201204新城疫病毒结构蛋白功能及检测技术研究进展

动物医学进展，２０１１，３３（４）：８５－８９Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ新城疫病毒结构蛋白功能及检测技术研究进展　收稿日期：２０１１－１０－２４　作者简介：邹海涛（１９８７－），男，山东青岛人，硕士研究生，主要从事动物传染病防治与检测研究。

＊通讯作者邹海涛１，２，兰邹然２＊，姜　平１（１．南京农业大学动物医学院，江苏南京２１００９５；２．山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南２５００２２） 摘　要：新城疫是一种由新城疫病毒引起的烈性传染病，病死率很高，严重危害家禽养殖业，被世界动物卫生组织列为必须报告的动物传染病。

在我国，新城疫的暴发和流行虽然已得到了控制，但病毒的变异给新城疫的防控工作带来了困难。

新城疫病毒的隐性感染也对我国禽类产品的质量及出口造成了一定影响。

因此，明确新城疫病毒各结构蛋白的功能、改进现有检测技术以及开发新的检测技术平台是目前新城疫防控工作的重点。

论文对新城疫病毒结构蛋白功能及检测技术的进展进行了系统的阐述。

关键词：新城疫病毒；结构蛋白；检测技术中图分类号：Ｓ８５２．６５９．５文献标识码：Ａ文章编号：１００７－５０３８（２０１２）０４－００８５－０５ 新城疫（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＤ），又称亚洲鸡瘟、伪鸡瘟，是一种由新城疫病毒（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ，ＮＤＶ）引起的以呼吸道和消化道黏膜出血为特征性病变的烈性传染病。

ＮＤ具有高度接触传染性，传播速度极快，急性发病时病死率接近１００％，严重危害家禽养殖业，故世界动物卫生组织（ＯＩＥ）将其列为必须报告的动物传染病之一。

在我国，ＮＤ的暴发和流行虽已得到较好的控制，但是ＮＤＶ不同毒株间毒力有较大差异，且在高免疫压力下，随着时间推移病毒也随之发生着一定的变异，给ＮＤＶ检测工作带来了困难。

传统的病原分离鉴定以及血清学检测费时费力，且具有一定局限性。

随着分子生物学技术的快速发展，ＮＤＶ检测技术也得到了长足发展，但是这些新技术在实际应用中都存在一定的缺陷或弱点。

因此，深入研究ＮＤＶ各部分结构及其功能，进而改进现有检测技术或开发新的检测技术已成为目前ＮＤ防控工作的一个重点。

１　新城疫病毒的结构新城疫病毒属副黏病毒科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）副黏病毒亚科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ）禽腮腺炎病毒属（Ａｖｕｌａｖｉｒｕｓ），病毒粒子外有囊膜，囊膜表面有纤突，其基因组为一长约１５ｋｂ的单股负链ＲＮＡ。

ＮＤＶ不同毒株其基因组大小略有差异，但各毒株的基因组碱基数均为６的倍数，这种６碱基机制对ＮＤＶ的复制有着至关重要的作用［１］。

ＮＤＶ的基因组不分节段，编码６种结构蛋白：核衣壳蛋白（ＮＰ）、磷酸化蛋白（Ｐ）、基质蛋白（Ｍ）、融合蛋白（Ｆ）、血凝素－神经氨酸酶蛋白（ＨＮ）以及具有ＲＮＡ依赖性的ＲＮＡ聚合酶蛋白（Ｌ）。

Ｐ、ＮＰ和Ｌ称为内部蛋白，与病毒ＲＮＡ组成核糖核蛋白体（ＲＮＰ）；Ｍ、Ｆ和ＨＮ则称为外部蛋白。

１．１　ＮＰ蛋白ＮＰ蛋白是一种与病毒的增殖密切相关的病毒多肽，对病毒核衣壳的形成至关重要［２］。

ＮＰ蛋白带有大量电荷，而由大量碱性氨基酸构成的Ｍ蛋白带有强正电荷，二者通过电荷相互作用，将ＲＮＰ准确的包装入病毒粒子中。

虽然ＮＰ蛋白不能对ＮＤＶ的感染和毒力起决定作用，但ＮＰ蛋白与基因组ＲＮＡ共同组成ＮＰ－ＲＮＡ复合体，作为复制和转录的模板，包含免疫显性抗原决定簇，具有高度的免疫原性［３］，能够介导细胞免疫作用。

