蛋白质相互作用的主要研究方法

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研究蛋白质相互作用的九种方法,写标书用得上

研究蛋白质相互作用的九种方法,写标书用得上

研究蛋白质相互作用的九种方法,写标书用得上寒风凛冽,又到了一年一度写标书的季节,你开始准备了么?在分子机制的研究中,蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了,研究蛋白互作的方法有很多,今天我们来介绍九种。

1、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)CoIP其实就是两个蛋白相互的IP(免疫沉淀反应)实验,在已知蛋白B和C之间有相互作用的前提下,这种前提一般需要有一个酵母双杂实验或者Pulldown实验来作为支持。

IP就是用来验证蛋白C和蛋白B之间相互作用的。

如果在Agarose珠上的Protean A/G所结合的抗体,可以结合并拉下蛋白B,那用Western Blot即可检测出蛋白C的表达,反之亦然,通过这种相互间免疫共沉淀的实验,就可以明确地验证出,B与C之间的相互作用了。

比如这份标书:PYK2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究:结合并磷酸化E-cadherin?(百度检索题目可查到全文)2、Pull-down实验这个实验跟免疫共沉淀实验很像,不同的是免疫共沉淀是在细胞里进行的,在众多的蛋白里,拉住A蛋白的同时,把B蛋白也给拉出来了,这还不能证明是直接的结合,很有可能是A 拉住了C,而C拉住了B,这样拉住A蛋白的同时也能把B蛋白也给拉出来。

要证明直接的结合就是Pull-down实验。

提纯所要研究的两个蛋白(一般是在BL21等菌种表达提纯),这两个蛋白带上不同的标签(提纯蛋白一般带GST或者HIIS标签),然后将他们放在同一个体系里,使用GST-beads或者NI-beads,把其中一个蛋白拉下来,用WB检测另一个蛋白的存在。

比如这份标书:恶性肿瘤的发生、发展的细胞表观遗传学机制。

(同样可以百度检索到全文)3、免疫荧光(Immunofluorescence,IF)——共定位将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。

由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。

蛋白互作

蛋白互作

蛋白互作的研究一直以来都受到重视,是研究细胞信号传导等非常重要的方面。

我就我现在做过的方法给大家介绍一下,抛砖引玉了,大家多补充纠正一下吧常用的体外互作研究方法:1、酵母双杂交(yeast two-hybrid,Y2h)酵母双杂交作为最经典的蛋白互作方法一直沿用至今,并且仍然保持着自己的优势。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。

酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。

优点在于:优点: ⑴作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

⑵检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

但是酵母双杂交有自己的缺点:⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。

另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。

⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。

由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生"假阳性"结果。

“假阳性”对策:即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用,还应对以下方面进行分析:(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。

蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质与蛋白质相互作用的研究方法蛋白质是生物体内最重要的大分子有机化合物之一,其功能多样且复杂。

蛋白质与蛋白质之间的相互作用在维持细胞结构和功能、调控信号传导、催化代谢反应等方面起着重要作用。

研究蛋白质与蛋白质相互作用的方法有很多种,本文将重点介绍几种常用的方法。

一、免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)免疫共沉淀法是研究蛋白质与蛋白质相互作用的常用方法之一。

该方法利用特异性抗体与目标蛋白结合,将目标蛋白及其相互作用的蛋白质一起从混合溶液中沉淀下来,然后通过Western blot等技术检测共沉淀的蛋白质。

这种方法可以鉴定蛋白质的相互作用伙伴,帮助我们了解蛋白质的功能和调控机制。

二、酵母双杂交技术(Yeast Two-Hybrid,Y2H)酵母双杂交技术是一种广泛应用于蛋白质相互作用研究的方法。

该技术利用酵母细胞内的转录激活子域和DNA结合域分别与目标蛋白和其相互作用蛋白质融合,形成蛋白质复合物,从而激活报告基因的表达。

通过观察报告基因的表达情况,可以判断目标蛋白与其相互作用蛋白质之间的相互作用关系。

三、双光子共聚焦显微镜(Two-Photon Confocal Microscopy,TPCM)双光子共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术,可以实时观察蛋白质在活细胞中的相互作用。

该技术利用激光激发样品中的荧光物质,通过检测荧光信号的强度和位置来观察蛋白质的相互作用。

通过双光子共聚焦显微镜,可以直接观察蛋白质在细胞内的空间分布和动态变化,有助于研究蛋白质的功能和相互作用机制。

四、质谱联用技术(Mass Spectrometry,MS)质谱联用技术是一种高灵敏度的蛋白质相互作用研究方法。

该技术将蛋白质样品进行分离和纯化后,通过质谱仪对样品中的蛋白质进行分析。

通过质谱联用技术,可以鉴定蛋白质的相互作用伙伴,确定蛋白质的修饰模式,揭示蛋白质的功能和调控机制。

以上介绍的几种方法只是蛋白质相互作用研究中的一部分,随着科学技术的不断进步,新的研究方法不断涌现。

蛋白质相互作用多种方法共73张

蛋白质相互作用多种方法共73张

蛋白质相互作用多种方法共73张蛋白质是生物体内最重要的功能性分子之一,它们在细胞的结构和功能调控中起着至关重要的作用。

蛋白质相互作用是维持细胞内平衡和调控生命过程的关键。

而为了研究蛋白质相互作用,科学家们发展了许多方法和技术。

下面将介绍几种常用的蛋白质相互作用研究方法。

一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种高通量的蛋白质相互作用筛选技术,它基于酵母菌的两个部分蛋白质结合时能够引发基因转录的特性。

