用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法-精品文档
几种分子生物学方法在菌种鉴定中的应用
８０８ｂｐ的酶切片段，因此模拟结果与实际酶切结果是一致的。 在图５中，ＨＳＩ、ＨＳ６、ＸＬｌ与其它Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ菌属细菌的带型一
样，并与Ｂａｃｉｌｌｕｓ聚为一个大类，表明了这两个菌属较近的亲缘 关系，ＬＨｌ则与其它Ｔｈｅｒｍｕｓ菌属细菌聚为另一类群。已报道，
１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ可用于种到属水平的研究…，图５也证明 了这一点，即酶切图谱在Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ三个属之
结合完善的数据库，１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析可以快速，准确地 对微生物进行分类鉴定，确定微生物在进化中的位置，它已成 为微生物分类学中最重要的方法。当鉴定同源性很高的菌种
时，可以其它方法作为补充，但１６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析在分类学中 的地位仍是无法代替的。ＲＥＰ—ＰＣＲ方法因其简单、快速、灵 敏、同一实验室内重复性高，它在遗传多样性研究及鉴定同源
问容易区分；同一属内的不同种之间，多数能区分，有的却不能 区别；但在同一种内不同菌株之间的分辨能力较差。从１６Ｓ ｒＤ． ＮＡ序列的相似性来看，ＰＣＲ—ＲＦＬＰ方法基本上以９６％为界，相
似性在９６％以下，酶切图谱不同，而相似性在９６％以上，酶切图 谱就难以区分了。
２．３ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列分析：将４个分离菌株的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列与 ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库中的序列进行同源性比较，表１列出了与它们
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图５ １６Ｓ ｒＤＮＡ序列的Ａｌｕ Ｉ酶切图谱的聚类分析树状图（Ｄｉｅｅ／ＵＰＧＭＡ） 相似性（％）为各菌株与ＸＬｌ的１６Ｓ ｒＤＮＡ序列比对结果
３７７ ＤＮＡ ＳＥＱＵＥＮＣＥＲ进行测序。
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环境微生物菌种鉴定
环境微生物菌种鉴定微生物是地球上数量最多的生物，它们在我们的生活和环境中无处不在。
为了更好地利用和保护这些微生物资源，我们需要对它们进行鉴定和分类。
本文将介绍环境微生物菌种鉴定的基本方法和应用领域。
一、微生物菌种鉴定的基本方法1、形态学鉴定形态学鉴定是根据微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征对其进行分类和鉴定的一种方法。
通过观察菌落的形状、大小、质地、颜色、边缘特征等，可以初步判断微生物的种类。
2、生理生化鉴定生理生化鉴定是通过测试微生物对各种底物的发酵反应和代谢产物的性质，判断其生理生化特性，从而对其进行分类和鉴定的一种方法。
常见的生理生化试验包括糖发酵试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验等。
3、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是基于微生物基因组序列差异对其进行分类和鉴定的方法。
该方法通过提取微生物基因组DNA，进行PCR扩增，然后进行序列比对，判断微生物的种类和亲缘关系。
二、环境微生物菌种鉴定的应用领域1、环境保护环境微生物菌种鉴定在环境保护方面具有广泛的应用。
例如，在污水处理中，通过鉴定微生物的种类和数量，可以优化污水处理工艺，提高处理效率。
在土壤污染治理中，通过鉴定能够降解特定污染物的微生物种类，可以针对性地设计生物治理方案。
2、生物多样性研究环境微生物菌种鉴定在生物多样性研究中具有重要意义。
通过对不同生态环境中的微生物进行鉴定，可以揭示不同地区和不同气候条件下的生物多样性特征，为保护生物多样性和生态平衡提供科学依据。
3、生物技术应用环境微生物菌种鉴定在生物技术领域具有广泛的应用。
例如，在生物制药中，通过鉴定微生物的种类和代谢产物，可以发现新的药物资源和开发新的药物。
在农业微生物肥料开发中，通过鉴定微生物的种类和生理生化特性，可以研制出具有特定功能的微生物肥料。
三、总结环境微生物菌种鉴定是微生物资源保护和利用的重要手段。
通过形态学、生理生化和分子生物学等方法对微生物进行分类和鉴定，可以更好地了解和利用这些资源。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
细菌的分类和鉴定
（一）生理学与生化学分类法
主要以细菌的形态、染色以及细菌的特 殊结条件等等。 主要有两种方法 1、传统分类法
2、数值分类法
1、传统分类法
主要以细菌的形态、生理特征为分类基 础，选择一些较稳定的生物学性状如细菌的 形态结构、染色性、培养特性、生化反应、 抗原性等作为依据，然后按主次顺序逐级区 分。
（二）生理生化特征
包括营养类型、与氧的关系、对温度的适应 性、碳水化合物的代谢试验、蛋白质和氨基酸的 代谢试验及的碳源和氮源利用试验、各种酶类试 验、抑菌试验等等。 生理生化特征特点： 对微生物生理生化特征的比较也是对微生物 基因组的间接比较； 测定生理生化特征比直接分析基因组要容易；
六、微生物分类鉴定的依据
根据微生物分类学中使用的技术和方法，可 把它们分成四个不同的水平：
①细胞形态和行为水平； ②细胞组分水平； ③蛋白质水平； ④基因组水平。
在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴 定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典 的分类鉴定法
七、细菌的分类方法
生物分类的传统指标
1、DNA G+C mol%测定
DNA分子两条链上4种碱基的总分子量 为100，测定其中G+C或A+T摩尔百分比， 能反应出细菌间DNA分子的同源程度，习惯 上以G+C 作为细菌的分类标记。 不同菌属间的G+C mol%范围很大，在 25%~75%之间，但同一种细菌G+C mol% 相当稳定，不受菌龄、培养条件和其它外界 因素影响，亲缘关系越近的细菌，它们G+C mol%越接近（但并非G+C mol%越接近， 亲缘关系就越近？？？）。
