流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立_聂咏梅
流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍
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Flow Cytometry
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注意事项 1. 采血时请用大号针管，抽出的前 2ml 血应弃去不用。 2. 尽量避免标本受到物理振动。 3. 取血后 10 分钟内完成染色操作。 4. 在 Falcon 管中加血标本 5l， 管壁上不能有残留血， 未染色的部分会影响试验结果。 5. 为了检测和控制血小板体外激活，建议使用正常未受激活的血标本平行做质量控 制。
3.
荧光抗体染色： (1) Falcon 管编号。 (2) 在对照管中加入 PE 同型对照、CD61 PerCP、PAC-1 各 20l，RGDS 加
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10l。 (3) 在试验管中加入三种抗体各 20l。 (4) 在对照管和试验管中各加入未激活或激活的血标本 5l。 (5) 轻轻混匀，室温暗处孵育 15-20 分钟。 (6) 各管中加入 1ml 冷的固定液 (2-8C)，充分混匀， 2-8C 阴暗处放置 30 分 钟。 (7) 24 小时内上机分析。
质控标本 阴性对照（Isotype Control）：非特异荧光的强弱取决于抗体浓度、单克隆荧光抗体 特异性和纯度，应与试验管抗体相对应。在多色分析时，同型对照应与其它抗体同 时使用，以避免补偿造成的误差 血小板体外活化试验：使用正常人活化标本作为阳性质控；使用正常人未活化标本 作为阴性质控 血小板自身抗体检测：使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质 控；使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控 血小板表面抗原缺失：如巨血小板症血小板表面 CD42a/CD42b 缺失，血小板无力 症血小板表面 gpIIb/IIIa， 即 CD41/CD61 缺失或异常。 使用正常人标本做阳性对照， 抗体的同型对照做阴性对照 血小板标本上机检测 仪器校正：由于试验室环境波动，会导致荧光有所波动，因此，需要对仪器进行校 正。配置 CaliBRITE 微球，使用 FACSComp 自动校正仪器 打开 CELLQuest 软件，调整数据获取条件：散射光和荧光均使用对数放大。调整 散射光电压，使血小板群位于点图中间位置。调整荧光电压，是对照管非特异荧光 位于坐下角。使用微球或样本调整补偿 数据获取：获取血小板 5000 个以上。 数据分析： 1. 设门： 1) FSC-SSC 点图中找出血小板，缺点是血小板较小，不易通过大小将碎片或 杂质完全分开
流式细胞术在血小板检测中的应用于方法介绍
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血小板的活化、荧光染色与流式细胞仪分析
前言 血小板活化试验，对于血小板功能、心血管疾病的研究，有重要意义。使用流式细 胞仪进行多参数分析，可以特异灵敏地检测血小板表面标记，了解血小板的活化状态和 反应性，并同时获得更多关于血小板的信息。在疾病监测、抗血小板治疗病人的筛选及 治疗监测、预测并发症等方面有良好的应用前景。 使用推荐的三色流式分析方法检测血小板活化的优点是： 检测血小板的反应性。 了解血小板活化进程。血小板先发生膜糖蛋白变化，然后是胞浆内颗粒释放到 血小板外。 同时检测多种血小板表面标志。 高度灵敏。 直接检测血小板的多种标志。 使用全血，标本量少。 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低。
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附：BDIS 血小板活化试剂
BD 抗体： CD PAC-1 CD62P CD61 Isotype 1 CaliBRITE 3 Ig Subclass IgM IgG1 IgG1 Form FITC PE PerCP PE Unlabeled,FITC,PE,PerCP Catalog No. 340507 348107 340506 340013 340486 Tests 50 100 50 25g 25
流式细胞仪检测全血中血小板功能状态 全血中血小板更接近生理状态 操作简便，减少由于操作造成的血小板状态改变（如血小板活化试验） 同时检测血小板的多个标志物，结合 FSC 和 SSC，评估多个参数，进行定量分析 多采用血小板特异抗体 CD41 或 CD61 画门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰 检测血小板亚群灵敏度高 用血量少 无放射性污染
流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立
流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用
流式细胞术筛查血小板抗体方法的建立及应用目的建立一种用流式细胞术筛查血小板抗体的方法，并将其应用于临床治疗中。
方法将78例需进行血小板抗体检测的患者进行AB两组试验，分别用常规处理法和流式细胞术来进行检测，观察两组的检测结果。
结果A组的检出率为25.65%，而B组的检出率为35.90%，相比而言，B组的检出率明显高于A组，而且检测的时间也要短于A组，但是两者的阳性率无明显差异。
经检测，B组中还发现有10例含抗HLA抗体，有1例含抗HPA-5b抗体，有9例为自身抗体。
