小鼠干扰素应答基因_Ifrg15_的克隆_原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

从干扰素(interferons,IFNs)被发现至今已有五十余年，期间人们始终没有间断对其进行研究。

近期研究表明，IFN α、IFN τ和IFN γ在哺乳动物早期胚胎发育中均有重要的功能(Roberts et al.,1999;Ushizawa et al.,2004;Cencic and Bonnardiere,2002)，而IFNs 这些功能可能是通过JAK/STAT 信号通路实现的(Truchet et al.,2001;Imaakawa et al.,2002)。

干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)是干扰素与细胞膜上的受体结合后诱导表达的一族基因(Darnell et al.,1994;Stark et al.,1998)，其编码的蛋白产物可抑制病毒的复制，从而实现干扰素抗病毒的生物功能(Der et al.,1998)。

ˇ研究报告A Letter小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化丁彪1,2刘一飞1张运海2李文雍1*1阜阳师范学院生命科学学院胚胎发育与生殖调节安徽省重点实验室，阜阳236041；2安徽农业大学动物科技学院，合肥230036*通讯作者，Wyli97303@摘要为研究一个可能的干扰素应答基因(interferon responsive gene 15,Ifrg15)所编码蛋白质的生物学功能，对昆明小鼠(Mus musculus )基因组DNA 进行PCR 扩增获得Ifrg15(393bp)，并将其克隆到pGEM-T 载体，经测序鉴定后用Eco R Ⅰ和Xho Ⅰ酶切下Ifrg15基因片段并和双酶切后的表达载体pET-41(c)进行连接，然后转化入大肠杆菌(Escherichia coli )BL21(DE3)感受态细胞。

对重组克隆用IPTG 诱导融合蛋白的表达，并进行分离纯化。

结果表明，本实验在E.coli BL21(DE3)菌株中成功地高效表达、并在变性亲和层析条件下成功纯化了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白。

关键词干扰素应答基因(Ifrg15)，基因克隆，原核表达，亲和层析Cloning and Prokaryotic Expression of Mouse Interferon Responsive Gene (Ifrg15)and Affinity Purification of Its Fusion ProteinDing Biao 1,2Liu Yifei 1Zhang Yunhai 2Li Wenyong 1*1College of Life Sciences,Fuyang Normal University,Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation,Anhui Province,Fuyang 236041,China;2College of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China *Corresponding author,Wyli97303@ DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.021Abstract In order to study the function of a putative interferon responsive gene (Ifrg15),the genomic DNA ofKunming White mouse(Mus musculus )was purified and used as the PCR template for amplifying the Ifrg15coding region.The PCR product was cloned into pGEM-T vector and confirmed by DNA sequencing.The Ifrg15fragment was subcloned into pET-41(c)vector by Eco R Ⅰand Xho Ⅰdouble-digestion.Escherichia coli BL21(DE3)transformants were then selected and tested by IPTG induction for high level expression of GST&6xHis-Ifrg15fusion protein.The results showed that mouse Ifrg15gene was successfully cloned and expressed in the prokaryotic expression system.By using denaturing condition in the affinity chromatographic step,a decent level of purification of GST&6xHis-Ifrg15fusion protein was achieved.KeywordsInterferon responsive gene(Ifrg15),Gene cloning,Prokaryotic expression,Affinity chromatography农业生物技术学报，2010年，第18卷，第6期，第1168~1172页Journal of Agricultural Biotechnology,2010,Vol.18,No.6,1168~1172DOI:10.3969/j.issn.1674-7968.2010.06.021基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(No.30871415,31071310)和安徽高校省级自然科学研究规划重点项目(No.KJ2008A136)共同资助收稿日期：2009-11-26接受日期：2009-12-29小鼠干扰素应答基因(Ifrg15)的克隆、原核表达及其融合蛋白的亲和纯化Cloning and Prokaryotic Expression of Mouse Ifrg15Gene and Affinity Purification of Its Fusion Protein齐冰等(2006)用mRNA差异显示技术对兔植入前正常胚胎与克隆胚胎研究发现，存在一个异常表达的基因，经鉴定，该基因编码区DNA序列与小鼠Ifrg15基因有89%同源性，该研究认为Ifrg15可能与兔早期胚胎发育、卵子的发生、成熟等生理过程密切相关。