细菌的命名依据“国际细菌命名法规” 的规 定，学名用拉丁文，遵循“双名法”。即每一种 细菌的拉丁文名称由属名和种名两部分构成，属
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定的方法和步骤细菌鉴定是确定或确认细菌属种的过程，它是微生物学中非常重要的一部分，有助于了解细菌的特征、生态习性和其对人类的影响。
下面，我将介绍细菌鉴定的一般方法和步骤。
一、准备实验室条件和材料在进行细菌鉴定之前，需要准备好实验室条件和所需的材料。
实验室应具备洁净、无菌环境，预防细菌污染。
所需的材料包括培养基、培养皿、平板、显微镜、油浸物镜、背景颜色固定剂、染色试剂、耗材等。
同时，实验人员需要佩戴实验手套和口罩，保证操作的无菌性。
二、选择适当的培养基不同的细菌在不同的培养基上生长出不同的菌落，因此选择适当的培养基是细菌鉴定的关键。
常用的培养基有营养琼脂培养基、血琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。
根据需要鉴定的菌株特性和需求，选择适当的培养基。
三、样品采集和拮抗在开始鉴定之前，需要采集样品并进行扩培。
样品来源可以是病人的体液、环境中的土壤、水源、食品等。
样品采集最好是在无菌环境中进行，避免外来的细菌干扰结果。
四、制备纯培养物为了获得纯种细菌，需要将样品进行拮抗并分离。
拮抗是指将细菌分离成单独的菌落，并在新的培养基上获得单个菌种的纯培养物。
常用的方法有稀释再悬浮平板法、分离斑点法、筛选法等。
通过将菌落接种到培养基上，经过单菌的选择和培养，最终得到纯种菌株。
五、观察菌落特征观察菌落形态是进行细菌鉴定的重要步骤之一。
菌落特征包括菌落大小、形状、质地、边缘、颜色等。
通常使用肉眼或显微镜对菌落进行观察，并记录下菌落的特征。
六、进行染色处理染色是细菌鉴定中常用的方法之一。
根据细菌细胞壁的性质，通常使用革兰氏染色、苏木精-伊红染色等常规方法进行染色处理。
通过染色，可以初步了解细菌的形态、结构和染色特性。
七、观察细胞的形态和结构将已染色的细菌样本放置在显微镜下，使用油浸物镜进行镜片调焦。
观察细菌细胞的形态特征，如形状（球形、棒状、螺旋形等）、大小、连杆性等。
此外，还可以观察细菌细胞的结构、附属结构（如鞭毛、菌毛等）以及内部结构（如胞浆、核质等）。
细菌的分类和鉴定
（三）两类分类法的优点和意义
方 法 优 点 意 义
生理学与生化学 方便、简单、廉 主要用于鉴定 价 分类法 准确、可靠； 遗传学分类法 有利于了解细菌 主要用于分类 的进化和原始亲 缘关系
三、原核微生物（广义细菌）分类系统 原核微生物（广义细菌）
《伯杰鉴定细菌手册》 伯杰鉴定细菌手册》
(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology)
六、微生物分类鉴定的依据
根据微生物分类学中使用的技术和方法，可 把它们分成四个不同的水平： ①细胞形态和行为水平； ②细胞组分水平； ③蛋白质水平； ④基因组水平。 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴 定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典 的分类鉴定法
七、细菌的分类方法
生物分类的传统指标 分子生物学指标 微型、简便、快速或自动化鉴定技术 细菌的数值分类
包括营养类型、与氧的关系、对温度的适应 性、碳水化合物的代谢试验、蛋白质和氨基酸的 代谢试验及的碳源和氮源利用试验、各种酶类试 验、抑菌试验等等。 生理生化特征特点： 对微生物生理生化特征的比较也是对微生物 基因组的间接比较； 测定生理生化特征比直接分析基因组要容易；
2、数值分类法 、
对细菌各种生物学性状按“等重要原则” 进行分类，选用多项生理、生化指标逐一进 行比较，通过查表或计算机分析各菌间相似 度，完成细菌分类。
（二）遗传学分类法
以细菌的核酸、蛋白质等在组成的同源 性程度分类。 主要有三种方法 1、DNA G+C mol%测定 2、核酸同源值测定 3、核蛋白体RNA碱基序列测定
1、DNA G+C mol%测定 、 测定
DNA分子两条链上4种碱基的总分子量 为100，测定其中G+C或A+T摩尔百分比， 能反应出细菌间DNA分子的同源程度，习惯 上以G+C 作为细菌的分类标记。 不同菌属间的G+C mol%范围很大，在 25%~75%之间，但同一种细菌G+C mol% 相当稳定，不受菌龄、培养条件和其它外界 因素影响，亲缘关系越近的细菌，它们G+C mol%越接近（但并非G+C mol%越接近， 亲缘关系就越近？？？）。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
分⼦⽣物学鉴定细菌的⽅法具体操作步骤与注意事项16S rDNA鉴定细菌的⽅法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进⾏PCR扩增，电泳检测纯度与⼤⼩。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收⽬的⽚段5.⽬的⽚段测序。
6.BLAST⽐对获取相似⽚段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌⽣长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前⽤TE缓冲液对菌体进⾏洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），⾼温⾼盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升⾼1℃，pH⼤约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA?2H2O，⽤NaOH调pH⾄8.0（约20g）,⾼温⾼压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
⾼温⾼压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer⽤10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，⽤浓盐酸调pH⾄7.2。
室温保存。
⽤之前在65℃溶解。