结论对于筛查血小板的抗体，流式细胞术的建立以及应用为临床治疗提供了很大的便利，该方法不仅检测速度快，操作简单，还实现了标准化，非常适用于临床检测。
标签：流式细胞术；血小板抗体；方法建立；临床应用通过对常规处理法和流式细胞术的比较来具体探讨流式细胞术在临床检测中的应用与效果，并作如下分析。
1 资料与方法1.1 一般资料选择2016年本市医院的共100例血小板患者的资料，对不同年龄，不同症状的患者进行检查，针对血小板来进行针对性检查。
患者均无其他相关疾病，并且满足了患者检测的相关标准，保证了医院数据处理中的准确性。
且并未注射激素或进行免疫性抑制等治疗。
将患者进行AB两组不同的检测试验。
1.2 方法所有患者均在本省同一家医院内进行治疗，A组采用常规处理法，即经典酶联免疫吸附试验（ELISA），B组采用流式细胞术（FCM）。
（1）制备样本：采取的静脉血应该在15毫升以上，然后放入抗凝试管中，防止血液凝固。
15 ml血液中13 ml用于血小板自身抗体检测试验盒检测，即ELISA，用离心法分离血小板，之后进行冷却。
剩余的2 ml用于流式细胞术（FCM）检测。
（2）经典酶联免疫吸附试验（ELISA）技术检测：按照使用说明书来进行检测。
（3）流式细胞术（FCM）技术检测：将2 ml周血600转离心，得1 ml上清，加入1 ml多聚甲醛（2%）混匀，2000转离心，弃上清，加入2 mlPBS洗涤，2000转离心，弃上清，加入2 mlPBS重悬备用，取100 ul重悬液与20 ulCD41-PE（北京旷博生物技术股份有限公司）混匀，孵育20分钟后上机检测。
流式细胞术检测血小板相关抗体诊断原发免疫性血小板减少症的价值
流式细胞术检测血小板相关抗体诊断原发免疫性血小板减少症的价值肖平;吴祖常【摘要】Objective To investigate the clinical significance of platelet-associated immunoglobulin(PAIg) detected by flow cytometry(FCM) in the diagnosis of primary idiopathic thrombocytopenia(ITP).Methods The expressing level of PAIg (PAIgG,PAIgM,PAIgA) was detected by FCM in 50 newly diagnosed patients with primary ITP,92 patients with secondary immune thrombocytopenia(sITP) and 31 healthy controls.Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis was used to determine the optimal cutoff value .Results The expressing levels of PAIgG ,PAIgM and PAIgA in newly diagnosed ITP patients were significantly higher than those in sITP group and health controls (P<0.01).The expressing levels of PAIgM and PAIgA in sITP group were significantly higher than health controls (P<0.05),but there was no significant difference in PAIgG(P>0.05).The optimal cutoff values of positivity of PAIgG,PAIgM and PAIgA for the discrimination of ITP and non-ITP were 5%,7%and 4%,respectively ,and the sensitivity and specificity of a positive PAIgM individual test for ITP were 72.0%and 73.2%,respectively,which were higher than those of PAIgG (60.0%,67.5%).There were the highest specificity(88.6%) and the lowest sensitivity(48.0%) in PAIgA.The sensitivity of PAIgG plus PAIgM test was 78.0%, higher than that of PAIgM or PAIgG test alone .The specificity of PAIgM plus PAIgG test was 66.7%,lower than that of PAIgM or PAIgG testalone .Conclusion PAIg detection is valuable in differential diagnosis ofITP .The diagnostic value of PAIgM combined with PAIgG is better thanthat of PAIgM or PAIgG alone .%目的：探讨流式细胞术（FCM）检测血小板相关抗体（PAIg）在诊断原发免疫性血小板减少症（ITP）的价值。
流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立
【 摘要】 目的
建 立一种 流式细胞 术检测动物模 型小鼠全血 中人 血 小板 （ Ｐ Ｔ ） ｈ Ｌ ｓ 的方 法。方法
用 Ｃ ２致 ０
死ＳＩ ＣＤ小鼠 。 即心脏 穿刺取 血 ， Ｅ Ｔ 立 用 Ｄ Ａ抗凝 小鼠全血 ， 备用 。无 菌分 离 ５ｍ Ｌ人 的单采血小板备 用。用 １ 多 ％