Vassena等(2007)用基因芯片分析小鼠克隆胚1-细胞和2-细胞期的转录物组时，发现很多基因异常表达，其中Ifrg15在正常胚胎中的表达比克隆胚高2.24倍。

以上研究均提示Ifrg15在哺乳动物胚胎的早期发育过程中可能有着非常重要的功能，并且其异常表达可能在一定程度上导致克隆胚胎的发育异常。

但目前对Ifrg15蛋白的功能还了解甚少。

小鼠Ifrg15基因的cDNA序列虽在1999年已被测定(Carninci and Hayashizaki,1999)，但除了NCBI中对该基因的简单描述外，至今还未见任何有关其研究的文献报道。

小鼠Ifrg15的开放阅读框包含396bp(GenBank AK032697.1)，编码131个氨基酸，与兔Ifrg15的氨基酸序列具有98%的同源性。

作者通过对GenBank中公开的鼠Ifrg15基因组DNA和mRNA序列进行分析后发现，该基因不存在内含子。

所以在本研究中，首先对小鼠基因组DNA进行PCR扩增获得了Ifrg15的基因片段，进而利用大肠杆菌表达系统成功地高效表达了GST&6xHis-Ifrg15融合蛋白，并通过亲和层析法较好地纯化了该融合蛋白，为下一步研究Ifrg15蛋白的功能提供重要基础。

1结果与分析1.1小鼠基因组DNA提取和Ifrg15扩增小鼠Ifrg15的ORF含393bp(GenBank AK0326 97.1)，上游引物从ORF的5'端起始，下游引物从ORF的3'端起始，加上Eco RⅠ和XhoⅠ两个酶切位点共411bp。

基因组DNA及PCR扩增Ifrg15产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

从图1可以看出，基因组DNA条带清晰、明亮，质量较好。

Ifrg15扩增产物大小约为411bp，与理论值相符。

1.2pGEM-T-Ifrg15重组质粒测序及双酶切鉴定将胶回收试剂盒回收、纯化的Ifrg15基因片段经Eco R I和Xho I双酶切后与pGEM-T载体连接，连接后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，对阳性克隆进行质粒提取并送上海生工测序，测序结果与小鼠Ifrg15基因中的编码区序列一致(GenBank AK032697.1)。

将重组质粒进行双酶切后经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示两条清晰电泳条带，一条为411bp左右的目的基因条带，一条为pGEM-T载体大片段(图2)。

1.3重组表达载体的构建及鉴定用胶回收试剂盒回收经Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切pGEM-T-Ifrg15重组质粒的目的基因，与经Eco R Ⅰ和XhoⅠ酶切并回收的pET-41(c)载体片段进行连接反应，连接产物转入BL21(DE3)感受态细胞，挑菌、摇菌后用Promega质粒小提试剂盒对1mL菌液进行质粒提取，然后对提取产物进行双酶切鉴定，酶切产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2，一条为pET-41(c)载体大片段，一条为目的基因条带，大小411bp左右(图3)。

图2克隆载体pGEM-T-Ifrg15重组质粒双酶切鉴定M：DNA marker DL2000；1：重组T载体双酶切产物Figure2Identification of recombinant plasmid pGEM-T-Ifrg15 by double enzyme digestionM：DNA marker DL2000;1：Recombinant T vector digested with Eco RⅠand XhoⅠM1pGEM-TIfrg15bp20001000750250100500图1小鼠肝脏基因组DNA和Ifrg15扩增产物凝胶电泳M：DNA marker DL2000；1：小鼠基因组DNA；2：Ifrg15(411 bp)PCR扩增产物Figure1Electrophoresis of mouse genomic DNA and PCR amplification products of Ifrg15from mouse liver genomic DNA M：DNA marker DL2000;1：Mouse genomic DNA;2：PCR amplification products of Ifrg15(411bp)M12bp200010007505002501169农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology 1.4重组蛋白的原核表达pET-41(c)载体表达的融合蛋白包含有GST 和6xHis 蛋白标签，标签序列共288个氨基酸，产物大小约32kD ，小鼠Ifrg15的ORF 编码131个氨基酸，大小约15kD ，融合蛋白的大小约为47kD 。