配置时要戴⼝罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，⾼温⾼压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（⼗六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
⽤之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的⽐例加⼊异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的⽐例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
微生物的鉴定与鉴别方法
微生物的鉴定与鉴别方法微生物是一类极小的生物体，包括细菌、真菌、病毒等。
它们在自然界中广泛存在，对环境和人类健康都有重要影响。
因此，准确鉴定和鉴别微生物对于科学研究、医学诊断和环境监测等领域至关重要。
本文将介绍一些常用的微生物鉴定与鉴别方法。
一、形态学鉴定方法形态学鉴定是最基础的微生物鉴定方法之一。
通过观察微生物的形态特征，如细胞形状、大小、颜色等，可以初步确定其分类。
例如，细菌的形态学鉴定包括观察细菌的形状（球形、杆状、螺旋形等）、细胞壁结构（革兰氏染色反应）以及胞内结构（包括胞内器官和细胞内含物等）等。
二、生理学鉴定方法生理学鉴定方法是通过观察微生物在特定条件下的生理特征来进行鉴定。
例如，通过检测微生物的代谢产物（如酶活性、气体产生等）或对特定物质的利用能力（如碳源、氮源等），可以确定微生物的分类。
这些方法通常需要进行培养实验，包括生长速度、色素产生、产酸产气等。
三、分子生物学鉴定方法随着分子生物学技术的发展，分子生物学鉴定方法逐渐成为微生物鉴定的重要手段。
其中最常用的方法是基因测序技术。
通过测定微生物的特定基因序列，如16S rRNA基因（用于细菌鉴定）或ITS序列（用于真菌鉴定），可以准确地确定微生物的分类。
此外，还有PCR技术、DNA指纹图谱等方法也被广泛应用于微生物鉴定和鉴别。
四、免疫学鉴定方法免疫学鉴定方法是通过检测微生物的免疫反应来进行鉴定。
这些方法通常基于微生物与宿主免疫系统之间的相互作用。
例如，可以通过检测微生物的抗原或抗体来确定微生物的存在和种类。
免疫学鉴定方法在医学诊断中尤为重要，可用于检测病原菌引起的感染或疾病。
五、质谱鉴定方法质谱鉴定方法是通过测定微生物样品中的质谱图谱来进行鉴定。
质谱技术可以提供微生物样品中各种化合物的分子质量和相对丰度信息，从而确定微生物的分类。
质谱鉴定方法在微生物鉴定和鉴别中具有高灵敏度和高分辨率的优势，被广泛应用于食品安全、环境监测等领域。
综上所述，微生物的鉴定与鉴别方法多种多样，每种方法都有其独特的优势和适用范围。
细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展
细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展一、本文概述随着分子生物学技术的快速发展，其在细菌分类鉴定领域的应用已经取得了显著的进展。
本文旨在对细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展进行系统的梳理和总结，以期为相关领域的学者和从业人员提供全面的科研进展参考。
本文将重点介绍分子生物学技术在细菌分类鉴定中的应用，包括基因测序技术、PCR技术、基因芯片技术、宏基因组学方法等，并探讨这些技术在细菌分类鉴定中的优势、挑战以及未来发展趋势。
同时，本文还将对近年来细菌分类鉴定领域的重要研究成果进行综述，以期为细菌分类鉴定领域的研究提供有益的参考和启示。
二、细菌分类鉴定的传统方法及其局限性传统的细菌分类鉴定方法主要依赖于细菌的表型特征，包括菌落形态、细胞形态、生理生化特性、血清学反应以及生态习性等。
这些方法在过去的一个多世纪里为细菌学的发展做出了重要贡献，随着科学技术的进步和细菌学研究的深入，传统方法的局限性逐渐显现。
传统方法的鉴定过程往往繁琐耗时，需要经过多步实验操作，包括细菌培养、形态观察、生理生化试验等，这不仅增加了实验成本，也限制了鉴定效率。
传统方法对于某些表型特征相似的细菌种类往往难以准确区分，容易出现误判或漏判的情况。
传统方法对于新出现的、未知的或者难以培养的细菌种类往往束手无策，无法进行有效的鉴定。
随着分子生物学技术的发展和应用，人们开始尝试将分子生物学方法引入细菌分类鉴定领域，以期能够更快速、更准确地进行细菌鉴定。
分子生物学方法以其高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，为细菌分类鉴定提供了新的可能性和解决方案。
三、分子生物学方法在细菌分类鉴定中的发展与应用近年来，分子生物学技术的飞速发展极大地推动了细菌分类鉴定领域的研究进展。
这些技术以其高度的特异性和灵敏度，为细菌分类鉴定提供了全新的视角和强大的工具。
在细菌分类鉴定中，16S rRNA基因序列分析已成为最常用的方法之一。
16S rRNA基因在细菌中高度保守，同时又在不同种属间存在足够的变异，使得其成为细菌分类鉴定的理想靶标。
《伯杰氏细菌鉴定手册》
伯杰氏细菌鉴定手册引言伯杰氏细菌鉴定手册是一本专门针对细菌鉴定的指南。
本手册旨在帮助实验室技术人员和研究人员正确、迅速地识别和分类细菌。
通过本手册提供的详细步骤和实用技巧，用户可以更好地了解各种细菌的特征和性质，从而做出准确的鉴定结果。
目录•细菌鉴定原理•常用的细菌鉴定方法–形态学鉴定–生理生化鉴定–分子生物学鉴定•案例分析•结论细菌鉴定原理细菌鉴定是通过观察和分析细菌的形态、结构和生理特征等来确定其分类和鉴别的一种方法。
细菌鉴定的基本原理是通过对细菌样本进行一系列实验和测试，从中获取有关细菌特征的信息，并将这些信息与已知的细菌特征进行比对和对照，最终确定细菌的类别和身份。
常用的细菌鉴定方法细菌鉴定方法多种多样，下面介绍一些常用的方法：形态学鉴定形态学鉴定是通过观察细菌的形状、大小、颜色和结构等特征来对细菌进行初步鉴定。
常用的形态学鉴定方法包括显微镜观察、染色技术和胶体金技术等。
通过这些方法，可以获得细菌的形态学特征，如菌体形状、菌体长短、菌体的颜色等，从而初步确定细菌的分类。
生理生化鉴定生理生化鉴定是通过检测细菌在特定环境下的生理和生化特征来进行鉴定的方法。
常用的生理生化鉴定方法包括生长特性观察、代谢能力测试和酶活性检测等。
通过这些方法，可以获得细菌在不同环境条件下的生长特性和代谢能力，从而进一步明确细菌的分类。
分子生物学鉴定分子生物学鉴定是通过检测细菌的基因序列来确定其分类的一种方法。