Ｆ ｏ Ｃｙ ｏ ｔ ｉ ｅｈ ｄ ｆ ｒ Ｈｕ ａ ｌ ｔ ｌ ｔ ｕ ｔｎ ｎ Ｍ ｏ ｓ ｈ ｌ ｏ ｄ ＮＩ ｙ ｌ ｗ ｔ ｍｅ ｒｃ Ｍ ｔ ｏ ｏ ｍ ｎ Ｐ ａ ｅ ｅｓ Ｃｏ ｎ ｉ ｇ ｉ ｕ ｅ Ｗ ｏ ｅ Ｂｌ ｏ Ｅ ０ Ｄｕ ｎ ．Ｌ ｒｙ ｍｏ ｔ ａ ｒ Ｄｕ ｎ ． Ｇ ａ ｇ ｈ ｕ Ｂｌｏ ｅ ｔｒ ｍｏ ｔ ｕ ｎ ｚ ｏ ｏ ｄ Ｃ ｎ ｅ ，Ｇｕ ｎ ｚ ｏ ０ ５． ｉａ ａｇｈｕ５０ ９ ｎ ． １
ｓ ｑ ｅ ｔ ，ｍｉ ｅ ｐ ｃ ｍｅ ｅ ｅ ｆ ｅ ｙ １ ｃ ｌ ａ ａｏ ｍａｄ ｈ ｄ ，ｈ ｌ ｖ ｒ ｉｈ ｔ ｅ ｕ ｎｌ ｙ ｘ ｄ ｓ ｅ ｉ ｎ ｗ ｒ ｘ ｄ ｂ ％ ｏ ｄ ｐ ｒ ｆｒ ｌ ｅ ｙ ｅ ｅｄ ｏ ｅｎ ｇ ｔ ｉ ａ ４℃ ， ｓ ｅ ｎ ｅ ｕ ｐ ｎ ｅ ｉ ｗａ ｈ ｄ ａ ｄ ｒ ｓ ｓ ｅ ｄ ｄ ｗ ｔ ｈ １ Ｐ Ｓ １ Ｆ Ｓ ％ Ｂ ／％ Ｂ ．Ｆ ｕ ｒ ｕ ｓ ｗ ｒ ｅ ，ｉｃ ｕ ｉ ｇ ｔ ｏ ｐ ｓｔ ｅ ｃ ｎｒ ｌｇ ｏ ｐ 。ｏ ｅ ｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｌｇｏ ｐ ａ ｄ ｏ ｅ ｉｏｙ ｅ ｏ ｒ ｇ ｏ ｐ ｅ ｅ ｓ ｔ ｎ ｌ ｄ ｎ ｗ ｏ ｉ ｖ ｏ ｔ ｒ ｕ ｓ ｎ ｘ ｅ ｉ ｏ ｉ ｎ ａ ｕ ｎ ｎ ｓ ｔｐ ｒ ｃ ｎｒ １ ｌ ｔｌｔ ｒ ｏ ｎ ｅ ｙ ｆ ｗ ｃ ｔｍｅ ｒ ． Ｃ ｎ ｅ ｔ ｔ ｎ ｏ Ｐ Ｔ ｉ ｈ ｄ ｓ ｎ ｄ ａ ｘ ｅ ｔｄ ｈ Ｌ ｓｗａ ａ — ｏ ｔ ．Ｐ ａｅｅ ｓｗｅｅ ｃ ｕ ｔｄ ｂ ｏ ｙｏ ｔｙ ｏ ｌ ｏ ｃ ｎ ｒ ｉ ｆ ｈ Ｌ ｓ ｗｈ ｃ ｅ ｉ ｅ ｓ ｅ ｐ ｃ ｅ Ｐ Ｔ ｓｍｅ ａｏ ｇ ｓ
利用流式细胞仪检测网织血小板的临床应用价值
利用流式细胞仪检测网织血小板的临床应用价值发表时间：2017-07-17T17:08:06.967Z 来源：《中国医学人文》2017年第4期作者：赵艳艳主管检验师[导读] 利用流式细胞仪检测网织血小板的方法，为网织血小板更准确的诊断各类血小板减少性疾病的应用创造了条件。
（嘉祥县人民医院检验科，山东济宁 272400）【摘要】目的：探讨应用流式细胞仪检测网织血小板的临床应用价值。
方法：2012年7月～2016年12月，本研究选取我院64例门诊和血液科住院患者的外周血标本，利用流式细胞仪测定外周血RP(％)，利用全自动血液分析仪测定血小板计数。
结果：健康体检组经检测后RP(％)值为7.33±2.17，ITP患者组RP(％)值为21.13±6.27，明显高于健康体检组（P<0.01）。
CAA患者组RP(％)值为5.82±1.26，明显低于健康体检组（P<0.05）。
AML患者组和MDS患者组RP(％)值分别为8.26±2.45、8.12±2.59，与健康体检组相比差异无统计学意义(P>0．05)。
结论：利用流式细胞仪检测网织血小板的方法，为网织血小板更准确的诊断各类血小板减少性疾病的应用创造了条件，网织血小板在血液病中的检测具有重要的应用价值。
【关键词】流式细胞仪；网织血小板；检测；临床应用价值网织血小板(reticdated platelet，RP)是来源于巨核细胞的细胞颗粒，这种细胞颗粒不含核或DNA成分，却含有少量的RNA，并且保持了合成少量蛋白质的能力人们把这种RNA含量较高的年轻的血小板称之为网织血小板。
网织血小板是骨髓新释放进入血液循环的血小板，它可以相对准确地反映骨髓血小板生成情况[1]。
本研究近年来利用流式细胞仪检测网织血小板的方法，以发现网织血小板的变化规律，为网织血小板更准确的诊断各类血小板减少性疾病的应用中创造条件。
全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果观察
四遍后 ，向每孔加入 底物 １ ０ ０ Ｌ ，置于３ ７℃下孵育 １ ０ ｍ ｉ ｎ 。取 出后 立即加人 终止 剂 ，在酶标仪 洗涤分离 出的血小板 ，计数 后 ，溶解血小 板 ，离心沉淀 ，取上 清１ ０ ０“ Ｌ加入酶标仪 比色皿 中。设置波长为４ ９ ２ Ｍ ＇ ｎ ，读取 比色读数 ， 计算 含量。
国睚｜囡—国瞄疆 ２ ０ １ ４ 年７ 月第 １ ２ 卷 第２ １ 期
・
临床研究 ・ ２ ４ ５
全血法流式细胞术检测血 小板抗体 的效果观察
郑 玉 梅
（ 吉林 省农安县 中医 院检验科 ，吉林 长春 １ ３ ０ ２ ０ ０ ）
【 摘 要 】 目的 探 讨 全血 法流 式细 胞 术检 测血 小 板抗 体 的 效果 ，初 步建 立 并优 化 这 种 以全血 为标 本 的流 式细 胞仪 （ Ｆ Ｃ Ｍ ）检 测血 小板抗 体 的 方 法。方 法 应 用 Ｆ Ｃ Ｍ ，以 多种参 数 分析 全血 中 的 Ｃ Ｄ 标 记的血 小 板群 。结果 采集检 测 所需 的血 样 ，其体 积 以微 升 为数 量级 单位 ，每
国）【 ２ 】 ａ
１ ． ２检 查方法
① 实验 条件 的确立 ：ａ ． 可重 复性 ：首先 考察 同一 实 验操 作者 在
相 同实 验条 件 下 ，同时对 同一样 本进 行多 次 （ ＝ ５ ）重复检 测 时检 测
次检 测 需要 ２ ｈ ，检 测 的 阳性率 与理 论值 呈 明显正 相 关 （ ｒ＞ ０ ． ９ ，Ｐ ＜ ０ ． ０ ０ １ ） ，含 有 ｃ ． 抗 体 的血 小板 占全部 正 常血 小板 的 ３ ％，可检 测 血 小 板 计数 低 达 １ ０×１ ０ 的标 本 。结 论 采 用 全血 法 流 式细 胞 术 ，所 需血 样 量 少，较 适合 血 小 板极 低 或血 小板抗 体 少的 患者 检 测快 速 ， 本 法比 传统 的 定性 检 测 法 与定量检 测 法效 果好 ，具 有 临床 推 广价 值 。 【 关键 词 】 全血 法 ；流 式细胞 术 ；检 测 ；血 小 板抗体 ；效果观 察
