好的应用性。

关键词：微流蒸发光散射检测器；毛细管液相色谱；银杏叶提取物；中药中图分类号：Ｏ６５８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７１３（２０１３）０８－０７９５－０５Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏ　Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏｂａ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎａｌｙｓｉｓＺＨＡＯ　Ｈｕｉ，ＷＡＮＧ　Ｙｕｈｏｎｇ，ＬＩＵ　Ｆａｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｙａｎ，ＧＵ　Ｘｕｅ，ＹＡＮ　Ｃｈａｏ＊（Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏ　Ｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２００２４０，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｎｏｖｅｌ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ（μＥＬＳＤ）ｃｏｕｐｌｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ｃＬＣ）ｗａｓ　ｂｕｉｌｔ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅ－ｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏｂａ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｅ　ｔａｂｌｅｔ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　ＨＰＬＣ，ｔｈｉｓμＥＬＳＤ－ｃＬＣ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｎｓｕｍｅｄ　ｍｕｃｈ　ｌｅｓｓ　ｓａｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｓｏｌｖｅｎｔ．Ｓｏｍｅｋｅｙ　ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｉｔ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈｅ　ｅｖａｐｏｒｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅｄｒｉｆｔ　ｔｕｂｅ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｒ　Ｓ／Ｎｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ａｃｈｉｅｖｅｄ．Ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　Ａ　ｗａｓ　０．０５％（ｖ／ｖ）ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅ－ｔｉｃ　ａｃｉｄ（ＴＦＡ），ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉｌｅ　ｐｈａｓｅ　Ｂ　ｗａｓ　ｍｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　０．０５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ．Ｔｈｅ　ｏｐｔｉ－ｍｉｚｅｄ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｓ　ｆｏｌｌｏｗｓ：０－１０　ｍｉｎ，５％Ｂ－２５％Ｂ；１０－２５　ｍｉｎ，２５％Ｂ－３８％Ｂ；２５－３５　ｍｉｎ，３８％Ｂ；３５－４０　ｍｉｎ，３８％Ｂ－４２％Ｂ；４０－５５　ｍｉｎ，４２％Ｂ－５０％Ｂ．Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｘｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏｂａｅｘｔｒａｃｔ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｉｓｐｅｒｓｅ　ｔａｂｌｅｔ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ｓｅｐａｒａ－ｔｅｄ．Ｆｏｕｒ　ｍａｉｎ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ｂｉｌｏｂａｌｉｄｅ　ａｎｄ　ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ　Ａ，Ｂ，Ｃ）ｗｅｒｅ　ｆｉｎａｌｌｙ　ｓｅｐａｒａｔｅｄａｎｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ｔｅｒｐｅｎｅ　ｌａｃｔｏｎｅｓ　ｗｉｔｈ　ｐｒｅｔｔｙ　ｗｅａｋ　ＵＶ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ＲＳＤｓ　ｏｆ　ｔｈｅｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｔｅｒｐｅｎｅ　ｌａｃｔｏｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ　ｗｅｒｅ　ａｌｌ　ｎｏ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　２．４２％，ｗｈｉｃｈｐｒｏｖｅｄ　ｔｈｉｓ　ｐｌａｔｆｏｒｍ’ｓ　ｇｏｏｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｌａｔ－ｆｏｒｍ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．色谱第３１卷Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ（μＥＬＳＤ）；ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａ－ｔｏｇｒａｐｈｙ（ｃＬＣ）；Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉｌｏｂａ　ｅｘｔｒａｃｔ；ｈｅｒｂａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ 随着中药现代化研究的不断深入，对分离分析技术的要求逐步升级，对分析检测方法的多样性与先进性也提出了巨大挑战。

蒸发光散射检测器（ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ　ｌｉｇｈｔ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＥＬＳＤ）是一种通用的检测器［１］，可检测挥发性低于流动相的任何样品，具有很好的梯度和溶剂兼容性，广泛用于药物分析［２，３］及食品安全［４］等各个领域。

而飞速发展的毛细管分离技术与传统液相色谱相比仍然存在缺憾和不足。

如ＬＣ不仅可以配置紫外检测器［５］、荧光检测器［６］、二极管阵列检测器［７］、电化学检测器［８］等选择性检测器，还可以应用示差折光检测器［９］和蒸发光散射检测器［１０］等通用型检测器。