常用的分子生物学鉴定方法包括PCR技术、DNA测序和引物设计等。
通过这些方法，可以获得细菌的基因序列信息，并与数据库中的已知细菌基因序列进行比对和对照，从而准确地确定细菌的身份。
案例分析以下是一个细菌鉴定的案例分析：案例：不明细菌的鉴定样本名称：不明细菌X实验步骤：1.形态学鉴定：使用显微镜观察，发现不明细菌X为短杆状，无荚膜。
2.生理生化鉴定：将不明细菌X接种在不同培养基中，观察其生长情况。
结果表明不明细菌X能够在大约37°C下生长，对氧气需求较高，利用葡萄糖进行发酵。
住院医师公共课程培训——常用分子生物学方法
住院医师公共课程培训——常用分子生物学方法引言分子生物学是一门研究生物体分子结构、功能和相互关系的学科。
在医学领域，分子生物学方法已经成为了重要的诊断和治疗工具之一。
本文将介绍一些常用的分子生物学方法，以提供住院医师在临床实践中的参考。
PCR（聚合酶链反应）PCR是一种常用的分子生物学技术，可以在试管中扩增特定DNA片段。
在临床诊断中，PCR可以用于检测病原体的存在，如病毒、细菌等。
此外，PCR还可以用于基因突变的检测和基因表达的定量分析。
蛋白质表达与纯化蛋白质表达与纯化是用于获得大量纯净蛋白质的方法。
通过转染细胞、诱导表达目标蛋白质，并利用蛋白质亲和层析、离心等技术得到纯净的蛋白质样品。
这对于研究蛋白质结构与功能、开发新药物等具有重要意义。
免疫印迹法免疫印迹法（Western blot）是一种检测特定蛋白质的方法。
通过将蛋白质样品在凝胶中进行电泳分离，再转移到膜上并使用特异性抗体进行探测，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。
免疫印迹法在临床诊断和研究中广泛应用，如检测肿瘤标志物、研究蛋白质通路等。
基因敲除与沉默基因敲除与沉默是一种研究基因功能的方法。
通过利用RNA 干扰（RNAi）技术或CRISPR/Cas9等工具干扰目标基因的表达，可以观察基因缺失或沉默对细胞或生物体的影响，从而研究基因功能与疾病机制。
单细胞测序单细胞测序是一种高通量的基因组学方法，可以对单个细胞进行基因组或转录组的测定。
通过单细胞测序，可以揭示细胞类型、基因调控网络等信息，对于理解疾病发生机制、分子细胞学等方面具有重要意义。
结论分子生物学方法在临床医学中的应用日益广泛，为疾病的诊断与治疗提供了新的手段与思路。
住院医师在公共课程培训中研究和掌握这些常用的分子生物学方法，能够更好地应用于临床实践，提高诊疗水平。
English TranslationIntroductionPolymerase Chain Reaction (PCR)Protein Expression and PurificationProtein expression and purification are methods used to obtain large quantities of pure proteins. Target proteins are expressed through transfection of cells and induction, and purified using techniques such as protein affinity chromatography and centrifugation. This is important for studying protein structure and function, as well as developing new drugs.Western BlottingWestern blotting is a method for detecting specific proteins. It involves separating protein samples through gel electrophoresis, transferring them onto a membrane, and detecting the target protein using specific antibodies. Western blotting is widely used in clinical diagnosis and research, such as detecting tumor markers and studying protein pathways.Gene Knockout and SilencingGene knockout and silencing are methods for studying gene function. By interfering with the expression of target genes using tools like RNA interference (RNAi) or CRISPR/Cas9, the effects of gene deletion or silencing on cells or organisms can be observed, leading to insights into gene function and disease mechanisms.Single-Cell SequencingSingle-cell sequencing is a high-throughput genomics method that allows for the determination of genome or transcriptome data from individual cells. Through single-cell sequencing, information about cell types, gene regulatory networks, and more can be revealed, providing important insights into disease mechanisms and molecular cell biology.Conclusion。
分子生物学方法鉴定微生物
核糖体构造和组分模式图
16S rRNA 小亚基 (30S) 21种核糖体蛋白 原核生物 大亚基 (50S) 23S rRNA 5S rRNA 34种核糖体蛋白 18S rRNA 小亚基 (40S) 33种核糖体蛋白 真核生物 大亚基 (60S)
28S rRNA
5.8S rRNA 51种核糖体蛋白
rRNA寡核苷酸编目分析
细菌常用固相杂交法：