该方法需要构建两个表达融合蛋白质的酵母菌株,其中一个融合蛋白质与待测蛋白质进行相互作用后,会激活转录因子从而促进报告基因的表达。

通过筛选和鉴定这些报告基因的表达水平,可以确定两个蛋白质之间的相互作用关系。

二、质谱法质谱法是一种通过分析蛋白质质量和结构的方法,也可以用于研究蛋白质的相互作用。

质谱法包括两种主要的方法:质谱法和质谱质谱法。

质谱法通过测量蛋白质的尺寸、质量和电荷等物理化学特性来揭示蛋白质之间的相互作用。

而质谱质谱法则通过分析蛋白质片段的质谱图谱,鉴定蛋白质之间的相互作用位点和结构。

三、表面等离子体共振表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)是一种实时检测蛋白质相互作用的光学技术。

该方法通过测量光的折射率来监测蛋白质的结合和解离。

SPR技术通常使用金属表面修饰的芯片,其中一个蛋白质被固定在芯片表面,另一个待测蛋白质则溶解在流动的缓冲液中。

当两个蛋白质结合时,会导致光的折射率发生变化,从而可以实时监测到蛋白质的相互作用过程。

四、荧光共振能量转移荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)是一种基于蛋白质间染料荧光信号的技术。

该方法需要在待测蛋白质上标记一对荧光染料,其中一个染料作为接受者,另一个染料作为给体。

当这两个染料的发射和吸收频率相互匹配时,能量可以通过非辐射损失的方式从给体跃迁到接受者,从而引发接受者的荧光信号。

检测蛋白互作的方法

检测蛋白互作的方法

检测蛋白互作的方法有多种,其中包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀、GST-pull down实验等。

这些方法都可以用来研究蛋白之间的相互作用,并有助于进一步了解蛋白质的功能和机制。

1. 酵母双杂交技术:这是一种在酵母细胞中检测蛋白互作的方法,主要通过将两个蛋白的基因分别与报告基因的转录激活域融合,在两个蛋白相互作用时,报告基因就会被激活,从而得到蛋白互作的结果。

2. 免疫共沉淀:这是一种通过抗体和抗原之间的专一性作用来研究蛋白互作的方法。

将其中一个蛋白进行免疫沉淀后,与其互作的蛋白也会被沉淀下来,然后通过Western blot等技术检测到被沉淀的蛋白,从而确定两者之间的相互作用。

3. GST-pull down实验:这是一种体外检测蛋白互作的方法,通过将目标蛋白与谷胱甘肽亲和树脂结合,再与待检测的蛋白混合,如果两者之间有相互作用,目标蛋白就会与待检测蛋白结合并被吸附在树脂上,最后通过Western blot等技术检测到结合的蛋白,从而证明两者之间的相互作用。

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋白质之间相互作用

检测两种蛋⽩质之间相互作⽤检测两种蛋⽩质之间相互作⽤的实验⽅法⽐较1. ⽣化⽅法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专⼀性作⽤为基础的⽤于研究蛋⽩质相互作⽤的经典⽅法。

改法的优点是蛋⽩处于天然状态,蛋⽩的相互作⽤可以在天然状态下进⾏,可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作⽤的蛋⽩复合体。

缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋⽩复合物时候为直接相互作⽤的两种蛋⽩。

另外灵敏度不如亲和⾊谱⾼。

●Far-Western⼜叫做亲和印记。

将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋⽩能与标记了同位素的诱饵蛋⽩发⽣作⽤,最后显影。

缺点是转膜前需要将蛋⽩复性。

2. 等离⼦表⾯共振技术(Surface plasmon resonance)该技术是将诱饵蛋⽩结合于葡聚糖表⾯,葡聚糖层固定于⼏⼗纳⽶厚的技术膜表⾯。

当有蛋⽩质混合物经过时,如果有蛋⽩质同“诱饵”蛋⽩发⽣相互作⽤,那么两者的结合将使⾦属膜表⾯的折射率上升,从⽽导致共振⾓度的改变。

⽽共振⾓度的改变与该处的蛋⽩质浓度成线性关系,由此可以检测蛋⽩质之间的相互作⽤。

该技术不需要标记物和染料,安全灵敏快速,还可定量分析。

缺点:需要专门的等离⼦表⾯共振检测仪器。

3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因⼦的结构特殊性,这些转录因⼦通常需要两个或以上相互独⽴的结构域组成。

分别使结合域和激活域同诱饵蛋⽩和猎物蛋⽩形成融合蛋⽩,在真核细胞中表达,如果两种蛋⽩可以发⽣相互作⽤,则可使结合域和激活域在空间上充分接近,从⽽激活报告基因。

缺点:⾃⾝有转录功能的蛋⽩会造成假阳性。

融合蛋⽩会影响蛋⽩的真实结构和功能。

不利于核外蛋⽩研究,会导致假隐性。

5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法⾊基团在⾜够近(<100埃)时,它们之间可发⽣能量转移的现象。

