第4章 DNA纯化后利用
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。
《生物技术制药》笔记_学习笔记
《生物技术制药》笔记第一章：生物技术制药概述1.1生物技术的定义与发展1.2生物制药的历史背景1.3生物药物的分类1.4生物技术制药的现状与趋势第二章：生物药物的研发过程2.1药物发现与筛选2.2临床前研究2.3临床试验的设计与实施2.4药物上市后的监测第三章：生物制药的生产技术3.1重组DNA技术3.2细胞培养与发酵技术3.3纯化与制剂技术3.4质量控制与标准化第四章：生物药物的市场与经济学4.1生物制药市场的规模与增长4.2价格与经济负担4.3竞争与合作策略4.4政策与法规影响第五章：生物药物的安全性与有效性5.1药物的安全性评估5.2副作用与不良反应5.3有效性研究方法5.4风险管理策略第六章：未来生物制药的发展方向6.1个性化医疗与精准治疗6.2新兴技术的应用（如CRISPR等）6.3全球健康与生物制药的合作6.4持续创新与可持续发展第1章：生物技术制药概述生物技术的定义与发展生物技术是利用生物系统、活细胞或其衍生物来开发或制造产品的技术。
它的应用涉及医学、农业、工业等多个领域。
生物技术的核心在于对生物体的基因和细胞过程的理解与利用。
关键概念：生物技术的定义：应用生物学和技术于生产、改良生物产品的过程。
发展历程：自20世纪初的微生物发酵技术起，经过基因工程、重组DNA技术等阶段，逐渐形成现代生物技术。
重要进展：1973年，第一例重组DNA技术成功。
1982年，首个重组人胰岛素上市。
1990年，基因治疗首次在临床应用。
生物制药的历史背景生物制药起源于对传统药物的改良，随着对生物体内机制的深入了解，生物制药逐渐崭露头角。
生物制药主要利用生物技术生产药物，包括抗体、疫苗、蛋白质等。
历史节点：1920年代，青霉素的发现标志着抗生素时代开始。
1970年代，开始利用细胞培养技术生产单克隆抗体。
1980年代，生物制药行业迅速发展，多种生物药物陆续上市。
重要药物：人胰岛素：由大肠杆菌生产，治疗糖尿病。
重组人干扰素：用于治疗病毒感染及某些癌症。
DNA纯化技术及其在分子生物学领域中的应用
DNA纯化技术及其在分子生物学领域中的应用DNA是生命机体的基础，分子生物学研究的核心之一便是对DNA的研究。
DNA分子的提取及纯化是DNA研究的基础，只有得到足够高质量的DNA 样品，才能进行后续的实验。
本文将简要介绍DNA纯化技术的相关内容及其在分子生物学领域中的应用。
1.DNA纯化技术1.1DNA提取DNA提取是纯化DNA的第一步。
DNA提取最常用的方法是酚/ 氯仿法，该方法基于三种物质的化学性质不同来分离它们，分别是DNA、蛋白质和RNA。
酚和氯仿可以破坏蛋白质和RNA的特定化学键并将它们溶解到有机层中，从而将DNA分离出来。
1.2DNA纯化在DNA提取后，我们还需要进行一系列步骤进行纯化，以满足后续实验的需要。
DNA纯化技术有许多种，其中最常用的方法是凝胶电泳分离法和琼脂糖柱层析法。
1.2.1凝胶电泳分离法凝胶电泳分离法基于DNA分子在电场中的不同迁移率，将不同大小的DNA分子分离开来。
通常会使用琼脂糖凝胶，将样品加载到凝胶上，然后施加电场。
DNA纯化后可以通过凝胶电泳分离形成DNA条带。
1.2.2琼脂糖柱层析法琼脂糖柱层析法基于分子大小分离原理，将DNA分子从其他杂质中分离出来。
琼脂糖提供的凝胶材料可以形成孔隙状的微观结构，根据DNA分子的大小特性，在琼脂糖柱中实现纯化步骤。
2.DNA纯化技术在分子生物学领域的应用2.1PCR技术PCR是分子生物学领域最重要的技术之一，它利用DNA复制的原理进行DNA扩增。
在PCR试验中，对DNA纯化高纯度的DNA样品带来了生动的提高，能够有效避免样品受到自然生物体中DNA快速分解的影响，确保进行PCR扩增的过程高度可重复。
2.2基因测序在基因测序领域中，DNA纯化是获取高质量基因组数据的基础。
DNA纯化的质量对其他下游实验步骤的抗干扰性、可重复性等多个方面均有显著的影响。
DNA纯化技术让研究人员能够更好地获得准确的测序结果，用以解决现代医学许多疾病的研究。
第四章 目的基因的获得-PCR
5’ ATCTTGAAC
模板
Taq
TGCATGCAT 3’ ACGTACGTA 5’
5’ ATCTTGAAC 3’ TAGAACTTG
Taq
模板
ACGTACGTA 5’
4. 1个循环的结果
5. 新一轮循环开始 变性—复性—延伸。
DNA elongation
理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。
（2）合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的 二核苷酸聚合。
2. 亚磷酸三酯法 原理
将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先以3′-OH
与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接， 然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使 用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具 体的合成和延伸过程如图。
人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所 要扩增的模板DNA双链的5‘端相同。
模板
5’ ATCTTGAAC 引物
5’ ATCTTGAAC 3’ 3’ TAGAACTTG
TGCATGCAT 3’ 3’ ACGTACGTA 5’
引物
模板
ACGTACGTA 5’
3. DNA链的延伸
72 oC
DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链
(d)
3’