流式细胞术检测活化血小板方法学研究
·623 ·
0137 、0123 ±0145 、1135 ±0139 ( n = 9 , F = 11403 , P = 01223) ; 1 000μmol/ L ADP 刺激组 :28183 ±6133 、29105 ±7121 、30166 ±6192 、32173 ±7197 、33180 ±8172 ( n = 8 , F = 01760 , P = 01605) ,可见二组标本的血小板 CD62P 的稳定性至少达 24 h ( P > 0105) 。
图 1 不同 PFA 固定浓度在正常组血小板 CD62P 的表达和 FS/ SS 设门中的血小板数
4. 对 015 %PFA 固定标本血小板 CD62P 评估的敏感性 : 用不同浓度 ADP 刺激部分血小板活化 ,浓度分别是 : 未加 、 PBS :01001 、0101 、011 、1 、10 、100 、1 000 、10 000 μmol/ L ADP 刺 激 后 血 小 板 CD62P 的 表 达 : 1123 %、2169 %、3182 %、 4177 %、5148 %、6175 %、7193 %、1013 %、28163 %、57118 % , 即使对很小程度的血小板活化也有足够的敏感性 。
品。 5. 标本制备 :5μl 标本和 50μl 荧光标记抗体 (10 倍稀释)
混合 ,37 ℃,暗处 ,要求 100 %的湿度 ,孵育 20 min 后 ,加入 1 ml 1 %PFA 。
6. 流式细胞仪分析 :以 Flow Check 校准仪器光路 ,使 half CV < 2 % ,调整荧光补偿 ,测定标本 。在 PRP 或单色标记的 全血中 ,血小板群通过 FS/ SS 对数形式散点图中被选定分析 , 在双色标记的全血中 ,只有 CD61 、CD41 表达阳性的血小板被 分析 。每份标本测定 10 000 个血小板以上 。
流式细胞术检测小鼠全血中人血小板方法的建立_聂咏梅
Flow CytometricMethodforHumanPlateletsCountinginMouseWholeBlood NIE Yong-mei☆, DeborahF. Dumont, LarryJ.Dumont.☆GuangzhouBloodCenter, Guangzhou510095, China. 【Abstract】 Objective Tosetupaflowcytometricmethodforhumanplatelets(hPLTs)countinginmousewhole blood(MWB).Methods MWBwascollectedviacardiacpuncturefromSCIDmicesacrificedwithCO2 andpreserved withEDTA.Humanplatelets(hPLTs)werepreparedfromapheresisplateletsandmixedwithMWB(V/V=1∶4).Subsequently, mixedspecimenwerefixedby1% coldparaformaldehyde, heldovernightat4℃, washedandresuspendedwith 1% PBS/1% FBS.Fourgroupswereset, includingtwopositivecontrolgroups, oneexperimentalgroupandoneisotype control.Plateletswerecountedbyflowcytometry.ConcentrationofhPLTswhichdesignedasexpectedhPLTswasmeasuredbyADVIA120 hematologysystem(Bayer).Theoriginalmixedspecimenwasdilutedby10, 100, 1 000, 10 000 and100 000 -foldwithMWB.Themixedbloodwasthendouble-stainedwithPE-CD41 andFITC-CD61 inTruCOUNTtubetomeasuredhPLTs, whichwasdesignedasmeasuredhPLTs.Correlationwasanalyzedbetweentheexpected andmeasuredhPLTs.Results Humanplateletsweresuccessfullycountedbyflowcytometry.Nofalsepositiveorfalse negativeresultwasobserved.GoodcorrelationbetweenexpectedandmeasuredhPLTswaspresentedrangingfrom3 000 to 150 000/μL.Conclusion hPLTscanbecountedbytheflowcytometicmethodrangingfrom 3 000 to150 000/μL.
流式细胞术同时检测网织红细胞与网织血小板
流式细胞术同时检测网织红细胞与网织血小板
许艳丽;毛平
【期刊名称】《国际检验医学杂志》
【年(卷),期】2001(022)005
【摘要】目的:探讨流式细胞术同时检测网织红细胞与网织血小板的可行性,建立网织红细胞与网织血小板在流式细胞仪检测中的正常参考值.方法:采用荧光染料噻唑橙(TO)标记的方法,用流式细胞仪分析人体血细胞中网织红细胞与网织血小板的表达情况.结果:流式细胞仪图谱可明显区分红细胞与血小板两群细胞群体,可同时进行网织红细胞与网织血小板的分析,网织红细胞在人体外周血中表达的百分含量为1.14±0.23,网织血小板为1.59士0.73.提示:利用流式细胞仪可同时进行网织红细胞与网织血小板的百分数检测,快速、客观、准确,可做为临床检验指标之一,广为推展.