荧光共振能量转移技术可以研究分⼦内部对某些刺激发⽣的构象变化,也能研究分⼦间的相互作⽤。

它可以在活体中检测,⾮常灵敏,分辩率⾼,能够检测⼤分⼦的构象变化,能够定性定量的检测相互作⽤的强度。

研究蛋白质的相互作用的方法

研究蛋白质的相互作用的方法

研究蛋白质的相互作用的方法一、酵母双杂交系统酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。

其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。

将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。

在实际工作中,人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。

Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。

可以研究膜蛋白的功能,丰富了酵母双杂交系统的功能。

此外,酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。

二、噬茵体展示技术在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列,当噬菌体生长时,表面就表达出相应的单抗,再将噬菌体过柱,柱上若含目的蛋白,就会与相应抗体特异性结合,这被称为噬菌体展示技术。

此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用,不仅有高通量及简便的特点,还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。

目前,用优化的噬菌体展示技术,已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库,并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。

三、等离子共振技术表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。

它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”,当待测蛋白与诱饵蛋白结合后,薄膜的共振性质会发生改变,通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。

SPR技术的优点是不需标记物或染料,反应过程可实时监控。

测定快速且安全,还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。

四、荧光能量转移技术荧光共振能量转移(FRET )广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合,可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。

蛋白互作常用的研究方法

蛋白互作常用的研究方法

蛋白互作常用的研究方法
蛋白质互作常用的研究方法包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。

1. 酵母双杂交技术:主要用来进行互作蛋白的筛选,缺点就是假阳性较高,所以需要进行结果验证,一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进
行验证。

2. 免疫共沉淀:是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内相互作用的有效方法。

当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。

当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A 的抗体免疫沉淀A蛋白,那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉
淀下来。

再通过蛋白变性分离,对B蛋白进行Western blot检测,进而证明两者间的相互作用。

3. GST pull-down实验:是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试
验技术。

其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体,然后进行体外表
达及纯化。

但是也存在一定局限性。

这些方法各有优缺点,应根据研究目的和具体情况选择合适的方法。

检测蛋白质相互作用的方法

检测蛋白质相互作用的方法

检测蛋白质相互作用的方法蛋白质相互作用对于理解细胞内的生物过程以及研究疾病机制具有重要意义。

随着基因组学和蛋白质组学技术的发展,越来越多的蛋白质相互作用被鉴定出来,为进一步研究提供了基础。

本文将介绍几种常用的蛋白质相互作用检测方法,包括传统的生化方法以及近年来发展的高通量技术。

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):免疫沉淀是一种常用的生化方法,用于检测蛋白质与其他蛋白质的相互作用。

该方法利用特异性抗体与目标蛋白质结合,将其与结合蛋白质一起从混合溶液中沉淀下来。

通过检测共沉淀的蛋白质可以确定其相互作用伙伴。

这种方法可以应用于细胞培养液、组织样品以及原核和真核生物体内。

2. 酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid, Y2H):酵母双杂交是一种用于检测蛋白质与其他蛋白质的直接相互作用的方法。