3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链 5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
（四）PCR的特点
(NEW)朱玉贤《现代分子生物学》(第5版)笔记和课后习题(含考研真题)详解
4.3 名校考研真题详解 第5章 分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术
5.1 复习笔记 5.2 课后习题详解 5.3 名校考研真题详解 第6章 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术 6.1 复习笔记 6.2 课后习题详解 6.3 名校考研真题详解 第7章 原核基因表达调控 7.1 复习笔记 7.2 课后习题详解 7.3 名校考研真题详解 第8章 真核基因表达调控 8.1 复习笔记 8.2 课后习题详解 8.3 名校考研真题详解
② T2噬菌体感染大肠杆菌实验
a．在分别含有35S和32P的培养基中培养大肠杆菌。
b．用上述大肠杆菌培养T2噬菌体，分别制备含35S的T2噬菌体和32P的
T2噬菌体。
c．分别用含35S的T2噬菌体和32P的T2噬菌体感染未被放射性标记的大 肠杆菌。
d．培养一段时间后，将混合液离心，检测子代噬菌体放射性。上清液 主要是噬菌体，沉淀物主要是大肠杆菌。
（4）基因组、功能基因组与生物信息学研究
基因组计划是一项国际性的研究计划，其目标是确定生物物种基因组所 携带的全部遗传信息，并确定、阐明和记录组成生物物种基因组的全部 DNA序列。
功能基因组学相对于测定DNA核苷酸序列的结构基因组学，其研究内容 是在利用结构基因组学丰富信息资源的基础上，应用大量的实验分析方 法并结合统计学和计算机分析方法来研究基因的表达、调控与功能，以 及基因间、基因与蛋白质之间和蛋白质与底物、蛋白质与蛋白质之间的 相互作用和生物的生长发育等规律。功能基因组学的研究目标是对所有 基因如何行使其职能从而控制各种生命现象的问题作出回答。
严格地说，重组DNA技术并不完全等于基因工程，因为后者还包括其他
可能使生物细胞基因组结构得到改造的体系。
生物技术制药复习题
生物技术制药复习题第一章绪论第一节生物技术的发展史1、生物技术：以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有与其性状的新物种或新品系，并与工程结合，利用这样的新物种进行加工生产，为社会提供商品服务的一个综合性技术体系。
它的范畴：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、生化工程。
基因工程是生物技术的核心。
P12、蛋白质工程----第二代基因工程；海洋生物技术-----第三代生物技术P13、生物技术发展史：传统、近代（抗生素、发酵罐）、现代（DNA重组）P31974年，Boyer和Cohen建立了DNA重组技术1975年，Koher 和Milstein 建立了单克隆抗体技术1982年，第一个基因工程药物重组人胰岛素被批准上市1989年，我国第一个基因工程药物干扰素批准上市2003年，中国的重组腺病毒-p53注射液成为石阶上第一个正式批准的基因治疗药物。
第二节生物技术药物1、生物技术制药：生物技术制药：采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。
P42、生物技术药物：采用DNA重组技术活其他生物技术研制的蛋白质或核酸类药物。
它与天然生化药物、微生物药物、海洋药物和生物制品共同归为生物药物。
3、现代生物药物分为4类：重组DNA技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；基因药物；天然药物；合成与部分合成药物。
4、生物药物按用途分为：治疗药物；预防药物；诊断药物。
5、生物技术药物的特征：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强、疗效高；（4）稳定性差（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络性效应；（10）检验的特殊性。
第三节生物技术制药1、生物技术制药的特征：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益。
P52、生物技术在制药中的应用有哪些？P7（1）基因工程制药：① 开发基因工程药物，如干扰素（IFN）、红细胞生成素（EPO）等②基因工程疫苗，如乙肝基因工程疫苗③基因工程抗体，它可以作为导向药物的载体④基因诊断与基因治疗⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型⑥应用极影工程激活素改良菌种，产生新的微生物药物⑦改进药物生产工艺⑧利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。
DNA的化学合成及应用
DNA化学合成基因是由具有特定的核苷酸顺序的核酸组成的功能单位，它携有特定的遗传信息，在染色体上按一定的顺序排列。
基因的基本单位为核苷酸，每个核苷酸包含三种成分：碱基、戊糖和磷酸。
DNA的单体单位为脱氧核苷酸，其中戊糖是D-2-脱氧核糖。
四种碱基分别为腺嘌呤(A) 、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
在核苷酸中两类杂环化合物嘧啶和嘧呤具有很明显的芳香族特性。
嘌呤本身可以认为是嘧啶的1种衍生物，它是1个嘧啶环和咪唑环耦合在一起组成的。
在大多数细胞中，碱基只有少数呈游离或不结合形式存在，而且它们通常是酶水解核苷酸的产物。
游离嘧啶和嘌呤碱基在水中是相对难溶解的，是弱碱性化合物，随pH不同能以两种或多种互变异构的形式存在。
嘧呤碱基的第九氮原子或嘧啶碱基的第一氮原子与戊糖的第一碳原子形成β-N糖苷酸通称核苷。
核苷按所含糖的不同分为：D-核糖核苷类和2-脱氧-D-核糖核苷类。
在大多数细胞中只有微量的游离核苷存在。