ＮＰ蛋白ｍＲＮＡ的３＇非编码区在强弱毒株间表现出相当大的差异，但能否作为强弱毒判定的标准目前尚无定论。

１．２　Ｐ蛋白Ｐ蛋白可与Ｌ蛋白形成复合物，产生酶活性。

Ｐ蛋白作为ＮＰ蛋白的分子伴侣能够阻止ＮＰ蛋白在合成之后发生自动装配的特性，防止ＮＰ蛋白对非ＮＤＶＲＮＡ进行衣壳化。

Ｐ基因在转录过程中会发生ＲＮＡ编辑现象，形成２种衍生蛋白Ｖ和Ｗ。

Ｖ蛋白与ＮＤＶ的复制和组织嗜性有关，对干扰素有颉颃作用，从而影响ＮＤＶ的毒力。

这种颉颃作用主要与Ｖ蛋白位于两端的４个氨基酸位点有关［４］。

此外，Ｗ蛋白对ＮＤＶ的生物活性也有重要的作用［５］。

１．３　Ｍ蛋白Ｍ蛋白是存在于病毒囊膜内层的一种非糖基化蛋白，在病毒装配的过程中对病毒囊膜的形成、核衣壳与囊膜之间的识别、维持病毒粒子结构完整性有着重要的作用。

一系列分子流行病学调查结果显示Ｍ蛋白在不同的ＮＤＶ分离株中具有极高的保守性。

Ｍ蛋白还可抑制宿主ＲＮＡ转录和蛋白质的合成，与病毒的致病力有关。

Ｙｉｎ　Ｒ　Ｆ等［６］借助ＲＮＡ干扰技术对Ｍ基因的第６４１和第８２７碱基位点进行特异性沉默，结果发现病毒复制能力明显降低。

若ＮＤＶ毒株Ｍ基因发生突变，则该毒株在宿主体内不能出芽，仅表现为持续性感染。

１．４　Ｆ蛋白Ｆ蛋白以纤突形式呈现在囊膜以外，是ＮＤＶ最重要的毒力蛋白和保护性抗原。

不同毒株的Ｆ基因序列存在差异，差异越大，毒株间的亲缘关系越远。

Ｆ蛋白参与ＮＤＶ与靶细胞作用的过程，使病毒囊膜与宿主细胞膜融合，从而使病毒能穿过宿主细胞膜进入胞浆，脱去核衣壳进行复制。

在这个过程中，Ｆ蛋白跨膜区特异性序列起着相当重要的作用，它能够影响胞外区活化前的构象以及Ｆ蛋白与ＨＮ蛋白的相互作用，调节融合活性［７］。

Ｆ蛋白最初是以一种无活性的前体蛋白Ｆ０的形式被合成，Ｆ０的Ｃ端嵌入病毒囊膜之中，而后被细胞内的胰蛋白酶在第１１２～１１７位氨基酸残基处裂解为Ｆ１和Ｆ２。

Ｆ１多肽Ｎ端插入宿主细胞的脂质层继而发挥活性作用，启动膜融合，ＮＤＶ才产生感染性。

以往普遍认为该裂解位点的氨基酸序列及裂解能力是ＮＤＶ毒力的惟一决定性因素。

不过近年来的研究表明Ｆ蛋白的裂解能力并不是ＮＤＶ毒力的惟一决定性因素［８］。

国外学者通过反向遗传技术将ＮＤＶ高致病性毒株与非致病性毒株的ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｌ编码区进行相应置换，而后将拯救出的病毒接种动物，同时将重组的病毒基因组转染单层细胞，以评估重组病毒的致病力与复制能力。

结果发现原强毒株重组后，病毒的复制能力降低，致病力有明显的减弱，相比之下无致病力毒株则呈现了相反情况，特别是在置换了ＮＰ、Ｐ和Ｌ等３个编码区后，病毒复制能力明显增强，致病力变为原先的１０倍［９］。

说明真正决定ＮＤＶ毒力的因素是病毒的复制能力，并非仅仅是Ｆ蛋白的裂解能力。

１．５　ＨＮ蛋白ＨＮ蛋白是一种既有血凝素（ＨＡ）活性又有神经氨酸酶（ＮＡ）活性的糖蛋白，是ＮＤＶ重要的毒力蛋白和保护性抗原。

ＨＡ活性能够使病毒吸附到对应靶细胞的受体上，ＮＡ活性则破坏细胞受体，从感染细胞表面释放病毒粒子。

同时ＨＮ蛋白还能够促进膜融合，吸引Ｆ蛋白充分接近该位点，继而启动病毒与细胞膜融合。

ＨＮ蛋白ｍＲＮＡ的５＇非编码区（ＵＴＲ）是ＮＤＶ毒力的影响因子之一，若将其缺失，ＮＤＶ复制不会受到影响，但却可以降低病毒的致病力［１０］。

此外，若ＨＮ蛋白第５２６位氨基酸发生突变，ＨＮ蛋白的活性将会减弱，ＮＤＶ的复制将会受其影响，致病力降低［１１］。

ＨＮ蛋白Ｎ末端胞内区的５个氨基酸位点（第１、２、３、４、６位）对病毒与细胞的融合、病毒毒力以及ＨＮ蛋白和Ｍ蛋白的定位有着极其重要的作用［１２］。

这一系列研究表明，病毒的组织嗜性依赖于ＨＮ蛋白，故ＨＮ蛋白是ＮＤＶ致病力的必需因子，与Ｆ基因共同决定着ＮＤＶ的毒力强弱，进一步印证了Ｆ蛋白裂解能力不是ＮＤＶ毒力唯一决定因素的结论。