而适用于毛细管分离系统的检测器仅有紫外［１１］、激光诱导荧光［１２］及电化学检测器［１３］等，至今没有一种通用型检测器。

这在很大程度上影响和制约了毛细管分离技术，如毛细管液相色谱（ｃＬＣ）、毛细管电色谱（ＣＥＣ）和毛细管电泳（ＣＥ）的广泛应用和发展。

因而发展适用于毛细管系统的通用型蒸发光散射检测器具有非常重要的意义［１４］。

银杏叶提取物为银杏科植物银杏（Ｇｉｎｋｇｏ　ｂｉ－ｌｏｂａ　Ｌ．）的干燥叶提取物，具有黄酮、萜类等多种成分。

其中银杏内酯Ａ、Ｂ、Ｃ（ｇｉｎｋｇｏｌｉｄｅ　Ａ，Ｂ，Ｃ）与白果内酯（ｂｉｌｏｂａｌｉｄｅ）是银杏叶提取物及其制剂中的主要活性成分，是公认的血小板激活因子拮抗剂，被广泛用于心脑血管疾病［１５］。

但银杏内酯与白果内酯结构中无紫外吸收特征基团，仅在２００～２２０　ｎｍ有微弱的吸收，因此对于生药检测分析而言对其进行紫外检测特别困难，需要大量繁琐的前处理工作。

因此在现有的文献中，相对于银杏中另一种活性成分黄酮类物质（芦丁、槲皮素等），萜类内酯的研究文献较少。

而蒸发光散射检测系统在检测此类紫外吸收较弱的非挥发化合物具有绝对优势［１６］，由于选择性较好，可作为银杏内酯类成分测定的首选检测方法。

本研究中，我们构建了微流蒸发光散射检测器（μＥＬＳＤ）与ｃＬＣ联用系统，并以中药银杏叶提取物及中药分散片制剂为研究对象，对其进行了实用性研究，扩大了ｃＬＣ－μＥＬＳＤ分离体系的应用范围，实现了其在中药分离分析领域中的应用。

１　实验部分１．１　仪器及试剂 液相输液泵ＴｒｉｓｅｐＴＭ－２１００　Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ和ＴｒｉｓｅｐＴＭ－２１００　Ｍｉｃｒｏ　Ｆｌｕｉｄ　Ｃｏｎｔｒｏｌ微流控装置（Ｕｎｉｍｉｃｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｔｒｉｓｅｐ－２００３色谱工作站（Ｕｎｉｍｉｃｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２．１８版）；毛细管色谱柱（ＥＰ－２５０－１５－５－Ｃ１８，苏州环球色谱有限公司）；微流蒸发光散射检测器（μＥＬＳＤ，ＵＭ－６０００，上海通微分析技术有限公司）；高纯氮气（上海纵远化工有限公司）；电子天平（ＦＡ１００４，Ｎｏ．ＳＨＰ０２００１６１７３８，上海恒平科学仪器有限公司）；超声清洗仪（ＨＳ２０５００ＤＢｅｎｃｈｔｏｐ　Ｃｌｅａｎｅｒｓ，２０　Ｌ，天津恒奥科技发展有限公司）。

银杏叶提取物（江苏邳州富通生物制品有限公司，批号１１１０１８；广东韶关市冠翔生物制品有限公司，批号２０１２０５１０；四川成都伟晖生物科技有限公司，批号ＭＵＳＴ－１１０８１８０６；浙江宁波德沃生物科技有限公司，批号２０１２０４２８），银杏叶提取物分散片（江苏晨牌药业有限公司），槲皮素（ＢＲ，国药集团化学试剂有限公司），白果内酯和银杏内酯Ａ、Ｂ、Ｃ（≥９８％，北京仪化通标科技有限公司），纯净水（杭州娃哈哈集团），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司）。

１．２　样品前处理 槲皮素对照样品溶液：精密称取２５　ｍｇ槲皮素，用甲醇完全溶解后，转移至５　ｍＬ容量瓶中并定容至刻度，得到５　ｇ／Ｌ的槲皮素样品储存液，４℃避光保存，待用。

银杏叶提取物样品：称取３００　ｍｇ银杏叶提取物，用甲醇－水（９∶１，ｖ／ｖ）溶液溶解、稀释至７５　ｇ／Ｌ，超声提取１　ｈ，过０．２２μｍ有机滤膜，４℃避光保存，待用。