【总页数】1页(P275-275)
【作者】许艳丽;毛平
【作者单位】广州市第一人民医院,广东,510180;广州市第一人民医院,广
东,510180
【正文语种】中文
【中图分类】R446
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流式细胞术测定血小板聚集探讨
流式细胞术测定血小板聚集探讨丛玉隆;李绵洋;邓新立;殷宗健;张立文;秦小玲【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2003(021)005【摘要】目的评价流式细胞术测定血小板聚集的方法,探讨其质量控制.方法体外以ADP活化全血或富血小板血浆(PRP),血小板聚集,再以荧光抗体CD61 PerCP标记活化血小板,行流式细胞术分析,相对计数单个血小板数量,以单个血小板数量的减少衡量血小板聚集率的大小.并进行方法学评价及质量控制问题的探讨.结果流式细胞术测定全血或血浆血小板聚集的方法具有较高的重复性;与传统的浊度法测定比较,结果相关较好,测定的敏感性高于浊度法;测定结果与标本类型、血小板数量、检测温度以及对反应体系的搅拌等因素有关.结论流式细胞术测定血小板聚集是一项准确、敏感的检测方法.【总页数】3页(P279-281)【作者】丛玉隆;李绵洋;邓新立;殷宗健;张立文;秦小玲【作者单位】中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853;中国人民解放军总医院临床检验科,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】R446.113【相关文献】1.不同处理方法对流式细胞术检测外周血单核细胞-血小板聚集体的影响 [J], 李琳芸;梅冰;王昌富2.基于流式细胞术的小鼠血小板聚集率检测方法评价及川芎嗪的干预作用 [J], 梅金平;周欣;姬文婕;马永强;杨国红;郭兆增;李玉明;赵季红3.流式细胞术与光学比浊法检测血小板聚集率的比较 [J], 梅金平;周欣;姬文婕;马永强;郭兆增;杨国红;刘新林;赵季红;李玉明4.应用流式细胞术检测血小板聚集及活化功能临床观察 [J], 熊丽丽;魏文宁;马怀安5.PL-11多参数血小板功能分析仪与流式细胞术检测血小板聚集功能的效果比较[J], 陈永源;周伯荣;钟广宏;李晓莹;高万里;罗建华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
全血流式细胞术检测血小板膜糖蛋白Ib
全血流式细胞术检测血小板膜糖蛋白Ib
李德强;阎德民
【期刊名称】《医学检验进修杂志》
【年(卷),期】2000(007)001
【摘要】目的建立全血流式细胞术检测血小板膜糖蛋白Ｉｂ（ＧＰＩｂ）的实验方法，并探讨了体外循环（ＣＰＢ）期间血小板ＧＰＩｂ的变化及意义。
方法抽取献血员及二尖瓣置换病人的血液，经免疫荧光染色，通过流式式细胞仪检测并分析结果。
结果经多聚甲醛（ＰＦＡ）固定的血标本可减少非特异染色。
ＣＰＢ期间血小板ＧＰＩｂ呈降低趋势，ＣＰＢ结束２小时达最低点（ｔ＝３．７１４，Ｐ〈０．０１），术后一天回复术前水平（ｔ＝１．９２
【总页数】2页(P32-33)
【作者】李德强;阎德民
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R654.1
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4.全血法流式细胞术检测中性粒细胞抗体方法建立及临床初步应用 [J], 王璇;朱晴
晖
5.全血法流式细胞术检测血小板抗体的效果观察 [J], 郑玉梅
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流式细胞术检测血小板单核细胞聚集的影响因素
中华检验医学杂志 &’’$ 年 !& 月第 &/ 卷第 !& 期Z B[01 K @DS 3I\， ;IHI*SIO &’’$ ，L?+ &/ ，J?7 !&
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对象与方法 !" 对象： 选取无心血管疾病， 两周内未接受过包 括阿司匹林在内的任何药物治疗的健康志愿者 # 名， 其中男 $ 名， 女 % 名， 年龄 &’ ( %& 岁。采集用 &!) 无菌注射器由肘前静脉抽取 !’ *+ 静脉全血， 缓缓加入相应的抗凝管至刻度要求， 轻轻颠倒混匀。 将各管分成两份， 分别于室温 &’, 和 %, 放 置 ’ 、 -’ 、 .’ 、 !/’ 和 -.’ *01。在研究多聚甲醛对 2345 测 定的影响时， 抽血前预先向枸橼酸钠抗凝管中加入 %, 预冷的 !’6 多聚甲醛 !$’ ! （ + 终浓度为 ’7 $6 ） ， 立即加入全血 &7 8 *+， 室温下放置上述相同时间。 研究抗凝剂 9& :;<4 对已形成 2345 稳定性影响 时， 取室温下上述不同放置时间的枸橼酸钠抗凝血 & *+ 加 入 一 空 9& :;<4 抗 凝 管 中 9& :;<4 为 -7 . *= > 管， 标本中 9& :;<4 的终浓度为 $ **?+ > @， 轻 轻混匀。研究固定剂 2A4 对已形成 2345 稳定性影 响时取室温下放置 -.’ *01 的枸橼酸钠抗凝全血， 取 ! *+ 加入预冷 !’6 多聚甲醛 $’ !+， 轻轻混匀， 放 置 -’ *01 后测定。 &" 抗 体 标 记 和 红 细 胞 裂 解： 吸 取 B;!%C2: 和 B;%&DCAE<B 各 !’ !+ 于一干净试管中， 按血液放置 的不同时间分别吸取抗凝全血 &’ !+ 加入试管中， 轻 轻混匀， 室温避光静置孵育 &’ *01。加入细胞裂解 液 A4BF， 混匀后避光放置 !$ *01。阴性同型对照则 取 B;!%C2: 和鼠 E=) &DC AE<B 各 !’ !+ 于同一试管 中， 加入相应抗凝全血 &’ !+， 其余操作步骤同前。 -" 材料： B;!%C2: （ 藻红蛋白） 、 B;%&DCAE<B （异 硫氰酸荧光素） 和鼠 E=) &DC AE<B 均购自 G; 公司 （ G; G0?5H0I1HI JK） 。细胞裂解液 A4BF 购自 G; 公 司。枸橼酸钠 （ 浓度 -7 /6 ） 和 9& :;<4 抗凝管均 为 G; 公司 LDHMND01IO5 真空管， 多聚甲醛 （ 2A4 ） 购 自 F0=*D 公司。 %" 仪 器： 流 式 细 胞 仪 为 H?M+NIO IP0H Q@C3B@ （ GIHR*D1 H?M+NIO 公司） 。 $" 流式细胞仪分析： 样品上机分析。首先在侧 向散射光 （ FF ） 相对于 B;!%C2: 荧光强度的散点图 上圈定单核细胞群并设门， 见图 !D。图 !S 为阳性 单核细胞数相对 B;!%C2: 荧光强度的直方图。在 B;%&DCAE<B 相 对 于 B;!%C2: 散 点 图 上 可 以 显 示 2345 （ B;%&DCAE<B 和 B;!%C2: 双阳性的颗粒， 如图 所占总数 ! ’’’ 个门内单核细胞 -S 中 :& 区域所示） 的百分比。先运行阴性同型对照样品， 将 B;%&DC
流式细胞术检测血小板脱糖方法建立及意义
流式细胞术检测血小板脱糖方法建立及意义汪嘉佳;陶莉莉;潘莹;王会平;晏开力;张家奎;倪合宇;翟志敏【摘要】目的通过运用流式细胞术检测正常人血小板在4、25℃下,0、4、8、24 h各个时间点,血小板脱糖的两个标志物蓖麻凝集素( RCA)、鸡冠刺桐凝集素( ECL)是否有所差异,确立运用流式细胞术检测血小板脱糖水平的最佳条件。
确立最佳条件后,运用流式细胞术检测20例原发免疫性血小板减少症( ITP)患者的血小板脱糖水平。
方法随机选取正常成年人20例,运用多参数流式细胞术检测正常成年人不同温度(4、25℃),不同时间点(0、4、8、24 h)条件下血小板脱糖水平( RCA、ECL)是否存在差异。
确立最佳条件后,运用流式细胞术检测20例ITP患者血小板脱糖水平。