该方法利用酵母细胞内的转录激活子和靶蛋白质的交互作用来驱动报告基因的表达。

通过将靶蛋白质与转录激活子的两个域分别与两个不同的蛋白质结合区域相连,可以检测他们之间的相互作用。

该方法可用于鉴定蛋白质复合物的成员以及研究蛋白质与DNA、RNA、药物等的相互作用。

3. 蛋白质微阵列(Protein Microarray):蛋白质微阵列是一种高通量技术,用于同时检测大量蛋白质的相互作用。

该方法将数千种蛋白质固定在玻璃片或芯片上,并与待测蛋白质进行相互作用。

通过检测待测蛋白质与已知蛋白质之间的相互作用,可以快速鉴定蛋白质复合物的成员,以及确定蛋白质的结合亲和力和特异性。

4. 质谱法(Mass Spectrometry, MS):质谱法是一种基于蛋白质质量-电荷比的测量,用于鉴定蛋白质相互作用。

质谱法可分为两种类型:基于质量鉴定的质谱法(如蛋白质酶切质谱法)和基于质量比的质谱法(如蛋白质亲和质谱法)。

利用质谱法,可以鉴定蛋白质复合物的成员,并获得有关相互作用和结合位点的信息。

质谱法在高通量筛选和蛋白质组学研究中被广泛应用。

验证蛋白互作的方法

验证蛋白互作的方法

验证蛋白互作的方法生物学研究中,蛋白质互作是一个重要的研究领域,因为它关系到生命体的许多生物学过程如细胞周期、细胞信号转导、细胞凋亡等。

蛋白质互作研究的目的是了解蛋白质之间的相互作用,以及这些作用对于生物体内功能的影响。

为了获得这些信息,科学家们需要开发一些工具和技术来研究蛋白质之间的相互作用。

本文讲述了几种常用的蛋白互作验证方法。

一、酵母双杂交(Y2H)法酵母双杂交法是最常用的蛋白质互作验证方法之一。

由于其名称中含有“双杂交”,因此可以理解为将两个蛋白质“杂交”在一起,然后观察它们是否相互作用。

首先,将两个蛋白质分别构建成两个不同的来源的表达向量。

然后,在酵母细胞中,将这两个表达向量分别与GAL4激活子和GAL4结合蛋白相连,形成一个杂交蛋白。

如果这两个蛋白质发生相互作用,它们将结合并形成GAL4转录激活子,从而激活报告基因进行表达。

最终,研究人员可以通过观察转录活性的变化来判断这些蛋白质之间是否存在相互作用。

虽然酵母双杂交法是一种比较简单的技术,但有一些潜在问题需要研究人员注意。

首先,该方法只能检测蛋白质之间的直接相互作用,无法检测多个蛋白质之间的复杂相互作用。

其次,酵母细胞内的反应条件与活性可能与真实环境中相差很大,这可能导致结果的误判。

二、共免疫沉淀法(Co-IP)共免疫沉淀法是一种可以定量检测蛋白质相互作用的技术。

它的原理是将两个蛋白质在细胞内共同表达,并通过特异的抗体沉淀来寻找这两个蛋白质之间的相互作用。

具体来说,将目标蛋白质和其交替作用的伴侣蛋白质在细胞内共同表达。

然后,通过特异的抗体与其中一个蛋白质发生特异性结合,可以选择性地沉淀出另一个蛋白质。

最后,通过Western blot等技术检测被沉淀下来的伙伴蛋白的数量。

如果目标蛋白质和其伴侣蛋白相互作用,那么其它蛋白质沉淀下来时就会被一同检测到。

这种方法可以用来研究多个蛋白质相互作用的情况,还能够定量地衡量它们之间的相互作用强度。

不过该方法对于选择适当的抗体是非常准确的,因此需要仔细设计和验证实验条件来确保免疫沉淀过程的特异性和有效性。

蛋白质相互作用研究方法

蛋白质相互作用研究方法

蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用是指两个或多个蛋白质之间的相互作用和相互调节。

研究蛋白质相互作用的方法有很多种,下面将介绍其中一些常用的方法。

1. 酵母双杂交检测(Y2H):该方法是通过基因转录和细胞生理过程来检测蛋白质相互作用。

该方法的基本原理是将感兴趣的两个蛋白质分别连接到酵母细胞中的转录因子的DNA结合结构域和激活结构域,当这两个蛋白质发生相互作用时,转录因子被激活,从而触发报告基因的表达。

通过检测报告基因的表达水平来确定蛋白质之间的相互作用程度。

2. 免疫共沉淀:该方法是利用两个蛋白质之间的特异性相互作用来检测和分离它们。

首先,在一个蛋白质中引入一个标签,比如His标签。

然后,将该蛋白质在体外与另外一个感兴趣的蛋白质一起孵育,使它们发生相互作用。

最后,利用特定的抗体识别标签,并用亲和树脂或磁珠来沉淀包含这些标签的复合物。

通过酶解、电泳等方法对复合物进行分析,可以确定两个蛋白质之间的相互作用。

3. 光学方法:如可以利用荧光共振能量转移(FRET)技术来研究蛋白质相互作用。

该技术基于两个发射荧光染料的距离变化会改变吸光度的原理,当两个蛋白质相互作用时,可以通过激发一个染料并检测另一个染料发射的荧光信号来确定它们之间的相互作用程度。

4. 质谱法:质谱法是一种广泛应用的蛋白质相互作用研究方法。

其中,串联质谱法(MS/MS)可以用来鉴定蛋白质复合物中的组分。

根据质谱分析的结果,可以确定两个蛋白质之间的相互作用和结合部位等信息。

此外,还有其他一些方法如共结晶、核磁共振、冷冻电镜等,可以对蛋白质相互作用进行研究。

这些方法的选择取决于研究者所关注的蛋白质特性、相互作用类型以及研究目的等因素。

需要注意的是,以上方法在研究蛋白质相互作用时有其局限性。

比如,一些方法需要在体外进行,无法反映细胞内环境;一些方法可能对于某些蛋白质的研究不适用;一些方法可能存在假阳性和假阴性等问题。

因此,在选择研究方法时,需要综合考虑各种因素,并采取多重方法相互印证,以获得准确可靠的结果。

蛋白质相互作用的主要研究方法

蛋白质相互作用的主要研究方法

蛋白质相互作用的主要研究方法细胞接受外源或是源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性。

在这个过程中,蛋白质占有很重要的地位,它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。

虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用,但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。

因此,为了更好地理解细胞的生物学活性,必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能,这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。

在现代分子生物学中,蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。

研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。

研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合,实验本身更趋向于验证性,因此,应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法,尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。

蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。

1 免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞生理性相互作用的有效方法。

其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体,与抗原形成特异免疫复合物,经过洗脱,收集免疫复合物,然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体的相互作用,也可以找出未知的蛋白质相互作用,不管是两者的哪个,其原则都是一样的,都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合,之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用SDS-PAGE鉴定。

免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高,设置的对照包括:在对照组中使用对照抗体,以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