核苷比相应的碱基易溶于水，在不同pH条件下存在与碱基类似的互变异构，N-糖苷键对酸不稳定。
核苷的磷酸酯称核苷酸。
核糖有3个游离羟基，所以核糖核苷酸有2′、3′和5′核苷酸。
脱氧核糖只有2个羟基可以酯化，故脱氧核糖核苷酸只有3′和5′核苷酸。
核酸分子是由核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接而成。
DNA的化学合成研究始于50年代。
1952年阐明核酸大分子是由许多核苷酸通过3′－5′磷酸二酯链键连接起来的这个基本结构以后，化学家们便立即开始尝试核酸的人工合成。
英国剑桥大学Todd实验室于1958年首先合成了具有3′→5′磷酸二酯键结构的TpT和pTpT，此后，Khorana等人对基因的人工合成作出了划时代的贡献，不仅创建了基因合成的磷酸二酯法，而且发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基及缩合剂和合成产物的分离、纯化方法。
到目前为此，使用的DNA合成方法有磷酸三酯法、亚磷酸酯法及亚磷酸酰胺法。
第四章DNA复制
4. DNA ligase： 连接冈崎片断。
4: 终止与分离 Termination and Segregation
终止
•引起终止的序列称为终止位点（ter site） 两个复制叉在Ori C 约1800的对面相遇 •Tus 蛋白: 终止位点结合蛋白， 可阻止Dna B解旋
大肠杆菌复制终点定位偏 离复制叉实际相遇点
• 就DNA复制而言，引物酶（dna G基因产物）合成RNA 链，它提供引发末端
DNA聚合酶需要3‘－OH 端来起始复制
有多种方法可以提供DNA聚合酶起始DNA合成的3‘OH端
大肠杆菌中发现的两类引发反应：
引发需要解旋酶、SSB和引物酶
1、ori C系统
2、ØX系统: 引发体（primosome）
Segregation
•拓扑异构酶IV（Topoisomerase IV）:
一种II型拓扑异构酶，功能是使子链
分离，DNA分配到两个子细胞中。
第四节
真核生物DNA的复制
离体实验体系 起始 端粒的复制
1: 离体实验体系
• 酵母（Sacharomyces cervisiae) • 猿猴病毒40（SV40） • 非洲爪蟾（Xenopus laevis）的卵中提出的无 细胞提取物
5 大肠杆菌DNA聚合酶(DNA Polymerase)
硫氧还蛋白 拇指
DNA聚合酶的一般结构 “右手”结构： 拇指（thumb） 手指（finger） 手掌（palm）
手指
扭曲的ＤＮＡ
DNA位于手掌上 由拇指和手指形 成的槽中
噬菌体T7 DNA聚合酶与 DNA复合体的晶体结构
核酸外切酶结构域 拇指结构域：与DNA结 合并在前进中起重要作 用
吴乃虎《基因工程原理》4-6知识点总结
第4章基因操作的主要技术原理基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。
DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。
一、核酸的分离和纯化技术核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。
DNA：真核生物染色体DNA——双链线性；真核生物的细胞器DNA——双链环状；原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。
RNA：RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。
一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。
DNA提取的目的（1）可用PCR从基因组中扩增基因；（2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系；（3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因；（4）作酶切图谱，用于DNA测序。
（一）总DNA的提取DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。
14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。
总DNA：一般来说是指基因组DNA ，即细胞核内的染色体DNA分子。
核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。
其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。
分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。
尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。
（1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则：①防止和抑制内源DNase对DNA的降解；DNase 以Mg2+、Mn2+为辅助因子，只要加入一定的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。
②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。
动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。
（2）DNA提取的主要操作过程（3）DNA提取的主要问题及解决方法：①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增；多酚、单宁、色素等氧化所致。
基因工程复习总结
思考题第二章分子克隆工具酶1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