（参照菌株）A菌 B菌（待测） ↓ ↓ DNA DNA ↓ ↓ （ 同位素标记、酶切并解链）单链 单链（固定于滤膜上，未标记） ↓ 最适温度复性杂交 ↓ 洗涤 ↓ 测定放射强度 ↓ 杂交率（以参照菌株自身复性的放射性值为百分之百 ） ﹥60%同一个种；﹥70%同一亚种；20～60%同属不同种
三、rRNA寡核苷酸编目分析
60年代末Woese 开始采用寡 核苷酸编目法对生物进行分 类，他通过比较各类生物细 胞的核糖体RNA(rRNA)特征 序列，认为16SrRNA及其类 似的rRNA基因序列作为生物 系统发育指标最为合适。
利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家
Carl Woese
三、rRNA寡核苷酸编目分析
使用核酸探针来鉴定或检测微生物的方法，是将探针与所检测的 细菌进行杂交。在细菌鉴定或检测临床标本中的细菌时，常用菌 落原位杂交法，大致步骤是：将细菌点种于硝酸纤维素膜上进行 培养；加溶菌剂使细胞释放出DNA分子；加变性剂使DNA离解 成单链并固定于膜上；加入带标记的核酸探针进行杂交；洗膜后 进行显色或显影鉴定。 用核酸探针来鉴定或检测微生物，具有准确、快速等优点，特别 是当用常规方法难于鉴定和检测时，往往更显示其优越性。
测定DNA碱基组成的方法：
由于热变性温度法操作简单、重复性好而最为常用。
细菌分类与鉴定
属（Genus） (Genus)
2020/12/13
种（Species） (Species)
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常用的细菌分类学术语：
1）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物 等。
2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；对不 同来源的同一种细菌称为该菌的不同菌株。同一种细菌可有许多菌株，其主要性状应该完全相同，次要 性状可稍有差异，通常用地名或动物名的缩写加编号作菌株名。
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1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)
分类学上，用G+C占全部碱基的分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的 DNA碱基因组成特征。
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每个生物种都有特定的GC%范围，因此 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化 范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。
是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系
统发育的分类系统。
从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则
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生物系统学(systematics)
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一、分类单元及其等级
界 （Kingdom） (Regnum)
门 （Phylum） (Phylum) 纲（Class） (Classis) 目（Order） (Ordo) 科（Family） (Familia)
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细菌鉴定的分子生物学方法
细菌鉴定的分子生物学方法赵鎏莉;王晓萍【摘要】细菌鉴定分子生物学方法:基因序列同源性分析、基于PCR的指纹图谱、核酸杂交.对方法的原理、操作步骤、优缺点及适用领域几方面进行综述.【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2012(028)004【总页数】4页(P53-56)【关键词】分子生物学;PCR;DNA【作者】赵鎏莉;王晓萍【作者单位】哈尔滨师范大学;哈尔滨师范大学【正文语种】中文0 引言自然界中，分布最广、数量最多的有机体是细菌.它的代谢类型繁多，具有超强的适应力，能以有机物为碳源、氮源，将其充分降解为无机物.利用细菌的生产，快速、安全、成本低.目前，细菌已广泛应用于生态环境的修复、工农业的生产、食品制造等领域.这几年，发达国家正在努力完善细菌发电技术.不久之前，英美科学家首次精确地展示了细菌中运送电荷的细胞内蛋白质分子结构［1］.但是致病菌也无时无刻不在危害着环境中其他生物包括人类的健康.传统的鉴定方法很难鉴定出种属之间有相似生理生化特性的细菌，而且鉴定时间长并且需要使用大量的药品.随着分子生物学的不断发展，研究人员建立了多种完善的分子生物学鉴定方法.它们可以准确、快速的对微生物进行鉴定，而且大大降低了鉴定成本.因而对细菌的鉴定方法的总结显得十分重要.目前国内尚未集中介绍常用的分子生物学鉴定方法和最新的分子生物学鉴定方法的研究.笔者将对常用的细菌鉴定方法:基因序列同源性分析鉴定法、基于PCR的指纹图谱鉴定法、核酸杂交鉴定法和一些应用于细菌鉴定的最新的分子生物学方法进行总结，希望能为国内的细菌鉴定工作者提供参考.1 基因序列同源性分析鉴定法基因序列的同源性分析是一种PCR技术与测序技术相结合的方法.测序的结果通过与BLAST中已知的序列的比对，分析出同源性，达到鉴定的目的.聚合酶链式反应PCR(Polymerase Chain Reaction)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，最早是Khorana于1971年提出的设想.美国科学家Kary Mullis等在1985年实现了这一梦想，发明了对生物学发展具有强大推动力的 PCR技术［2］.它的原理类似于自然界中DNA复制过程，它的特异性来源于与靶序列两端互补的引物.测序技术从70年代末发展至今，已经有化学修饰法、Sanger双脱氧链末端终止法、高通量测序技术、MPSS和454焦磷酸测序等多种方法.但目前应用最多的还是双脱氧链末端终止法和化学降解法.1.1 16s rDNA基因序列同源性分析它是目前应用最为广泛，也是最早应用到细菌鉴定的分子生物学方法.细菌的16s rDNA在细菌的进化中具有高度的保守性，被认为是细菌分子的“活化石”.但也存在着九到十个变异区，使得不同种属的细菌间有着一定的差异.