蛋白质相互作用 方法

蛋白质相互作用 方法

蛋白质相互作用方法
有多种方法可以研究蛋白质相互作用。

以下是一些常见的方法:
1. 质谱法(Mass spectrometry):通过测量蛋白质的质量和电荷比,可以确定蛋白质之间的相互作用。

这种方法常用于鉴定蛋白质与其配体的相互作用。

2. 亲和层析法(Affinity chromatography):通过利用特定配体固定在固相材料上,可以将感兴趣的蛋白质从复杂样品中分离出来。

这种方法常用于鉴定蛋白质与配体的特异性相互作用。

3. 蛋白质组学法(Proteomics):通过大规模鉴定和分析蛋白质样品中的蛋白质,可以揭示蛋白质之间的相互作用网络。

这种方法常用于研究整个蛋白质组的相互作用。

4. 核磁共振法(Nuclear Magnetic Resonance, NMR):通过测量蛋白质分子在核磁共振场中的行为,可以确定蛋白质之间的相互作用模式。

这种方法常用于研究蛋白质的三维结构和动态变化。

5. 晶体学法(X-ray crystallography):通过测量蛋白质晶体中的X射线衍射图像,可以确定蛋白质的高分辨率结构。

这种方法常用于研究蛋白质的空间构型以及与配体的相互作用。

6. 光谱法(Spectroscopy):通过测量蛋白质在不同波长的光线下吸收、散射或发射的特性,可以确定蛋白质分子的结构和相互作用。

这种方法常用于研究蛋白质的构象变化和相互作用机制。

以上是一些常见的蛋白质相互作用研究方法,不同方法有不同的优缺点和适用范围,研究者常常结合多种方法来全面揭示蛋白质之间的相互作用。

蛋白互作的检测方法

蛋白互作的检测方法

蛋白互作的检测方法全文共四篇示例,供读者参考第一篇示例:蛋白互作是指两个或多个蛋白质相互作用形成复合物的过程。

在细胞内,蛋白质互作是非常常见的,因为蛋白质之间的相互作用对于细胞功能的调控至关重要。

研究蛋白质之间的互作关系对于理解细胞功能和疾病的发病机制具有重要意义。

为了检测和研究蛋白质的互作关系,科学家们发展了多种方法和技术。

一、酵母双杂交酵母双杂交是一种常用的方法,用于检测蛋白质之间的相互作用关系。

该方法利用酵母菌中的转录因子进行蛋白质互作的筛选。

通过将感兴趣的蛋白质与一个已知的转录因子的DNA结合域结合,构建一个"鱼钩"。

然后,将这个"鱼钩"与一个另一个已知的转录因子的激活域结合,构建一个"鱼饵"。

将这两个构建好的蛋白质构建载入酵母细胞中,观察是否有染色反应,从而判断两蛋白质之间是否相互作用。

二、共沉淀法共沉淀法是另一种常用的方法,用于检测蛋白质之间的相互作用关系。

该方法利用蛋白质之间的物理相互作用在溶液中形成复合物,通过添加沉淀剂将复合物沉淀下来,最后通过蛋白质生化分析技术检测复合物的成分。

这种方法可以用于检测蛋白质之间的直接相互作用或间接相互作用。

三、共定位法共定位法是用来检测蛋白质之间的相互作用关系的一种方法。

该方法通过检测蛋白质在细胞中的亚细胞定位来判断蛋白质之间是否有相互作用。

如果两个蛋白质在细胞内定位在同一位置,则可以判断它们之间可能存在相互作用关系。

这种方法可以通过共荧光定位或共标记等技术来实现。

四、蛋白质片段互作检测法要想检测蛋白质之间的互作关系,需要综合运用多种方法和技术。

不同的方法有不同的优缺点,可以根据具体研究目的来选择合适的方法。

通过研究蛋白质之间的互作关系,可以更深入地理解细胞功能和疾病发病机制,为进一步研究和治疗疾病提供重要依据。

【这里是否可以添加一些具体的案例以及最新研究进展,来使文章更加生动和有说服力】。

研究蛋白质相互作用的方法及原理

研究蛋白质相互作用的方法及原理

研究蛋白质相互作用的方法及原理蛋白质相互作用是生命科学研究中的重要问题,因为蛋白质在细胞内发挥着许多生物学功能,如信号转导、代谢调控和基因表达等。

在研究这些生物学过程时,了解蛋白质相互作用的方法和原理非常重要。

本文将介绍几种常见的研究蛋白质相互作用的方法及其原理。

1. 亲和层析法亲和层析法是一种将目标蛋白质从混合物中纯化出来的方法。

该方法利用目标蛋白质与其相互作用的配体(亲和剂)固定在填充层析柱中的树脂上,将混合物加入层析柱中,通过蛋白质与配体的特异性相互作用,使目标蛋白质与填充层析柱中的树脂结合,从而将其分离出来。