１．６　Ｌ蛋白Ｌ蛋白是ＲＮＡ依赖性的ＲＮＡ聚合酶的主要组成部分，且参与ＲＮＡ转录和复制的大部分酶的活性都来源于Ｌ蛋白。

秦红刚等［１３］通过ＲＮＡ干扰技术对位于ＮＤＶ　Ｌ基因上的Ｐ１５９５、Ｐ２１０３、Ｐ３２７７等３个酶活性中心区域进行沉默。

结果发现特异性的沉默这３个区域的表达会抑制病毒的复制，影响子代病毒粒子的组装和释放，说明了Ｐ１５９５、Ｐ２１０３和Ｐ３２７７这３个区域对于Ｌ蛋白发挥ＲＮＡ依赖的ＲＮＡ聚合酶的功能具有重要的作用。

此外，国外学者借助反向遗传学技术发现Ｌ基因可影响病毒复制能力，进而影响ＮＤＶ的致病力［１４］。

２　新城疫病毒的检测技术２．１　ＲＴ－ＰＣＲ技术ＲＴ－ＰＣＲ检测技术具有快捷、灵敏、特异性强等优点，消除了常规血清学诊断方法中非特异性因素的干扰及敏感性问题，得到了ＯＩＥ的认可。

虽然国内外已建立了许多成熟的ＲＴ－ＰＣＲ方法，但是ＲＴ－ＰＣＲ检测技术在实际应用中出现了各种各样缺陷，因此仍然需要不断地对该技术进行改良和优化。

Ｌｉｕ　Ｈ　Ｌ等［１５］根据多个ＮＤＶ野毒分离株的Ｆ基因序列，设计了２对特异性引物并优化了反应条件，建立了二重ＲＴ－ＰＣＲ检测方法，将ＮＤＶ检测以及Ⅰ和Ⅱ型ＮＤＶ的鉴别一次性完成。

试验结果显示，利用此方法，Ⅰ型ＮＤＶ参考毒株可扩增出４３３ｂｐ的特异性条带，Ⅱ型参考毒株可扩增出５３５ｂｐ的特异性条带，同批检测的ＡＩＶ、ＩＢＶ、ＩＢＤＶ均无特异性扩增条带。

随后他们又对６７份野毒样品进行了检测，检测结果与病毒基因测序结果相一致。

同样是根据ＮＤＶ　Ｆ基因的序列，Ｚｈａｎｇ　Ｌ等［１６］设计了一条通用上游引物Ｆ１和２条特异性下游引物Ｆ２、６８动物医学进展　２０１２年　第３３卷　第４期（总第２２６期）Ｆ３，进而建立了半套式ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。

先利用引物对Ｆ１＋Ｆ２确定ＮＤＶ的存在，进而再用引物对Ｆ２＋Ｆ３鉴定ＮＤＶ毒株的毒力。

经过验证，该方法的敏感度要比普通ＲＴ－ＰＣＲ方法敏感１　０００倍。

鉴于ＮＤＶ感染在临床上极易与ＡＩＶ感染混淆，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究人员根据Ｈ５－ＡＩＶ和Ｈ９－ＡＩＶ的Ｈ基因以及ＮＤＶ的Ｆ基因设计了３对特异性引物，建立了三重ＲＴ－ＰＣＲ检测体系［１７］。

随后将该体系与传统单一ＲＴ－ＰＣＲ检测体系进行对比，二者的检测结果完全一致。

２．２　荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ技术是通过借助于荧光信号来检测ＰＣＲ产物，提高了灵敏度，实现了真正意义上的ＤＮＡ定量，具有广阔的发展前景。

目前，该技术已被应用于包括ＮＤＶ、ＰＲＲＳＶ、ＣＳＦＶ等多种动物疫病检测。

Ｗｉｓｅ　Ｍ　Ｇ等［１８］根据ＮＤＶ　Ｍ基因的保守序列设计了引物和水解探针，其检测敏感度可达到１０ＥＩＤ５０。

Ｆｕｌｌｅｒ　Ｃ　Ｍ等［１９］建立了基于Ｌ基因的Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ方法，如若将其与Ｗｉｓｅ　Ｍ　Ｇ等建立的方法结合，则基本上可涵盖所有Ⅰ型和Ⅱ型ＮＤＶ毒株。

在实际工作中，需要判定ＮＤＶ分离株是否为强毒株。

为此，国外在普通Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ的基础上发展出了若干种多重Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ体系，用以鉴定ＮＤＶ分离株。

Ｔａｎ　Ｓ　Ｗ等［２０］通过分析ＮＤＶ不同毒力毒株ＮＰ基因的序列，设计了２条通用引物以及２条特异性探针，采用ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ染料建立了两步法Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＲＴ－ＰＣＲ检测方法。