2011不同DNA提取方法对隐孢子虫卵囊PCR检测的影响
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( 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 中国农业科学院动物源性食品安全研究中心, 上海 200241)
摘 要: 为了提高隐孢子虫 PCR 检 测的 敏感 性和 效率, 采 用 10种 基 因组 DNA 提取 方 法, 对隐 孢 子虫 卵囊
DNA 进行提取, 对提取的 DNA 进行 nested PCR 扩增。经过 3 次重复试 验, 结 果显示, Che lex 100法、FTA 试纸
1 材料和方法
1. 1 主要试剂 二硫苏糖醇 ( DTT ) 为 BB I公司 产品; Chelex100 M o lec L ar B io logy G rade Resin购 自 B io Rad 公 司; 蛋 白 酶 K、Universal Genom ic DNA Extraction K it V er 3. 0、dNTP 、琼脂糖等购自 T aKaRa大 连有 限公 司; FTA Purification R eagen t 购自 W hatm an公司; W izard DNA C lean Up System 试剂 盒 购 自 Prom ega 公 司; Q IAam p DNA S too l M in i K it 购自 Q IAGEN 公司; F astDNA SP IN K it for So il购自 MP B iom ed icals公司; DNA ezso l基因 组 DNA 抽提试剂盒购自上海申能博彩生物科技 有限公司; KOD FX 购自 TOYOBO 公司; BSA 购 自 Sigm a 公司; O G eneRu lerTM 100 bp P lus DNA L adder购自 FERMENTAS 公司; 无水乙醇、氯仿、 氢氧化钠、蔗糖、苯酚、工业盐、重铬酸钾 等购自 中国医药集团上海化学试剂公司。 1. 2 实验材料 贝氏隐孢子虫 ( C ryp tosp oridium ba ileyi) 、微小隐孢子 虫 ( C. p arvum ) 和隐孢子虫 鼠基因 型 ( Cryp tosporid ium m ouse genotype ) 卵 囊 为本实 验 室 收 集 保 存, 经 核 糖 体 小 亚 基 RNA ( sm a ll subunit ribosom a l RNA, SSU rRNA ) 基因 部分 序 列 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( restrictionLeabharlann 58中国动物传染病学报
2011年 1月
和环境样本中的隐孢子虫卵囊 检测, 具有 快速、 敏感、特异等诸多优点, 而且有些方法还 能鉴定 虫种 /基因型 [ 1] 。但是 PCR 方法的敏感性主要依 赖于提取的模板 DNA 的质量和扩增抑制物的去 除, 不同学者报道的 PCR 检测敏感性差异很大, 从 1个卵囊到 105 个 卵囊 [ 2 5] , 选择 合适的 DNA 提取方法显得尤为关键。同时, 在进行分子流行 病学调查时, 往往 需要进行大量样 品的 DNA 提 取, 因此, 建立高效、稳定、快速、经济、适合大规 模调查的卵囊基因组 DNA 提取方法显得十分的 迫切。目前国外较多采 用 Q IAGEN 公司生 产的 Q IA am p DNA S too l M in i K it提 取隐孢 子虫卵 囊 DNA [ 6 7] , 但该法存在 PCR 抑制物去除不全、对水 源样品及部分种类动物样品 ( 如奶牛粪便 ) 扩增 效率不高、价格昂 贵等缺点。本研究采用 10 种 不同 的 方 法 提 取 隐 孢 子虫 卵 囊 DNA, 按 X iao 等 [ 1] 建立的方法对提取的 DNA 进行 N ested PCR 扩增, 比较不同种方法的敏感 性, 试图寻 找一种 简单、快捷、价廉、适合大规模分子流行病学调查 时样品 DNA 提取的方法。
收稿日期: 2011 01 28 基金项目: 上海市科技兴农重点攻关项目 [ 沪农科攻字 ( 2005)第 3- 4号 ]; 国家 十一五 高技术研究发展 计划 863
项目 ( 2006AA 10A 207); 国家 十一五 科技支撑计划项目 ( 2007BAD 40B05) 作者简介: 陈兆国, 男 , 研究员, 主要从事动物寄生虫分子生物学和分子流行病学研究 通信作者: 林矫矫, E m ai:l jjlin@ shvr.i ac. cn