亲和层析法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。

2. 免疫沉淀法免疫沉淀法是一种利用抗体特异性结合目标蛋白质的方法。

该方法将抗体固定在磁珠或凝胶颗粒上,将混合物加入其中,抗体与目标蛋白质特异结合,将其从混合物中沉淀出来,从而实现目标蛋白质的纯化。

免疫沉淀法可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸等相互作用。

3. 双杂交技术双杂交技术是一种检测蛋白质相互作用的方法。

该技术基于贝尔-拉布实验,将目标蛋白质的DNA序列与另外一种被称为“活化因子”的蛋白质DNA序列连接起来,形成一个双杂交体。

当该双杂交体与另一种包含另一个蛋白质DNA序列的双杂交体结合时,它们可以通过激活报告基因的表达来检测相互作用。

双杂交技术可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。

4. 表面等离子共振(SPR)技术表面等离子共振技术是一种实时监测蛋白质相互作用的方法。

该技术基于利用表面等离子共振技术将一个蛋白质固定在芯片上,然后通过流动另一个蛋白质溶液,可以精确地测量这两个蛋白质之间的相互作用。

通过测定反应速率和平衡常数等参数,可以定量分析蛋白质相互作用的强度和亲和力。

表面等离子共振技术可用于研究蛋白质-蛋白质、蛋白质-小分子等相互作用。

总之,以上这些方法可以帮助研究人员深入了解蛋白质相互作用的机制和原理,在生命科学中有着广泛的应用。

蛋白质相互作用网络的分析方法

蛋白质相互作用网络的分析方法

蛋白质相互作用网络的分析方法在生物体内,蛋白质是组成细胞的关键分子之一。

蛋白质相互作用网络是指一组蛋白质在细胞内通过物理、化学或生物学方式相互交互形成的复杂网络。

这个网络有助于我们理解蛋白质在生物体内的功能和作用,以及如何干预这些生物过程以治疗人类疾病。

为了研究蛋白质相互作用网络,研究人员需要开发相关的分析方法。

以下是三种常用的蛋白质相互作用网络分析方法:1. 图论方法图论是解决网络问题的一种数学方法,经常被用于分析蛋白质相互作用网络。

在蛋白质相互作用网络中,每个蛋白质可以看作网络的节点,而它们之间的相互作用可以看作网络中的边。

这些节点和边可以被用于构建蛋白质相互作用网络的图。

蛋白质相互作用网络的图可以用于计算网络中每个节点的度数和中心性等度量值。

例如,在一个网络中,节点的度数是该节点与其他节点之间的关系数。

中心性则可以指出网络中哪些节点是最重要的。

这些值可以用来研究网络结构的特点,并帮助我们理解蛋白质如何相互作用。

2. 基于机器学习的方法机器学习技术可以用于分析蛋白质相互作用网络。

在这种方法中,研究人员使用计算机程序来识别蛋白质相互作用网络中的一些共同特征。

这些共同特征可能包括节点度数、网络密度和聚类系数等。

机器学习技术还可以利用已知的蛋白质相互作用数据来预测新的相互作用关系。

例如,研究人员可以使用一些模型来预测这些关系,比如随机森林、神经网络和支持向量机等。

这些模型可以帮助我们发现新的蛋白质相互作用,并促进新药物的发现。

3. 网络动力学方法网络动力学是一种研究网络结构和功能演化的方法。

在蛋白质相互作用网络中,网络的演化也可以用网络动力学的方法来研究。

例如,我们可以在网络中模拟蛋白质相互作用的扰动,以研究网络的相应变化。

此外,还有一种称为模块检测的方法,可以用于发现蛋白质相互作用网络中的一些子网络,这些子网络可以指示一些功能单元。

这些功能单元可以与生物体内的实际生物过程相对应,从而提供关于生物过程的重要信息。

研究蛋白质相互作用的技术

研究蛋白质相互作用的技术

研究蛋白质相互作用的技术蛋白质相互作用是生命体系中非常重要的一环,对于理解细胞的生物学功能、疾病的发生和治疗等具有重要的意义。

随着科技的发展和创新,研究蛋白质相互作用的技术也在不断地更新和完善。

本文将介绍一些目前常用的蛋白质相互作用研究技术,并探讨它们的优缺点以及在科学研究中的应用。

1. 酵母双杂交技术酵母双杂交技术是最早用于蛋白质相互作用研究的技术之一。

通过将目标蛋白质与酵母双杂交体系中的另一个蛋白质进行融合,可以检测它们是否发生相互作用。

该技术的优点在于操作简单,对大规模筛选具有较高的效率。

酵母双杂交技术也存在一些局限性,例如在体内可能并不真实反映蛋白质相互作用的情况,以及可能存在假阳性和假阴性结果。

2. 共免疫共沉淀技术共免疫共沉淀技术利用抗体对蛋白质进行特异性结合,然后通过沉淀来寻找蛋白质之间的相互作用。

这项技术可以在原核细胞和真核细胞中进行,能够检测细胞内、细胞间以及细胞外的蛋白质相互作用。

但是该技术也存在一些局限性,比如需要高质量的特异性抗体、较长时间和较高技术要求等。

3. 质谱联用技术质谱联用技术已成为蛋白质相互作用研究的重要手段之一。

例如蛋白质质谱分析技术(Protein-Protein Interaction Mass Spectrometry,PPI-MS)能够对蛋白质的相互作用进行高通量分析。

通过将免疫沉淀后的蛋白质进行质谱分析,可以鉴定蛋白质相互作用的配体。

质谱联用技术的优势在于高灵敏度、高特异性和高通量性,但需要高质量的蛋白质组学数据。

4. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)是一种基于蛋白质间距离的技术,通过激发体系中的一个荧光蛋白(供体)来激发接受体系中的另一个荧光蛋白,从而检测蛋白质之间的相互作用。

该技术具有实时性、高灵敏度和高分辨率的特点,但也存在由于受到光源、色素、环境等外界因素影响的缺点。

蛋白质与蛋白质相互作用的技术

蛋白质与蛋白质相互作用的技术

蛋白质与蛋白质相互作用的技术
蛋白质与蛋白质相互作用的技术主要包括酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、荧光能量转移技术、噬菌体展示技术等。

这些技术可用于研究蛋白质之间的相互作用,从而深入了解生命活动的机制。

1.酵母双杂交技术:这是一种有效的筛选蛋白质相互作用的方法,尤其适用
于大规模蛋白质之间相互作用的研究。

通过将目标蛋白与报告基因连接,在酵母细胞中检测报告基因的表达,可以确定目标蛋白与其他蛋白的相互作用。

2.免疫共沉淀技术:利用抗体与抗原之间的特异性结合,将目标蛋白与其他
相关蛋白一起沉淀下来,然后通过Western blot等技术对沉淀的蛋白质进行分析。

通过这种方法可以检测到目标蛋白与其他蛋白质的直接相互作用或者间接相互作用。

3.荧光能量转移技术:一种高灵敏度的检测蛋白质相互作用的方法。

该技术
利用荧光物质标记目标蛋白,通过检测荧光物质之间的能量转移,来间接检测蛋白质之间的相互作用。

4.噬菌体展示技术:将外源基因插入噬菌体外壳蛋白基因的技术,使外源基
因编码的蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合,并在噬菌体表面展示出来。