结果n<br> 4、25℃ 下,4个时间点脱糖水平 RCA%、ECL%均不明显。
常规治疗效果较好的ITP患者脱糖水平RCA%、ECL%不明显,但是治疗效果不好的 ITP 患者脱糖水平 RCA %、ECL %明显高于治疗效果理想的患者。
结论流式细胞术检测血小板脱糖水平最好在标本收集后立即处理,脱糖水平( RCA、ECL)与ITP患者治疗效果有关,即脱糖水平越低其治疗效果越好。
%Objective To detect desialylation of platelets in normal,and research influence about ricinus communis agglutinin(RCA) and erythrina cristagalli lectin(ECL) which are two factors of desialylation of platelets in different time periods(0,4,8,24 h) and different temperatures(4,25 ℃),thus establish the test method which can detect desialylation of platelets in autoimmunethrombocytopenia( ITP) . Methods 20 normal subjects were selected and researched for the differences about RCA and ECL which were two factorsof desialyation of platelets in different time periods(0,4,8,24 h) and different temperatures(4,25℃) with flow cytometry. Under this condition,the best test method that could detect desialylation of platelets in 20 cases of ITP could be established in the end. Results The results showed that the median of the desialylation of platelets( RCA% and ECL%) was not significant in 4 pe-riods under 4,25 ℃,respectively. The results showed that the median of the desialylation of platelets( RCA% and ECL%) in effective responses to conventional therapy( corticosteroids,IVIG etc) was lowerthan the group which were inferior responses to conventional therapy. Conclusion The test method about desialylation of platelets in ITP should be better to detect in one day. The desialylation of platelets(RCA,ECL) is interrelated with treatment of ITP. And the lower desialyation prompts better outcome in ITP which is effective response to conventional therapy.【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】4页(P329-332)【关键词】血小板脱糖;原发免疫性血小板减少症;RCA;ECL;流式细胞术【作者】汪嘉佳;陶莉莉;潘莹;王会平;晏开力;张家奎;倪合宇;翟志敏【作者单位】安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥230601;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥230601;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥230601;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥230601;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥230601;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥 230601;加拿大多伦多大学实验医学与病理生物学系，加拿大M2J46A;安徽医科大学第二附属医院血液内科安徽医科大学血液病研究中心，合肥 230601【正文语种】中文【中图分类】R733.711原发免疫血小板减少症（autoimmune thrombocytopenia，ITP）是一种由体液免疫和细胞免疫共同介导的，以血小板破坏增加，骨髓中巨核细胞成熟障碍和血小板生成异常为特点的一种自身免疫性疾病，约占出血疾病的30%［1］。
应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法
应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法柏春玲;廖泽容;张巧;董馨忆【期刊名称】《昆明医科大学学报》【年(卷),期】2017(038)002【摘要】目的探索能通过流式细胞术快速测定细胞周期的方法.方法培养的小鼠成纤维细胞分别采用DNA一步法和溴化丙啶(PI)标准染色流程染色,应用流式细胞仪检测细胞G1期、S期和G2/M期的DNA含量,比较2种方法的测定结果.结果2种染色方法标记的小鼠成纤维细胞呈现完整的细胞周期峰,G1含量分别为65.85％和66.54％,S期含量分别为13.45％和13.32％,G2/M期含量分别为20.71％和20.15％,结果差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DNA一步法能通过流式细胞术快速准确地测定细胞周期.%Objective To explore the method that can rapidly analyze cell cycle by flow cytometer.Methods Mouse fibroblast cells stained with DNA one-step method and Bromide (PI) standard dyeing process were measured by flow cytometer for the percentages of cells inG1,S and G2/M phases.The results were analyzed and compared.Result The complete cell cycle of mouse fibroblast cells stained with DNA one-step method or Bromide bromide (PI) standard dyeing process was showed entirely,the percentages of cells in G1 were 65.85％ and 66.54％,in S were 13.45％ and 13.32％,and in G2/M,20.71％ and 20.15％,respectively.The results from the two different methods showed no significant difference (P ＞0.05).Conclusions The DNA one-step method can quickly and accurately analyze cell cycle by flow cytometer.