1. 4. 3 NaOH 法 将处理好的卵囊沉淀加 100 L 50 mm o l/L 的 N aOH 溶液混匀, 95 水浴 10 m in, 加 20 L 1 m ol /L T risH C l 混匀, 10 600 g 离心 5 m in, 上清为 PCR 反应模板。 1. 4. 4 蛋白酶 K 法 将处理好的卵 囊沉淀加 20 L 20 mg /mL 的 蛋白 酶 K 混匀, 56 水 浴 4 h, 95 水浴 10 m in, 10 600离心 5 m in, 上清为 PCR 反应 模板 。 1. 4. 5 FTA 试 纸 法 参 照 FTA Purif ication R eagen t试 剂说 明书 进行 提取。 1. 4. 6 W izard DNA C lean Up System 试剂盒法 将处理好的卵囊沉淀加 10 倍体积裂解缓冲液, 加 10% SDS至 终浓度 0. 5% , 加 RNase( 10 m g / mL ) 至终浓 度 20 ug /m L, 混 合均 匀, 37 水浴 2 h。加蛋白酶 K ( 20 m g /mL ) 至终 浓度 100 g / mL, 50~ 55 消化过夜。后续操作参照 W izard DNA C lean U p System 说明书进行。 1. 4. 7 Q IA amp DNA Stoo l M ini K it 法 参 照 Q IAam p DNA Stoo l H andbook( Second Ed ition) 进 行提取。
fragm ent length po lym orph ism, RFLP ) 和序列 系统 进化分析鉴定, 分别经 3 日龄雏鸡、1 日龄犊牛和 20日龄 BALB / c小鼠传代, 于 2. 5% 的重铬酸钾 中 4 冰箱保存。 1. 3 卵囊纯化 参考 A rrow ood 等报道方法 [ 8] , 进行蔗糖密度梯度离心, 卵囊纯化后用白细胞计 数板进行计数, 并把卵囊稀释成 1 105、1 104、1
法 和 W izard DNA C lean U p Sy stem 试剂盒法敏感性最高, 能够稳 定地扩增出 1 102 个卵囊提取的 DNA, 适合隐
孢子虫病分子流 行病学调查时大量样品 DNA 的提取。
关键词: 隐孢子虫; DNA; 提取
中图分类号: S852. 42
文献标识码: A
文章编号: 1674- 6422( 2011) 01- 0057- 05
103、1 102、1 101 和 1个, 以备提取 DNA。 1. 4 卵囊 DNA 的提取 将纯化的 C. bailey i 卵 囊用液氮反复冻融 5 次, 将冻融后的卵囊 8700 g 离心 10 m in, 弃上清, 沉淀用不同方法进行 DNA 提取, 每种提取方法均重复 3次。 1. 4. 1 DTT 法 将处理好的卵囊沉淀加 100 L 2% 的 DTT 混匀, 90 水浴 20 m in, 10 600 g 离心 5 m in, 上清为 PCR 反应模板。 1. 4. 2 Chelex100 法 将处理好的卵 囊沉淀加 100 L 15% 的 Chelex100 混 匀, 100 水 浴 20 m in, 10 600 g 离心 5 m in, 上清 为 PCR 反 应 模板。
INFLUENCE OF DI FFERENT DNA EXTRACT ION M ETHODS OF CR YPTOSPOR ID I UM OOCYSTS ON PCR DETECT ION
CHEN Z hao g uo, M I Rong sheng, ZHOU Peng, HUANG Y an, ZHANG Guo en, SU Q ing m e,i Q IN Pe i lan, HU G ao w e,i L IN Jiao jiao
Abstrac t: In order to improve the sensitiv ity and effic iency o f PCR detection ofCryp to spor idium, ten k inds of m ethodsw ere used to extract genom ic DNA of Cryp to sp oridium oo cysts. T he ex tracted DNA s were used as tem plate to amp lify a sm all subun it ribosom al RNA ( SSU rRNA ) fragm entw ith N ested PCR. T he resu lts of 3 tim es dup licate test showed that Che lex 100, FTA filter paper, W izard DNA C lean U p System we re the three m ost sensitive m ethods w hich could ex tract g enom ic DNA of 1 102 Cryp tosp oridium oo cysts for nested PCR am plification and can be used in larg e number o f de tections fo r cryptospo rid ios is m olecular ep idem io logy research. K ey word s: Cryp tosp orid ium; DNA; ex traction