2.说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。
3.限制内切核酸酶的星活性是指什么？在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。
引起星星活性的因素:甘油浓度高（>5%），酶过量（>100U/ml），离子强度低（<25 mmol/L），pH 值过高（>8.0），或是加了有机溶剂如DMSO（二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如Mn2+、Cu2+、Co2+ 或Zn2+代替了Mg2+。
4.T4 DNA ligase 和 E.coli ligase 有什么异同？5.连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是37℃，但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16℃间，通常多选用12-16℃ 30分钟到16小时。
6.什么是Klenow酶？有什么作用？Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5′―3′外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3′―5′外切活性不受影响。
也称为Klenow片段（Klenow frgment），或 E.coli DNA 聚合酶Ⅰ大片段（E.coli DNA polymeraseⅠlarge fragment）。
它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。
由于没有5′―3′外切活性，使用范围进一步扩大。
①补平3′凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。
②抹平DNA3′凸端在3′―5′外切活性③通过置换反应对DNA进行末端标记④在cDNA克隆中合成第二链⑤随机引物标记⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA···7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？···8.哪些工具酶可以用于探针标记？T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。
DNA的化学合成及应用
DNA化学合成基因是由具有特定的核苷酸顺序的核酸组成的功能单位，它携有特定的遗传信息，在染色体上按一定的顺序排列。
基因的基本单位为核苷酸，每个核苷酸包含三种成分：碱基、戊糖和磷酸。
DNA的单体单位为脱氧核苷酸，其中戊糖是D-2-脱氧核糖。
四种碱基分别为腺嘌呤(A) 、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。
在核苷酸中两类杂环化合物嘧啶和嘧呤具有很明显的芳香族特性。
嘌呤本身可以认为是嘧啶的1种衍生物，它是1个嘧啶环和咪唑环耦合在一起组成的。
在大多数细胞中，碱基只有少数呈游离或不结合形式存在，而且它们通常是酶水解核苷酸的产物。
游离嘧啶和嘌呤碱基在水中是相对难溶解的，是弱碱性化合物，随pH不同能以两种或多种互变异构的形式存在。
嘧呤碱基的第九氮原子或嘧啶碱基的第一氮原子与戊糖的第一碳原子形成β-N糖苷酸通称核苷。
核苷按所含糖的不同分为：D-核糖核苷类和2-脱氧-D-核糖核苷类。
在大多数细胞中只有微量的游离核苷存在。
核苷比相应的碱基易溶于水，在不同pH条件下存在与碱基类似的互变异构，N-糖苷键对酸不稳定。
核苷的磷酸酯称核苷酸。
核糖有3个游离羟基，所以核糖核苷酸有2′、3′和5′核苷酸。
脱氧核糖只有2个羟基可以酯化，故脱氧核糖核苷酸只有3′和5′核苷酸。
核酸分子是由核苷酸通过3′→5′磷酸二酯键连接而成。
DNA的化学合成研究始于50年代。
1952年阐明核酸大分子是由许多核苷酸通过3′－5′磷酸二酯链键连接起来的这个基本结构以后，化学家们便立即开始尝试核酸的人工合成。
英国剑桥大学Todd实验室于1958年首先合成了具有3′→5′磷酸二酯键结构的TpT和pTpT，此后，Khorana等人对基因的人工合成作出了划时代的贡献，不仅创建了基因合成的磷酸二酯法，而且发展了一系列有关核苷酸的糖上羟基、碱基的氨基和磷酸基的保护基及缩合剂和合成产物的分离、纯化方法。
到目前为此，使用的DNA合成方法有磷酸三酯法、亚磷酸酯法及亚磷酸酰胺法。
第四章 基因的鉴定与表达分析
灵敏度，可以检测到一些稀有转录子。
CpG岛法
CpG岛(CpG island)是基因组DNA序列中富含C、G的 DNA区域。在大规模的DNA测序中，每发现一个CG岛，意 味着在此区域有一个基因。利用CpG岛稀有酶如SacⅡ、
BssHⅢ、EagⅠ、HpaⅡ、NotⅠ识别其位点，切割基因组
DNA。CpG岛又称HIF岛，即用HpaⅡ酶将CpG岛周围的DNA 切成许多小片段，这些序列称为HIF序列。 原理： 2) 载体上要有功能强大的真核基因启动子，以获得高 效表达； 3）还要有原核生物的复制子与生长选择标记（如Amp)，
能在大肠杆菌中扩增，又要有真核生物的复制子、启动
子、加尾信号等以便在真核细胞中扩增及转录。
cDNA选择方法
基因组图谱绘制和基因定位克隆的常见问题 是大片段基因组编码DNA的鉴定。为解决此问题，
IEF)和十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，把复杂的蛋白质混合物中的蛋白在二维平面上分 离展开。
基因差异表达法
---二维电泳（two-dimensional electrophoresis）技术
步骤： 样品制备→等电聚焦→平衡转移→ SDS— PAGE→斑点染色→图像捕捉和图谱结构确定
随着人类基因组计划的完成，基因的鉴定与表 达分析已经成为功能基因组研究的一个重要内容。
基因的特异性特征：