这也就成了细菌分类的标志.目前，几乎所有已知细菌的16s rDNA序列都已经被测定，并被载入基因库.16s rDNA基因序列同源性分析的过程分为:(1)16s rDNA的提取;(2)选择通用引物或设计特异性引物，进行 PCR;(3)测序;(4)与BLAST中已有序列进行比对.但是由于需要对16s rDNA的全序列进行测序，所以测序周期长，测序费用高.1.2 16～23 s rDNA基因序列同源性分析由于16 s rDNA的高度保守，所以很难分辨出相近种或同一种内的不同菌株.16～23 s rDNA间隔区(ITS)是位于16 s rDNA与23s rDNA之间的区间序列.它的进化速度是16 s rDNA的10倍，该区间经常有序列的缺失和插入，造成不同种和同种不同菌株的16～23 s rDNA间隔区(ITS)在数目、长度和序列组成上的差异性［3］.所以这些年来，也受到广泛的关注.ITS区的分析方法与16 s rDNA一样，引物则根据16 s rDNA的下游和23 s rDNA的上游的保守区设计.Anu Tilsala等人首先利用这种方法，来对菌株进行鉴定，目前在临床和流行病学上应用非常广泛［4］.2 基于PCR的指纹谱图鉴定法2.1 PCR-RFLP/T-RFLP限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)分析是最早以DNA指纹图谱为基础的微生物鉴定方法.它是用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行切割，然后通过电泳分离，利用指纹图谱来检测基因组中限制性内切酶酶切位点的变化，从而比较出不同基因组之间的核苷酸差异，以显示不同菌种基因组DNA的限制性片段长度多态性.它用于细菌种间及种内株间的分型鉴定［5］.由于RFLP产生的DNA指纹图谱的复杂性，在分析菌群时费时费力，且需要克隆基因探针，而且对DNA的量和纯度有很高的要求，所以此技术经常与PCR技术结合，即PCR-RFLP技术.此技术可简化图谱的带型，易于分析.该技术的步骤为:(1)提取DNA;(2)根据rDNA的保守区设计引物;(3)有选择性的PCR;(4)用适当的限制性内切酶对PCR产物进行酶切;(5)用琼脂糖凝胶电泳进行分离，产生限制性片段;(5)进行指纹图谱分析，根据片段的大小、标记片段种类和数量的不同，对细菌经行鉴定.张旋等人检测了204份体液标本，结果与培养法相比，其灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为 95.7%、88.6%、88.0% 和99.4%［6］.说明 PCR-RFLP 在菌种鉴定中具有高特异性、高敏感性、快速性、准确性等特点.近些年来，PCR-RFLP已经广泛的应用到了细菌的鉴定中［7-9］.末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)是用荧光染料对PCR引物的5＇端进行标记，再用适当的限制性内切酶消化PCR产物，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳分离，再用荧光检测仪对标记片段的大小、种类和数量进行检测，最后用Gene Scan软件进行分析.该方法降低了图谱的复杂性，使得结果易于分析，重复性好.Thies FL等人利用此法鉴定出1个属的23个种的细菌［10］.T-RFLP不仅可对已知菌进行鉴定，还能发现未知菌.2.2 随机扩增DNA多态性随机扩增DNA多态性(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)又称随机引物 PCR.RAPD是建立于PCR基础之上的分子标记技术，基本原理是利用一个随机引物(8～10个碱基)通过PCR非定点地扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分离扩增片段来进行DNA多态性研究［11］.这样就发现了菌种之间DNA的变异片段数量和大小的不同.RAPD技术不仅可以在种间、亚种间甚至还能在同一亚种的不同菌株间进行鉴别.而且还能应用于未知菌株快速鉴定和流行病学调查.Kullen等人采用RAPD对分离于人体内的各种双歧杆菌进行鉴别［12］.国内方面，邓海平等人对甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌进行了RAPD 分型［13］.该技术的步骤为:(1)细菌基因组DNA提取;(2)PCR引物选择或设计;(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物;(4)指纹谱图分析.由于RAPD使用的是随机引物，而且引物具有通用性，这可以极大地减少费用和节省时间，所以可以应用于大规模生产和商品化.另外RAPD技术容易操作，检测周期短，且反应程序可以实现自动化.因而，在大规模生产中，RAPD的优越性是无可比拟的.2.3 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)，也称限制片段选择扩增技术(Selective restriction fragment amplification，SRFA).AFLP利用两种以上的酶，一种是常用切割酶，一种是罕见切割酶，切割后的DNA形成不同的限制酶切片段.然后在得到的酶切片段上加人工接头，以其作为模板进行扩增.对引物修饰后，实现了选择性扩增，使一个样本出现特定的DNA 带谱，而另一个样本可能无此带谱.扩增产物经变形聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，就显示出了扩增片段长度多态性.它兼具了RAPD和RFLP的优点，有比较高的稳定性，而且AFLP标记比RFLP、RAPD标记更为可靠，可有效地揭示微生物多态性.使得研究人员不仅可以利用它鉴别微生物不同属的物种，甚至还可以鉴别出同一种属，不同菌株间的差异.Hopkins KL等人采用荧光素标记，即荧光素标记的扩增片段长度多态性，已经鉴定出尿路菌、大肠埃希菌、空肠弯曲菌和不动杆菌［14］.在国内，AFLP已经广泛的应用到酿酒菌的鉴定和生产过程的监控中［15-16］. 该技术的步骤为:(1)DNA的提取及纯化;(2)DNA的修饰及模板的制备;(3)AFLP反应;(4)PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析;(5)放射自显影及分析.2.4 PCR-SSCPPCR-SSCP，即 SSCP(Single Stranded Conformation Polymophism，单链构象多态性)与PCR结合分析.DNA单链构象具有多态性，碱基序列的不同，影响了其空间构象.