中国动物传染病学报 2011, 19 ( 1 ): 57- 61
Ch inese Journal o fA n im al Infectious D iseases
研究论文
不同 DNA 提取方法对隐孢子虫卵囊 PCR 检测的影响
陈兆国, 米荣升, 周 鹏, 黄 燕, 张国恩, 苏庆美, 秦培兰, 呼高伟, 林矫矫
1. 4. 8 F astDNA SP IN K it for So il 法 参 照 F astDNA SP IN K it for Soil说明书进行提取。 1. 4. 9 Universa lG enom ic DNA Ex traction K it法 参 照 U niversal G enom ic DNA Ex tract ion K it V er
隐孢子虫 ( C ryp tosporidium spp. ) 是一种全球 普遍存在人兽共患寄生原虫, 主要寄生于人和动 物的胃肠道和呼吸道粘膜上皮细胞内, 引起人和 动物的严重腹泻, 甚至威胁生命。目前常用的隐 孢子虫病诊断方法主要有病原学诊断方法、免疫
学诊断方法和分子生物学 方法。其中 病原学和 免疫学检查方法仍被广泛应用, 但特异性和敏感 性不高, 且不能 鉴别虫种和基因 型。近年来, 以 聚合酶链式反应 ( po lym erase cha in react ion, PCR ) 为基础的分子生物学技术被广泛地应 用于临床
(A nimal borne Food Safety Research C enter of Chinese A cademy of A gricultural Sciences, K ey Laboratory of A nimal Parasitology of the M inistry of A griculture, Shanghai Veter inary R esearch Institute, CAAS, Shanghai 200241, China )
摘 要: 为了提高隐孢子虫 PCR 检 测的 敏感 性和 效率, 采 用 10种 基 因组 DNA 提取 方 法, 对隐 孢 子虫 卵囊
DNA 进行提取, 对提取的 DNA 进行 nested PCR 扩增。经过 3 次重复试 验, 结 果显示, Che lex 100法、FTA 试纸
1 材料和方法
1. 1 主要试剂 二硫苏糖醇 ( DTT ) 为 BB I公司 产品; Chelex100 M o lec L ar B io logy G rade Resin购 自 B io Rad 公 司; 蛋 白 酶 K、Universal Genom ic DNA Extraction K it V er 3. 0、dNTP 、琼脂糖等购自 T aKaRa大 连有 限公 司; FTA Purification R eagen t 购自 W hatm an公司; W izard DNA C lean Up System 试剂 盒 购 自 Prom ega 公 司; Q IAam p DNA S too l M in i K it 购自 Q IAGEN 公司; F astDNA SP IN K it for So il购自 MP B iom ed icals公司; DNA ezso l基因 组 DNA 抽提试剂盒购自上海申能博彩生物科技 有限公司; KOD FX 购自 TOYOBO 公司; BSA 购 自 Sigm a 公司; O G eneRu lerTM 100 bp P lus DNA L adder购自 FERMENTAS 公司; 无水乙醇、氯仿、 氢氧化钠、蔗糖、苯酚、工业盐、重铬酸钾 等购自 中国医药集团上海化学试剂公司。 1. 2 实验材料 贝氏隐孢子虫 ( C ryp tosp oridium ba ileyi) 、微小隐孢子 虫 ( C. p arvum ) 和隐孢子虫 鼠基因 型 ( Cryp tosporid ium m ouse genotype ) 卵 囊 为本实 验 室 收 集 保 存, 经 核 糖 体 小 亚 基 RNA ( sm a ll subunit ribosom a l RNA, SSU rRNA ) 基因 部分 序 列 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( restrictionLeabharlann 58中国动物传染病学报