整体上的高度进化保守；
表达RNA转录物----具有可读框(ORF)；
脊椎动物-----CpG岛
一、基因的鉴定方法
常规方法
特异方法
（thern印迹杂交； 同源序列比对； 动物基因组印迹杂交；
• 主要步骤：
制备载体→将基因组片段亚克隆至表达载体中→
现代分子生物学课后习题及答案(朱玉贤 第3版)
现代分子生物学课后习题及答案（共10章）第一章绪论1．你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？答：分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。
狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。
分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。
所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。
这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。
这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。
阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。
2．分子生物学研究内容有哪些方面？答：分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。
由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。
由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。
研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。
遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。
重组DNA的转化与筛选
第四章重组DNA的转化与筛选载体与目的基因连接后，体系中可能存在下列分子：a. 未连接的载体分子b. 未连接的DNA片段c. 载体的自连d. 含有错误插入片段的重组DNA分子e. 重组DNA分子转化过程中，这些分子同时被转移到宿主细胞内。
未连接的分子即使被细菌摄取，只有在特殊的条件下才能复制，寄主的酶可降解这些DNA片段。
自连的载体和错误插入的重组质粒可以进入宿主细胞进行正常的复制。
因此，需要将重组克隆鉴定出来。
第一节细菌的转化方法自然界中，转化并不是细菌或的遗传信息的主要方式，实验室中只有小部分的细菌可以很容易的转化，进一步的研究发现，这类细菌含有DNA结合和吸收的代谢机制。
正常条件下，大部分细菌包括大肠杆菌，只能吸收有限的DNA，为了提高转化效率，建立了一系列的转化方法：a. 热激法转化感受态细胞b. PEG介导的原生质体转化c. 高压电穿孔法转化d. 显微注射法转化e. 接合转化f. 噬菌体转染表4—1 大肠杆菌常用转化方法的比较图4-1 热激法转化感受态的过程一、受体细胞应具备的条件a. 限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）b. 重组整合缺陷型RecA-（对于用于基因扩增或基因高效表达的受体）c. 具有较高的转化效率d. 具有与重组体互补的遗传性状e. 感染与寄生缺陷型安全角度的要求。
二、大肠杆菌感受态的制备与转化转化的突破发生在1970s的早期，研究发现，在冷的盐溶液中转化的效率提高。
一般利用50mM的CaCl2，其他的盐如氯化铷也有较高的效率。
经过处理的细胞称为感受态细胞。
感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
目前，机理尚不清楚，可能是CaCl2导致DNA分子沉淀到细菌细胞的外壁上，或者CaCl2与提高细菌结合的变化有关。
质粒DNA的分离`纯化
质粒DNA－煮沸法 煮沸法原理
染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线 状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性， 共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成 沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在 液相中，从而可通过离心将两者分开。
一实验原理实验二实验二质粒质粒dnadna的分离纯化的分离纯化可再生资源利用与加工实验教学中心质粒质粒dnadna煮沸法煮沸法染色体dna比质粒dna分子大得多且染色体dna为线状分子而质粒dna为共价闭合环状分子
可再生资源利用与加工实验教学中心
实验二 质粒DNA的分离、纯化 一、实验原理
质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb 到200kb。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环 状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内 的共生型遗传因子。 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和 转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase
pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
五、质粒DNA提取常见问题 问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？
原 因
1. 2. 3. 4.