通过该技术可以筛选与目标蛋白相互作用的蛋白质,并对相互作用进行定量分析。

蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质相互作用的研究方法

蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。

以下将详细介绍几种常用的研究方法。

1. 酵母双杂交法(Yeast Two-Hybrid, Y2H)酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。

该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达,从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。

该方法的优点是操作简单、高通量性能强,但也存在一些局限性,如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。

2. 免疫共沉淀法(Immunoprecipitation, IP)免疫共沉淀法是一种常用的生化方法,用于鉴定蛋白质相互作用。

该方法基于抗体的特异性,将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来,通过蛋白质分析技术(如质谱分析)鉴定共沉淀的蛋白质。

该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用,但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。

3. 原位近距离显微镜法(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。

该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记,根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。

FRET可以在活细胞和组织中进行,具有高时空分辨率,但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。

4. 表面等离子体共振传感器法(Surface Plasmon Resonance, SPR)SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。

该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。

SPR具有高灵敏度和实时监测能力,可用于定量研究蛋白质相互作用,但需要具备专业的设备和表面修饰技术。

5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR)和电子显微镜(Electron Microscopy, EM)等。

蛋白相互作用

蛋白相互作用

百泰派克生物科技
蛋白相互作用
蛋白相互作用是指两个或两个以上的蛋白质形成蛋白质复合体或多蛋白网络的现象。

单一的蛋白质难以发挥复杂的生物学功能,通常需要多个蛋白相互结合实现复杂的细胞学功能。

生物体内的蛋白质-蛋白质相互作用主要以3种形式存在:形成多亚
基蛋白质四级结构(血红蛋白4个亚基的装配)、蛋白复合体(病毒外壳)以及瞬
时蛋白质-蛋白质相互作用。

研究蛋白相互作用的方法有很多,可以分为体外和体内两类。

体外的方法主要有蛋白质亲和层析、免疫(共)沉淀、(GST)Pull down、蓝色非变性胶技术(BN-PAGE)亲和印迹、蛋白芯片、核磁共振谱分析等。

体内的分析方法包括酵母双杂交、共聚焦显微技术和流式细胞分析技术等。

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台结合Nano-LC提
供蛋白质互作分析服务技术包裹,可对IP、Co-IP样品及GST融合蛋白Pull-down
等纯化样本中的蛋白/蛋白混合物的质谱鉴定分析,欢迎免费咨询。

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蛋白质相互作用的主要研究方法细胞接受外源或是内源的信号,通过其特有的信号途径,调节其基因的表达,以保持其生物学特性。

在这个过程中,蛋白质占有很重要的地位,它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。

虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用,但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。

因此,为了更好地理解细胞的生物学活性,必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能,这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。

在现代分子生物学中,蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。

研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。

研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合,实验本身更趋向于验证性,因此,应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法,尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。

蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。

1 免疫共沉淀免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体,与抗原形成特异免疫复合物,经过洗脱,收集免疫复合物,然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。

免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用,也可以找出未知的蛋白质相互作用,不管是两者的哪个,其原则都是一样的,都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合,之后通过蛋白质A或蛋白质G 琼脂糖微珠将复合物沉淀下来,然后用SDS-PAGE鉴定。

免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要,因为该方法可能出现假阳性的概率比较高,设置的对照包括:在对照组中使用对照抗体,以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。

在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点:(1)确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白。

单克隆抗)要确保抗体的特异性。

即在不表达抗原2体的使用有助于避免污染的产生。

(.的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

(3)确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的。

这需要进行蛋白质的定位来确定。

免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接相互作用的两种蛋白。

例如E1A与p60的共沉淀就是间接的相互作用。

其实际上是E1A与p107直接相互作用,而p107与p60直接相互作用的结果。

与蛋白亲和色谱相比,免疫共沉淀试验的灵敏度不够高。

这与抗原浓度较低有关,但如果使抗原过量表达,又会破坏相互作用的天然状态。

免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法,也是较常用的方法。

它的优点是:与蛋白亲和色谱一样,检测的产物是粗提物;抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在,避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应;蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在;复合物以天然状态存在。

Schaerer与他的同事们利用免疫共沉淀技术研究了GABAA受体蛋白与多功能蛋白gC1q-R之间的相互作用,与酵母双杂交试验得到的结果完全相同。

其缺点是免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白,而是通过第三者间接相互作用的蛋白,另外,其灵敏度不及蛋白亲和色谱高,因为感兴趣的蛋白浓度不如后者高,这样驱动复合物形成的能力小。

免疫共沉淀的结果初步提示PKCα和IGF1R可能发生相互作用。

但这种方法有两个缺陷:一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;二是必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

为了解决免疫沉淀的这些问题,本实验制备了高效价的抗体来提高其灵敏度,此外还加大蛋白质A或G以及抗体的量,并将最后得到的蛋白进行浓缩,以便尽可能地得到较清晰的电泳条带。