2011年 1月
和环境样本中的隐孢子虫卵囊 检测, 具有 快速、 敏感、特异等诸多优点, 而且有些方法还 能鉴定 虫种 /基因型 [ 1] 。但是 PCR 方法的敏感性主要依 赖于提取的模板 DNA 的质量和扩增抑制物的去 除, 不同学者报道的 PCR 检测敏感性差异很大, 从 1个卵囊到 105 个 卵囊 [ 2 5] , 选择 合适的 DNA 提取方法显得尤为关键。同时, 在进行分子流行 病学调查时, 往往 需要进行大量样 品的 DNA 提 取, 因此, 建立高效、稳定、快速、经济、适合大规 模调查的卵囊基因组 DNA 提取方法显得十分的 迫切。目前国外较多采 用 Q IAGEN 公司生 产的 Q IA am p DNA S too l M in i K it提 取隐孢 子虫卵 囊 DNA [ 6 7] , 但该法存在 PCR 抑制物去除不全、对水 源样品及部分种类动物样品 ( 如奶牛粪便 ) 扩增 效率不高、价格昂 贵等缺点。本研究采用 10 种 不同 的 方 法 提 取 隐 孢 子虫 卵 囊 DNA, 按 X iao 等 [ 1] 建立的方法对提取的 DNA 进行 N ested PCR 扩增, 比较不同种方法的敏感 性, 试图寻 找一种 简单、快捷、价廉、适合大规模分子流行病学调查 时样品 DNA 提取的方法。
收稿日期: 2011 01 28 基金项目: 上海市科技兴农重点攻关项目 [ 沪农科攻字 ( 2005)第 3- 4号 ]; 国家 十一五 高技术研究发展 计划 863
项目 ( 2006AA 10A 207); 国家 十一五 科技支撑计划项目 ( 2007BAD 40B05) 作者简介: 陈兆国, 男 , 研究员, 主要从事动物寄生虫分子生物学和分子流行病学研究 通信作者: 林矫矫, E m ai:l jjlin@ shvr.i ac. cn
1. 4. 3 NaOH 法 将处理好的卵囊沉淀加 100 L 50 mm o l/L 的 N aOH 溶液混匀, 95 水浴 10 m in, 加 20 L 1 m ol /L T risH C l 混匀, 10 600 g 离心 5 m in, 上清为 PCR 反应模板。 1. 4. 4 蛋白酶 K 法 将处理好的卵 囊沉淀加 20 L 20 mg /mL 的 蛋白 酶 K 混匀, 56 水 浴 4 h, 95 水浴 10 m in, 10 600离心 5 m in, 上清为 PCR 反应 模板 。 1. 4. 5 FTA 试 纸 法 参 照 FTA Purif ication R eagen t试 剂说 明书 进行 提取。 1. 4. 6 W izard DNA C lean Up System 试剂盒法 将处理好的卵囊沉淀加 10 倍体积裂解缓冲液, 加 10% SDS至 终浓度 0. 5% , 加 RNase( 10 m g / mL ) 至终浓 度 20 ug /m L, 混 合均 匀, 37 水浴 2 h。加蛋白酶 K ( 20 m g /mL ) 至终 浓度 100 g / mL, 50~ 55 消化过夜。后续操作参照 W izard DNA C lean U p System 说明书进行。 1. 4. 7 Q IA amp DNA Stoo l M ini K it 法 参 照 Q IAam p DNA Stoo l H andbook( Second Ed ition) 进 行提取。
fragm ent length po lym orph ism, RFLP ) 和序列 系统 进化分析鉴定, 分别经 3 日龄雏鸡、1 日龄犊牛和 20日龄 BALB / c小鼠传代, 于 2. 5% 的重铬酸钾 中 4 冰箱保存。 1. 3 卵囊纯化 参考 A rrow ood 等报道方法 [ 8] , 进行蔗糖密度梯度离心, 卵囊纯化后用白细胞计 数板进行计数, 并把卵囊稀释成 1 105、1 104、1
法 和 W izard DNA C lean U p Sy stem 试剂盒法敏感性最高, 能够稳 定地扩增出 1 102 个卵囊提取的 DNA, 适合隐
孢子虫病分子流 行病学调查时大量样品 DNA 的提取。
关键词: 隐孢子虫; DNA; 提取
中图分类号: S852. 42
文献标识码: A
文章编号: 1674- 6422( 2011) 01- 0057- 05