1.
请涂布平板培养后，重新挑 选新菌落进行液体培养 可减少菌体用量或增加溶液 的用量 不要频繁转接，每次接种时 应接种单菌落。检查抗生素 使用浓度是否正确。 溶液Ⅱ在温度较低时可能出 现浑浊，置于37℃保温片刻 直至溶解为清亮的溶液。
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能 使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细 胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时 释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就 会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性， 质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以 复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细 胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒 DNA从细菌中提取出来。
第四课 离心吸附柱法纯化PCR产物
注：本实验每位同学起始样品为25µlPCR产物。
2. 3. 4. 5. 6. 将吸附柱AC放入收集管中，再将溶液转移至吸附柱内，室温放置一分钟， 12000 rpm离心1分钟，弃去收集管内废液，再将离心柱放回收集管中。 加入漂洗液 WB 700µl（确认已加入无水乙醇！），12000 rpm离心1分钟， 弃去收集管内废液，将吸附柱放回收集管。 加入漂洗液 WB 500µl，12000 rpm离心1分钟，弃去收集管内废液，将吸 附柱放回收集管。 12000 rpm离心2分钟,以尽量除去漂洗液，以免漂洗液中的残留乙醇抑制 下游反应。 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中。在吸附膜中心位置加入50µl洗脱 液EB，不要触及滤膜。室温放置2分钟。 注：本实验用30µlEB洗脱。 12000 rpm离心1分钟。 如欲使洗脱更为充分，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱，12000 rpm离 心1分钟。 -20℃保存。
注意事项
• • • • • • 第一次使用前先在漂洗液WB中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记， 以免多次加入。 在低温时溶液可能形成沉淀，使用前在37℃加热使溶液澄清。待溶液恢复到室 温后使用。 各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、 PH值变化。 所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。 如纯化的DNA片段大小在100bp到50kb之间，起始量在5µg-25µg之间则回收 率可达85%-95%。否则回收效率将大大降低。 85%-95% 如DNA和结合液混合后PH值≤7.5，溶液保持黄色，吸附膜吸附DNA的效率最 高。如果溶液变成橘红色或淡紫色，则说明PH偏高，可在溶液中加5-10µl的 3M醋酸钠（PH5.2）将PH值调到5-7之间（溶液呈黄色）。 适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30µl将降低洗脱效率。 洗脱液EB不含EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以用PH大于7.5的 水洗脱。PH过低影响洗脱效率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
4.1.4 DNA修饰酶 DNA修饰酶
添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶 添加或删除化学基团来修饰DNA分子的酶
碱性磷酸酶 多核苷酸激酶 末端脱氧核苷酸 转移酶
4.1.5 拓扑异构酶
引入或去除DNA超螺旋
4.2.1 限制性内切酶的发现和其功能
E.coli λ 噬菌体的限制和修饰模式（表中数字代表相对 种植效率
B株不能产生限制性内切酶，其它来源入 噬菌体可以感染 株，在B株繁 株不能产生限制性内切酶，其它来源入-噬菌体可以感染 噬菌体可以感染B株 株不能产生限制性内切酶 株繁 殖，入-噬菌体则在 K株和 C株 受到严格的限制作用 噬菌体则在 株和 株
(三) 限制性内切酶的分类 三
I类酶 类酶 酶分子 识别位点 切割位点 限制性反应与甲 基化反应 限制作用 三亚基双功能 二分非对称序列 距识别位点 1000bp 互斥 需要 II类酶 类酶 内切酶与甲基化 酶分离 III类酶 类酶 二亚基双功能
4-8bp序列，回文 序列， 序列 5-7bp非对称序列 非对称序列 结构 在识别位点中或 在 识 别 位 点 下游24-26bp 靠识别位点 下游 分开反应 需要 同时竟争 不需要