同时,结合Far-Westernblotting等技术就可以弥补IP技术的不足,来证明两种蛋白质是否直接作用。

2 Far-Western blotting32P标记的谷胱甘肽S-转移酶Far-Western印迹最初发明用于(GST)-融合蛋白表达文库的筛选,现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。

最近几年,Far-Western还用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选。

借助蛋白质相互作用-这种分析方法,使许多研究变成可能,如翻译后修饰对蛋白质.的影响,用合成的多肽作探针检测蛋白相互作用的序列、以及在无抗原特异性抗体的情况下识别蛋白质-蛋白质相互作用。

Far-Western印迹技术与Western印迹十分相似。

在Western印迹中,运用抗体检测转移膜上的相应抗原。

在经典Far-Western印迹中,运用经标记的或可被抗体检测的“诱饵”蛋白检测转移膜上的“猎物”靶蛋白。

用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品(通常为细菌裂解液)然后转膜。

靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。

转膜后,封闭膜,用一已知诱饵蛋白(通常用纯品)进行探测。

诱饵蛋白与靶蛋白反应后,运用该诱饵蛋白的特异性检测系统即可检测出相应条带。

3 生物信息学预测蛋白质间相互作用的生物信息学方法主要包括以下九种方法:系统发育谱(phylogenetic profile)、基因邻接(gene neighborhood)、基因融合事件(gene fusion event)、镜像树(mirror tree)、突变关联(correlated mutation)、序列信号关联(correlated sequence-signatures)、保守的蛋白间相互作用(interologs)、同源结构复合体(homologous structural complexes)、进化速率关联(correlatedevolutionary-rate)。

以上描述的预测蛋白质相互作用的生物信息学方法还不完善,但预期是非常有前途的,特别是随着原始蛋白质组数据的积累,生物信息学注释手段的运用会愈显重要,相信会有更多的生物信息学算法开发出来。

对目前已有的多种生物信息学方法的比较和评估是另一项急待开展的工作,遗憾的是,这方面的文献不多,主要原因是缺乏作为评估标准的高质量实验数据。

因此,开发高质量的蛋白质相互作用数据库-分析工具-信息抽提方法,以及建立数据库之间信息交换的标准尤显重要。

4 酵母双杂交系统20世纪80年代中、后期,真核转录因子得到大量深入的研究,这类研究最终促成了酵母双杂交系统的诞生。

当时的研究发现,真核转录因子的DNA 结合区)AD,transcription activation domain(和转录激活区)BD,DNA-binding domain (.在功能上和实质上都是可分的。

BD能把蛋白定位到基因组特定DNA序列上,AD能够使转录装置激活基因转录。

Brent 和Ptashne于1985年证实,将2种不同蛋白的BD与AD重组,仍能产生有活性的转录因子。

该实验进一步说明了转录因子的特性。

后来,一些研究人员发现AD和BD不必在1条多肽上。

当这两个区域单独存在时均没有转录激活功能,但当它们在间上彼此联系时,则能够激活基因转录。

Field和Song正是利用这一特性建立了酵母双杂交系统。

转录激活因子在结构上是组件式的,即这些因子往往由2个或2个以上相互独立的结构域构成。

GAL4蛋白是1个基因转录激活子(由它激活转录的基因可以编码半乳糖苷酶)。

它包括2个分离的功能性结构域:1个能结合特异DNA序列(UASG)的N 末端结构域和1个包含酸性区域的C末端结构域,它是转录激活所必需的。

双杂交系统是这样建立的:GAL4的DNA结合结构域,与X蛋白质融合;GAL4的激活结构域,与蛋白质Y融合;X和Y形成一个蛋白质复合物,重新形成GAL4结构域的邻近效应,即实现了转录因子功能重建,导致UASG调控的基因(报告基因)开始转录。

他们当时还用2种已知的能与SNF1和SNF4互作的酵母蛋白质检验了这个系统,只有当2个融合蛋白都出现在1个细胞中时才能获得高的转录活性。

酵母双杂交的原理是将2个目的蛋白分别与AD和BD融合产生新的融合蛋白,如果这2个目的蛋白能够互相作用,则该相互作用会促使AD和BD 互相靠近而产生有活性的转录因子,进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。

在这以前,也有许多生物化学方法用来研究蛋白质间相互作用,但都是在体外研究,该系统可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用,且通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用的蛋白基因。

酵母双杂交系统与其衍生系统的操作程序是类似的,其基本操作程序大体包括以下几个步骤:①选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌;②诱饵蛋白表达质粒的构建和鉴定;③诱饵蛋白自身转录活性分析;④猎物蛋白cDNA 文库的构建;⑤酵母双杂交筛选与阳性克隆鉴定。

这是筛选相互作用蛋白的基本步骤,如果需要利用双杂交进行其他方面的研究,可根据不同试验目的进行相应地调整。

直接分析已知蛋白之间的相互作用酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、.及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。

酵母双杂交系统检测蛋白之间的相互作用具有以下优点:⑴作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

⑵检测在活细胞内进行,可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库,能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

酵母双杂交系统是分析蛋白-蛋白间相互作用的有效和快速的方法,有多方面的应用,但仍存在一些局限性。

⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等,这些反应在核内无法进行。

另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助,这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。

⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。

由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用,使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域,能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生假阳性结果。

针对“假阳性”问题,研究者在实践中通过对酵母双杂交系统进行改进出现了双筛选系统和假阳性显示分析法等。

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