因此在电泳上的迁移率也不同.SSCP可将长度相同但碱基排列不同的片段区分开.该方法灵敏度极高，能检测到一个碱基的差异.由于PCR-SSCP技术的灵敏快速、操作简便等优点，国内外很多研究人员将其应用于细菌、真菌等多种微生物的鉴定研究中，并得到了很好的效果［17］.该技术的步骤为:(1)DNA的提取及纯化;(2)PCR扩增;(3)先将特异的PCR扩增产物变性，再迅速复性，成为具有一定空间结构的单链DNA分子;(4)用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对单链DNA分子进行分离(5)放射自显影及分析.3 核酸杂交鉴定法利用碱基互不配对原理，人工的对两条不同来源的单链核酸进行复性，构建出新的杂交双链.用这种方法可以进行DNA-DNA，DNA-rRNA，rRNA-rRNA分子间的杂交.核酸杂交是测定核酸分子同源性程度和不同物种亲缘关系的有效手段.3.1 DNA-DNA/DNA-rRNA 杂交DNA-DNA分子杂交的方法很多，常用的是直接法.就是把待测菌株的双链DNA先解链成单链DNA，把它固定在硝酸纤维素滤膜或者琼脂等固相支持物上，然后把它放入含有经同位素标记的、酶切并解链过的参照菌株的单链DNA液中.在适宜的条件下，在膜上复性，构建成杂交双链DNA.通过检测杂合DNA的放射性强度，计算出被测组与参照组的相对放射强度值，即同源性或相似性强度.DNA-DNA杂交可以在种和属的层次上鉴定细菌.但如果两株菌的关系比较远，它们的DNA不能杂交，这就要研究它们RNA的碱基序列相似性.Deleg等用十几年时间，用DNA-rRNA杂交方法研究了数千株不同科属的400多种菌［18］.Denis Roy等人用这种方法对73株乳酸菌进行了鉴定，并确定了它们的亲缘关系［19］.3.2 荧光原位杂交技术荧光原位杂交(FISH)技术是根据已知微生物在不同分类层次上种群特异的DNA序列，以荧光标记的特异寡聚核苷酸片段为探针，与环境基因组中的DNA杂交，对环境中特定微生物种群进行鉴定、数量分析及特异微生物的跟踪等.4 其他技术多位点序列分析技术(MLSA).在现代技术中，研究人员常扩增一些编码特定蛋白的基因来进行菌属中种的鉴定.MLSA技术主要应用的是rpoA基因和 pheS基因［20］，它们分别负责编码RNA聚合酶α-亚基和苯丙氨酰-tRNA合成酶的.通过PCR，对PCR产物进行序列分析，采用软件分析或者进行GC含量分析来确定细菌种属［21］.除了rpoA基因和pheS基因两种常用的基因以外，pmoA和mxaF等编码结构和功能蛋白质的基因可以应用到该方法中来对细菌进行鉴定.5 小结与展望细菌在自然环境、人类生活和科学技术研究中占有举足轻重的地位，然而我们对它认识还相对较少.随着分子生物学的不断进步，会有越来越多的细菌分子生物学鉴定方法建立起来.分子生物学手段和传统方法的结合将为细菌鉴定提供更加准确、快速、有效的保障，这将极大地为细菌的研究提供基础.参考文献［1］ Thomas A Clarke，Marcus J Edwards，Andrew J Gates，etal.Structure of a bacterial cell surface decaheme electron con-duit.Proc Nati Acad Sci USA，2011，108(23):9384-9289.［2］郭玉莲.PCR技术的原理及其应用.才智，2008，(18):168，230.［3］佘小漫，何自福，李华平，等.12种寄主来源的茄科雷尔氏菌16s-23s rDNA间隔区序列比较.植物保护，2010，36(1):43-47.［4］ Tilsala-Timisjärvi A，Alatossava T.Development of oligonucleotide primers fromä 16-23 s rRNA intergenic sequences for identifying differentdairy and probiotic lactic acid bacteria by PCR.International Journal of FOOD 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实验室进行细菌鉴定的方法
实验室进行细菌鉴定的方法
细菌鉴定是在实验室中确定菌种的一种方法，是利用菌的形态学特征、生理生化特性及其分子生物学特征，有效对不同的细菌种类进行识别、鉴
定和定义相关的分类群的过程。
细菌鉴定的方法包括：。
1、形态学特征鉴定：根据活菌和死菌在显微镜下的形态特征和临界
特征进行鉴定，可以区分出大类及微生物类群；。
2、生理生化特征鉴定：通过检测细菌对不同碳源和氮源的利用能力、碳代谢输出特征、抗性标记物、酶、毒素等生理生化特征来鉴定；。
3、分子生物学技术鉴定：基于细菌的遗传特征及其分子生物学特性，利用PCR技术以及Kmer technological等新技术对细菌进行多种快速、
高效、精准地鉴定。
细菌鉴定是为了保证实验室检测数据的准确、准确性进行的重要操作，更多的细菌鉴定方法，可以为今后的实验室上的鉴定提供重要的参考依据，确保实验室检测准确性和可靠性。
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常见的几种方法： （1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等
DNA-DNA杂交
核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定 在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌 株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对 放射性强度来确定菌株问的同源性程度。
其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老， 既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化 与进化距离相适应。
16SrRNA基因结构图
其序列包含10 个可变区（variable region）和11 个恒定区（constant region），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区， 由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以 上分类单位的比较分析。因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的