4.2.2 限制性内切酶Ⅱ在特定的核苷酸序列处 限制性内切酶Ⅱ 切割DNA 切割DNA
识别位点 一般为4-6个bp的回文序列 切割位点 大多数酶作用于底物DNA 双链，位点在识别序列中 或靠近识别序列 少数酶能作用于回文序列相 应DNA单链序列
(二)、限制和修饰作用的分子机制
5．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新 ．但丧失在原宿主细胞中的存活能力，
宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标 一但入K 株成功， 记(一但入 噬菌体在 C株成功，由 C株繁殖出 λ 一但入 株成功 株繁殖出 K 后代，能感染 C 株, 不能感染原来 K株.) 后代， 株 6．细菌利用限制和修饰系统来区分自身 ．细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外来 与外来 DNA。 。
星号活性
在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切 限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代 Mg2+以及高pH值等等)，有些核酸内切限制酶识别 序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识 别序列以外的其它位点切割DNA分子。 例如，EcoRI限制酶，正常：识别GAATTC 但如果缓冲液中的甘油浓度超过5%(v／v)，其识别 序列的特异性发生松动，可在AATT或PuPuATPyPy 序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识 别能力，通常叫做星号活性 星号活性，以EcoRI*表示。 星号活性
Hsu I
4.2.4 DNA分子中识别序列的出现频率 DNA分子中识别序列的出现频率
假设DNA中的四种核苷酸是随机分布的 中的四种核苷酸是随机分布的 假设 识别序列长度不同, 识别序列长度不同 显示切割频率 如: GATC G, A, T, and C nucleotides（i.e. 25% of each）, 每 （ ） 256 (44)出现一次 出现一次 六个碱基, 六个碱基 46 (4096) bp 八个碱基, 八个碱基 48 (65536) bp. 但实际基因组中核苷酸的分布并不是随机 λ DNA
限制性内切酶Ⅱ 限制性内切酶Ⅱ切割特异位点的机理
4.2.3 平末端和粘性末端
平末端： 平末端： 两条链上的断裂位置是处 在一个对称结构的中心，形成的DNA 在一个对称结构的中心，形成的 片段具有平末端。 片段具有平末端 粘性末端： 粘性末端：指DNA分子在限制酶的作 分子在限制酶的作 用下形成的具有互补碱基的单链延伸 末端结构， 末端结构，它们能够通过互补碱基间 的配对而重新环化起来。 的配对而重新环化起来。
λ DNA
在一个环状DNA分子上，若某种限制性 分子上， 在一个环状 分子上 核酸内切酶只有一个识别序列， 核酸内切酶只有一个识别序列，经过切割后 产生一个线形DNA片段，类推有 个识别序 片段， 产生一个线形 片段 类推有n个识别序 经过完全切割后就可以得到n个 列．经过完全切割后就可以得到 个DNA片 片 段。 在一个线形DNA分子上若某种限制性核 分子上若某种限制性核 在一个线形 酸内切酶有n个识别序列 个识别序列， 酸内切酶有 个识别序列，经过完全切割后 片段。 可得 （n+1） 个DNA片段。 ） 片段
限制酶识别与切割的靶点序列及其随 后的连接同DNA的来源无关， DNA的来源无关 后的连接同DNA的来源无关，即不带有种 的特异性，对各种DNA DNA普遍适用 的特异性，对各种DNA普遍适用 。 据这一特性，才能将不同来源的DNA 据这一特性，才能将不同来源的DNA 片段重组成新的重组体分子或是新的基 因。
λ 噬菌体 E.coli菌株 菌株
λK 1 10-4 1
λB 10-4 1 1
λC 10-4 10-4 1
K B
限制性内切酶的发现— （一）、限制性内切酶的发现—宿主细 ）、限制性内切酶的发现
胞的限制和修饰作用 1 宿主细胞的限制和修饰作用： 宿主细胞的限制和修饰作用： 两种不同来源的入-噬菌体 两种不同来源的入 噬菌体 λK； λC，能高频感 ； ， 染各自大肠杆菌宿主细胞（ 株 染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，C 株 ）。 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时， 当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下 降数千倍。 株成功， 降数千倍。一但 λK 噬菌体在 C 株成功，由 C 后代， 株繁殖出λ K 后代，能感染 C 株, 不能感染原 来 K株. 株
从生物秀网站下载
（一）DNA连接酶的作用模式 （一）DNA连接酶的作用模式
1 定义：能够催化在两条 定义：能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶 链之间形成磷酸二酯键的酶
5’－末端形 ’ 成DNA－腺苷 － 酸复合物