【总页数】4页(P10-13)【作者】柏春玲;廖泽容;张巧;董馨忆【作者单位】昆明医科大学科研实验中心,云南昆明 650500;昆明医科大学现代教育技术中心,云南昆明 650500;昆明医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系,云南昆明 650500;昆明医科大学科研实验中心,云南昆明 650500【正文语种】中文【中图分类】Q253【相关文献】1.流式细胞术检测鼻腔鼻窦肿瘤细胞周期的DNA分析 [J], 薛卫国;孙洁;薛子超;公蕾;李敬华2.应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法 [J], 柏春玲;廖泽容;张巧;董馨忆;3.应用流式细胞术快速测定细胞周期的DNA一步法 [J], 柏春玲;廖泽容;张巧;董馨忆;4.流式细胞术测定骨骼肌细胞分化中DNA合成及其细胞周期变化 [J], 秦瑞峰;顾晓明;黄富国;张浩5.CD11b/DNA双参数流式细胞术检测HL-60细胞分化的细胞周期 [J], 文若剑;谢大兴;张鹏;陶德定;龚建平;余从年因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
全血三色法流式细胞术检测血小板P-选择素的方法
全血三色法流式细胞术检测血小板P-选择素的方法龚艳春;郭冀珍;史桂英;石学耕【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2001(021)004【摘要】目的建立全血三色法流式细胞术测定血小板P-选择素,反映体内活化血小板的表达,并且与常规法(富血小板血浆法,PRP法)比较该法.方法在该法及PRP法中,加入三种荧光标记的单克隆抗体FITC-CD42a、PE-62P及CY-CD45,室温避光反应20min,1%多聚甲醛固定10min,用PBS洗2次,上机分析. 结果该法测定P-选择素的表达比常规法明显降低(P＜0.05).结论全血三色法测定全血中P-选择素表达特异性高,更接近人体生理环境.【总页数】4页(P328-331)【作者】龚艳春;郭冀珍;史桂英;石学耕【作者单位】上海第二医科大学瑞金医院高血压科上海市高血压研究所,;上海第二医科大学瑞金医院高血压科上海市高血压研究所,;上海第二医科大学瑞金医院高血压科上海市高血压研究所,;上海第二医科大学瑞金医院高血压科上海市高血压研究所,【正文语种】中文【中图分类】Q6-33【相关文献】1.原发性肾小球肾炎患者外周血血小板P-选择素检测的临床意义 [J], 邹伟华;顾金华;胡小芹2.狼疮性肾炎患者外周血血小板P-选择素、淋巴细胞L-选择素和细胞间黏附分子-1的表达 [J], 戴勇;李富荣;王新根3.胰岛素对全血血小板膜P-选择素表达影响的研究 [J], 彭必友;周艳;董为人;汪吉仪;薛耀明;蔡德鸿4.全血血小板膜粘附受体的流式细胞术检测及方法探讨 [J], 陈练波;董为人;东方5.慢性肾功能不全患者外周血血小板P-选择素、L-选择素和细胞间粘附分子-1表达的研究 [J], 戴勇;李富荣;贺晓蕾;王新根;黄瑞芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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计数结果为 “血小板期望值 ” 。其余 10倍体 积比稀释
样本的 “血小板期望值 ”采用理论上的计算值 。
取 2 mLhPLTs于干燥试管中 , 按 1∶4 的体 积比例
与小鼠全血混 合 , 制备 原始 混合血 液 。再用 小鼠 全血
———
10
1.6 定量检测小鼠全血中 hPLTs 按照 1.5所述方法
采集并抗凝小鼠全血 。从保存期单采血小板 袋中无菌
分取 5 mL单采血小板产品 。
取 2 mL样本于干燥试管中 , 按 1∶4的体 积比例与 下述血球 计数仪 的样 本稀 释液 混合 , 用 BayerAdviaTM
120 Hematologysystem (Bayer, 美国 )进行血小 板计数 ,
将上 述 固 定 的 血液 经 过 1% PBS洗 涤 3 次 并 用 1 000 μL洗 涤 溶 液 (phosphate-buffered saline + 0.1% sodium azide+1% fatalbovineserum, 磷 酸 盐缓 冲液 +1%叠氮 化钠 +1%胎 牛血清 )重新 悬浮 , 混匀 。 为确保实验的 可靠性 , 实验分 4 组 , 分别为 hPLTs阳 性 对照组 、小鼠全血阳性对照组 、实验组和阴性对照组 (见 表 1)。
【关键词 】 流式细胞术 ;人血小板 ;小鼠全血 ;抗体
Flow CytometricMethodforHumanPlateletsCountinginMouseWholeBlood NIE Yong-mei☆, DeborahF. Dumont, LarryJ.Dumont.☆GuangzhouBloodCenter, Guangzhou510095, China. 【Abstract】 Objective Tosetupaflowcytometricmethodforhumanplatelets(hPLTs)countinginmousewhole blood(MWB).Methods MWBwascollectedviacardiacpuncturefromSCIDmicesacrificedwithCO2 andpreserved withEDTA.Humanplatelets(hPLTs)werepreparedfromapheresisplateletsandmixedwithMWB(V/V=1∶4).Subsequently, mixedspecimenwerefixedby1% coldparaformaldehyde, heldovernightat4℃, washedandresuspendedwith 1% PBS/1% FBS.Fourgroupswereset, includingtwopositivecontrolgroups, oneexperimentalgroupandoneisotype control.Plateletswerecountedbyflowcytometry.ConcentrationofhPLTswhichdesignedasexpectedhPLTswasmeasuredbyADVIA120 hematologysystem(Bayer).Theoriginalmixedspecimenwasdilutedby10, 100, 1 000, 10 000 and100 000 -foldwithMWB.Themixedbloodwasthendouble-stainedwithPE-CD41 andFITC-CD61 inTruCOUNTtubetomeasuredhPLTs, whichwasdesignedasmeasuredhPLTs.Correlationwasanalyzedbetweentheexpected andmeasuredhPLTs.Results Humanplateletsweresuccessfullycountedbyflowcytometry.Nofalsepositiveorfalse negativeresultwasobserved.GoodcorrelationbetweenexpectedandmeasuredhPLTswaspresentedrangingfrom3 000 to 150 000/μL.Conclusion hPLTscanbecountedbytheflowcytometicmethodrangingfrom 3 000 to150 000/μL.
