密度梯度离心法分离PBMC操作流程

密度梯度离心法分离PBMC

1. 在15mL 离心管中加入5mL 淋巴细胞分离液Ficoll 。

2. 取5mL 抗凝静脉血与5mL 无菌PBS 按照1：1充分混匀，用移液管沿管

注意保持清楚的界面。外周血，PBS ，淋巴细胞分离液最终体积比为1：1：1。

3. 水平离心400g×30分钟。（注意：为保证分离效果，需将离心机升降速率

间约为1小时。）

4. 离心后可看见管内分为三层，上层为血浆和PBS ，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液。在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

5. 去除部分上层液体（用移液管吸取，不可倾倒），余下约1mL ，用移液器插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一15mL 离心管中，加入5倍以上体积的PBS ，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

6. 末次离心后，弃上清，加入红细胞裂解液，室温孵育2分钟，裂解红细胞，可根据情况适量增减时间。

7. 加入10mL PBS ，离心300g×10分钟，洗涤细胞两次。

血浆和PBS

淋巴细胞分离液

红细胞和粒细胞

单个核细胞

8.末次离心后，弃上清，加入含有10%FBS的RPMI1640，重悬细胞，计数，计算细胞活力。

用本法分离PBMC，每1mL全血可分离得到1~2×106 PBMC，不同人个体之间存在一定差异。活细胞百分率在95％以上。

注意：

1.所有操作都应在无菌条件下进行。

2.在分离前Ficoll和PBS等试剂均需在37

3.吸取单个核细胞时不可避免会吸到Ficoll，而Ficoll密度比细胞要大，因此步

骤5中需加入足量PBS稀释，若PBS体积太小可能会导致细胞无法离心收集。