103、1 102、1 101 和 1个, 以备提取 DNA。 1. 4 卵囊 DNA 的提取 将纯化的 C. bailey i 卵 囊用液氮反复冻融 5 次, 将冻融后的卵囊 8700 g 离心 10 m in, 弃上清, 沉淀用不同方法进行 DNA 提取, 每种提取方法均重复 3次。 1. 4. 1 DTT 法 将处理好的卵囊沉淀加 100 L 2% 的 DTT 混匀, 90 水浴 20 m in, 10 600 g 离心 5 m in, 上清为 PCR 反应模板。 1. 4. 2 Chelex100 法 将处理好的卵 囊沉淀加 100 L 15% 的 Chelex100 混 匀, 100 水 浴 20 m in, 10 600 g 离心 5 m in, 上清 为 PCR 反 应 模板。
INFLUENCE OF DI FFERENT DNA EXTRACT ION M ETHODS OF CR YPTOSPOR ID I UM OOCYSTS ON PCR DETECT ION
CHEN Z hao g uo, M I Rong sheng, ZHOU Peng, HUANG Y an, ZHANG Guo en, SU Q ing m e,i Q IN Pe i lan, HU G ao w e,i L IN Jiao jiao
Abstrac t: In order to improve the sensitiv ity and effic iency o f PCR detection ofCryp to spor idium, ten k inds of m ethodsw ere used to extract genom ic DNA of Cryp to sp oridium oo cysts. T he ex tracted DNA s were used as tem plate to amp lify a sm all subun it ribosom al RNA ( SSU rRNA ) fragm entw ith N ested PCR. T he resu lts of 3 tim es dup licate test showed that Che lex 100, FTA filter paper, W izard DNA C lean U p System we re the three m ost sensitive m ethods w hich could ex tract g enom ic DNA of 1 102 Cryp tosp oridium oo cysts for nested PCR am plification and can be used in larg e number o f de tections fo r cryptospo rid ios is m olecular ep idem io logy research. K ey word s: Cryp tosp orid ium; DNA; ex traction
中国动物传染病学报 2011, 19 ( 1 ): 57- 61
Ch inese Journal o fA n im al Infectious D iseases
研究论文
不同 DNA 提取方法对隐孢子虫卵囊 PCR 检测的影响
陈兆国, 米荣升, 周 鹏, 黄 燕, 张国恩, 苏庆美, 秦培兰, 呼高伟, 林矫矫
1. 4. 8 F astDNA SP IN K it for So il 法 参 照 F astDNA SP IN K it for Soil说明书进行提取。 1. 4. 9 Universa lG enom ic DNA Ex traction K it法 参 照 U niversal G enom ic DNA Ex tract ion K it V er
隐孢子虫 ( C ryp tosporidium spp. ) 是一种全球 普遍存在人兽共患寄生原虫, 主要寄生于人和动 物的胃肠道和呼吸道粘膜上皮细胞内, 引起人和 动物的严重腹泻, 甚至威胁生命。目前常用的隐 孢子虫病诊断方法主要有病原学诊断方法、免疫
学诊断方法和分子生物学 方法。其中 病原学和 免疫学检查方法仍被广泛应用, 但特异性和敏感 性不高, 且不能 鉴别虫种和基因 型。近年来, 以 聚合酶链式反应 ( po lym erase cha in react ion, PCR ) 为基础的分子生物学技术被广泛地应 用于临床
(A nimal borne Food Safety Research C enter of Chinese A cademy of A gricultural Sciences, K ey Laboratory of A nimal Parasitology of the M inistry of A griculture, Shanghai Veter inary R esearch Institute, CAAS, Shanghai 200241, China )