避光室温放置 15 min, 流式细胞仪定性检测 hPLTs 和小鼠血小板 , 建立检测模板 , 观察实验结果 是否存在 假阳性或假阴性 。
表 1 实验分组 (n=4)
hPLTs阳 小鼠全血阳 实验组 阴性对照组
性对照组 性对照组
hPLTs(μL)
100
———
———
———
小鼠全血 (μL)
———
100
1 材料与方法
1.1 试剂 小 鼠 抗人 FITC-CD61 (cloneRUU-PL 7F12)抗体 (BectonDickinsonImmunocytometrySystems, SanJose, CA, 美国 );大鼠抗小鼠 PE- CD41 (Integrin αIIbchain, cloneR3 -34)抗体 (BDBiosciencesPharmingen, SanJose, CA, 美国 );大 鼠 PE-IgG1, κ同 型对 照 (cloneR3 -34)(BDBiosciencesPharmingen, SanJose, CA, 美 国 );小 鼠 FITC -Ig荧 光 抗 体 同 型 对 照 (cloneγ1, IgG1)(BDBiosciencesPharmingen, SanJose, CA, 美国 );多聚 甲醛 (Polysciences, Inc., Warrington, PA, 美国 );BDTruCOUNT试管 (BD Biosciences, BecktonDickinsonandcompany, SanJose, CA, 美国 )。 1.2 hPLTs 采用 Trima血细胞分 离机 (GambroBCT, Lakewood, CO, 美 国 )按 照 Dartmouth-Hitchcock医学
况 。当血小板采集 、制备 、贮存 、运 输等 方法 或条 件改 变时 , 应及时 对血小 板的复苏 状况及 功能作出 评价以 指导临床治疗的剂量和应用 [ 1] 。对血小板的 离体检测 往往不能真实 反映 血小板 在体 复苏状 况 。多年 来 , 放 射性同位素标记的方法被认为是评估在体血 小板复苏 和功能的金标 准 [ 2] 。有学 者采 用兔作 为动 物模 型 , 检 测人血小板 (hPLTs)的复苏 率和 存活 时间 [ 3 -4] 。 但是 如何避免免疫介导的血小板快速清除是不可 回避的难 题 。我们设 想 采用 SCID小 鼠 作为 动 物 模 型 [ 5] , 研 究 hPLTs在 SCID小鼠体内的复苏 状况 。为此 , 首 先需要 建立一种检测小鼠全血中 hPLTs的方法 。
———
———
hPLTs和小鼠全血混合 ———
———
100
100
血液 (V/V=1∶4)(μL)
小鼠抗人
5
5
5
———
FITC-CD61(μL)
大鼠抗小鼠 PE-CD41(μL)
10
10
10
———
小鼠 FITC-Ig荧光
0
———
———
5
抗体同型对照 (μL)
PE-IgG1, κ同型对照 (μL)
0
———
【Keywords】 flowcytometricmethod;humanplatelets;mousewholeblood;antibody
Байду номын сангаас
血小板的预防输注和治疗输注是一些血 小板减少 性疾病和 (或 )出血 患者 必需 的 治疗 手段 。 血小 板输 注的效果 取决 于血 小板 的 质量 以 及患 者 的病 生 理状
· 2050·
广东医学 2010年 8月 第 31卷第 16 期 GuangdongMedicalJournal Aug.2010, Vol.31, No.16
中心 血库相 关标准操 作规程 分离制备 单采血 小板 , 设 定产品量 为 3.0 ×1011 。设 置采 集过 程中 ACD-A抗 凝剂与血液比例为 1∶12, 采集容量 为 230 mL。单采血 小板存放在 22℃血小板振荡仪中保存不超过 5 d, 实验 开始前无菌分离 5 mLhPLTs备用 。 1.3 细 胞 计 数 采 用 BayerAdviaTM 120 Hematology system(Bayer, 美国 )进 行血 细胞 计数 。 hPLTs用 稀释 液 10倍稀释 , 保证血细胞检测浓度在仪器检 测的可靠 范围 。 1.4 动物 SCID小鼠 (三级 、雌性 ), 购自 TheJackson Laboratory, Windham, NH, 美国 。当小鼠年龄 达到或大 于 6周龄时 , 开 始实验 。实 验前 至少让 小鼠 在动 物中 心常规喂养适应 1周 。 1.5 流 式 细胞 术检 测 小鼠 全血 中混 入 的 hPLTs 用 CO2致死 SCID小鼠 。立即心脏穿刺 ,用带有 23 g针头的 5 mL注射器采集心脏全血 1 mL, 注入 2 mLEDTA抗凝 干燥真空管 , 反 复颠倒 混匀 试管中 血液 30 s。从 保存 期单采血小板袋中无菌分取 5 mL人单采血小板产品 。 在 2 mL的干 燥试管 中采用 1∶4的 比例混 合 hPLTs和 小 鼠全血 , 终容量为 100 μL, 并分别吸取 100 μLhPLTs 和小鼠全血置于 2只干燥试管中 。在上述血 液样本中 加入 1%多聚甲醛 1 000 μL固定血液样本 。 4℃过夜 。
聂咏梅 1 , DeborahF.Dumont2 , LarryJ.Dumont2