计算公式：
DNA-DNA杂交
结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于 20％为不同菌属，20％ ～60％ 为属内紧密相 关的种，60％ ～70％为同种内不同亚种，大 于70％为同一亚种。
16SrDNA在细菌分类鉴定的应用
16s rRNA和16s rDNA的区别：16S中的"S"是一个沉降系数，亦即 反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明 分子越大。 rDNA 和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写。 rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序 列，也就是编码16S rRNA的基因。 rRNA指的是rDNA的转录产物，它 是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成，
Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序 列的研究中，得到了与基于16 S rDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结 果不同。经过与DNA—DNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类 关系更符合DNA—DNA杂交结果。
16s rRNA 的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前, 已对 2000 种( 约相当于50%) 以上的真细菌的16s rRNA 进行了测序, 不同菌属 的16s rRNA 序列同源性为70% ～ 95% ,
16s rRNA 序列和DNA-DNA 同源性相关关系的研究表明: 序列的相性不 在99. 8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA 的同源性。16s rRNA 总共约有 1500bp, 0. 2%的不同相当于3 个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且 个人读取数据也可能出现错读, 因此由16s rRNA 序列鉴定种是很难的。
用于细菌鉴定和分类的分子生 物学方法
报 告 人：王浩丞 2019年4月26日
主要内容
• DNA-DNA杂交 • 16SrDNA在细菌分类鉴定的应用 • 几种“看家基因”（Housekeeping
genes）在细菌分类鉴定的应用
DNA-DNA杂交
现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和
1.信息的存储和加工 DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和 修饰 RNA的代谢 ： （1）基本的转运功能（2） 翻译 （3） RNA的降解 2 蛋白质的加工、折叠、分泌 3 细胞的结构和细胞壁的加工 4 活跃且处于中间的代谢
gyrB基因
• gyrB基因是普遍存在于细菌内编码DNA促旋酶中B亚单位蛋白的基因 ，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码 基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA— rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。编码的是唯一 一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白
第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对 于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。
第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个 环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。
细菌核心基因（看家基因）
虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是 无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌 去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平 衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能 。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此 ，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的 功能。
鉴定的“黄金法则”。
基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源 的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度）， 使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相 似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高， 说明它们之间的亲缘扑异构酶，在DNA复制及DNA超螺旋结 构的维持过程中起着重要的作用。
（1）gyrB基因序列全长约为1．2—1．4 kb，平均碱基替换率为每 100万年变化0．7％~0．8％ ，比16SrDNA的每5000万年变化1％的速 度快。
（2）由于其作为蛋白编码基因，其所固有的遗传密码子的兼并性使得 DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的 第3位碱基 ，这就使得gyrB基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面， 比非蛋白编码基因16 S rDNA具有更高的分辨率。