2 DNA连接酶的两种类型 DNA连接酶的两种类型
连接酶（只连接粘末端） 类型 I：E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） ： 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主 利用 （烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体， 要来源于原核生物 类型 II：T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） ： 连接酶（粘末端和平末端） 连接酶 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物 噬菌体 作为能量供体， 利用 作为能量供体 主要来源于真核生物T4噬菌体 也属于此类 在基因工程的实验中主要用T 在基因工程的实验中主要用 4 DNA连接酶 连接酶
4 注意
1 被连接的两条DNA链必须是双螺旋 链必须是双螺旋DNA分子的一部 被连接的两条 链必须是双螺旋 分子的一部 连接酶并不能连接两条单DNA分子或环化 分，DNA连接酶并不能连接两条单 连接酶并不能连接两条单 分子或环化 的单链DNA分子。 分子。 的单链 分子 DNA连接酶只能连接并封闭双螺旋 连接酶只能连接并封闭双螺旋DNA分子所出现 连接酶只能连接并封闭双螺旋 分子所出现 的缺口（ ），即封闭双链 的缺口（Nick），即封闭双链 ），即封闭双链DNA上两个相邻核苷 上两个相邻核苷 酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的断裂
(二)、限制和修饰作用的分子机制
2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，C株 中， 入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 株 株 1）宿主细胞甲基化酶，将染色体 和噬菌体DNA特异性保 ）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体 和噬菌体 特异性保 护. 2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。------（修饰） ）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。 （修饰） 3．当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 ．当外来 入侵时， 入侵时 ----------（限制） （限制） 4. 由于降解不完全，外来少数 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程 分子在宿主细胞中繁殖过程 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。
第4章 DNA纯化后的利用 DNA纯化后的利用
Restrict ion site
Restriction site Restrictio n ezymes
4.1 DNA操作酶的范围
核酸酶 连接酶 聚合酶 修饰酶 拓扑异构酶
4.1.1 核酸酶
外切核酸酶 内切核酸酶
外切核酸酶
切割 双链 Bal 31 单链 外切核酸酶Ⅲ
4.2.6 对限制性内切酶的酶切结果进行分析
用EB进行染色
放射自显影
缺口平移法（ nick translation） 末端填平发(end filling)
4.2.8 通过作图标出一个DNA分子上的不同限制 通过作图标出一个DNA分子上的不同限制 性位点
4.3连接----DNA分子连接到一起
(二 )限制和修饰作用的分子机制 二 限制和修饰作用的分子机制
1．大肠杆菌宿主细胞 K株，C株 ，有各自的限制和修饰系统。 ． 株 株 有各自的限制和修饰系统。 1） 它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; ） 它们均有三个连续的基因位点控制， hsdS. 2） hsdR编码限制性核酸内切酶 识别DNA分子特定位 ） 编码限制性核酸内切酶---识别 分子特定位 编码限制性核酸内切酶 识别 将双链DNA切断。 切断。 点，将双链 切断 3） hsdM编码产物是 ） 编码产物是DNA甲基化酶 催化DNA分子特定 甲基化酶---催化 分子特定 编码产物是 甲基化酶 催化 位点的碱基甲基化反应。 位点的碱基甲基化反应。 4） hsdS表达产物的功能是 协助限制性核酸内切酶和 ） 表达产物的功能是---协助限制性核酸内切酶和 表达产物的功能是 甲基化酶，识别特殊的作用位点。 甲基化酶，识别特殊的作用位点。
4.2.5 在实验室条件下进行限制性酶切
一般20ul酶切体系 酶切体系 一般 缓冲液（ × 缓冲液（10×） 离子强度（ 、 离子强度（Na、Mg2+） pH7.4 还原剂 酶量（ 个酶单位 个酶单位： 酶量（1个酶单位： 1h切割 切割1ugDNA所需要的酶量） 所需要的酶量） 切割 所需要的酶量 反应温度： ℃ 反应温度：37℃