巨噬细胞的原代培养
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1 原理巨噬细胞属天然免疫细胞,具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能,是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周多用做原代培养,不易长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。目前,单核巨噬细胞株也有,比如RAW264.7,但价格比较贵,且保存也不方便。培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,目前以小鼠腹腔取材法最为实用,而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种,一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔,从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞,还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物(如牛血清,淀粉,糖原,脂多糖,矿物油,PRMI1640培养液等),这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗,但由于许多刺激物能激活巨噬细胞,而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物,有此得到的巨噬细胞培养用于培养时,细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中,影响细胞代谢,同时也不能很好的模拟体内环境,所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔,从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。我们选择6周龄的昆明小鼠是因为此年龄小鼠能产生最多的巨噬细胞。
2试验材料
昆明种小鼠10只体重约18g~25g(约6周龄)由广西医科大学动物实验中心提供
公鸡1只
PRMI1640培养基
新生小牛血清
HEPES
D-Hanks液
青霉素
链霉素
3试验仪器
无菌操作台手术刀解剖剪解剖镊止血钳5m注射器注射针,试管、培养瓶(12),12孔培养板(12)等。
二氧化碳培养箱
生物显微镜
高速冷冻离心机
低温冰箱
4实验步骤
4.1细胞培养液的制备及消毒制备方法:
将RPMI1640干粉一袋,HEPES4. 77g加入800m1三蒸水中,充分溶解后缓慢加入碳酸氢钠并逐步添加三蒸水,使溶液的pH值处于7. 2-7. 4之间,容积为1000m1。
鸡红细胞悬液制备:按无菌操作,自鸡翼下静脉采血,立即置入盛有五倍于取血量的1%肝素抗凝剂的三角烧瓶中,混匀,4℃冰箱内保存。使用前,以无菌生理盐水离心洗涤3次,前一次离心速度为1500r/min,离心5分钟,弃上清液和界面粒细胞层,最后连续离心2次(2000r/min,5分钟),用生理盐水配成1%鸡红细胞悬液备用。
培养液的无菌处理:
(1)将0.45微米和0.22微米的微孔滤膜浸过三蒸水,与zeiss过滤装置所需的清洁不锈钢筒、钢筛、胶管安装好,并高压灭菌。
(2)在净化室内,打开己消毒的zeiss抽滤器,将配制好的RPMI1640培养液进行过滤,开将过滤后的RPMI1640培养液分装,置入4℃冰箱中备用。
(3)将新生小牛血清200m1,在56℃水浴中灭活30分钟,按10%的浓度分别加入培养液中备用。
4.2巨噬细胞的获取
4.2.1 以颈椎脱臼法处死小鼠。
4.2.2 手提鼠尾将其全浸入75%乙醇中5min,倒立小鼠并向腹腔内注射预冷至4℃PRMI1640培养液5ml(注意针尖勿伤及内脏),仰卧平放并轻揉小鼠腹部2~3min,静置5~7min。
4.2.3 置小鼠于解剖台,用针头固定四肢,在腹股沟区作一横切口,撕裂皮肤以完全暴露出腹膜壁,但勿伤及腹膜壁。用75%酒精冲洗腹膜壁
4.2.4 用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动,并促使巨噬细胞从腹腔的浆膜表面释放,形成细胞悬液。
4.2.5用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
4.2.6小心拔出针头,把腹腔液注入预冷的培养瓶内。
4.2.7常规计数细胞。每只鼠可产生2~ 3×106/ml细胞,其中90%为巨噬细胞。取少量细胞悬液做Giemsa染色,在光镜下观察以鉴定是否是巨噬细胞。
4.3巨噬细胞的纯化
将细胞悬液于4℃、1000r/min离心10min,弃上清,放入培养瓶中,将培养瓶中细胞用4℃D-Hanks液洗2次,再用RPMI1640培养液于37℃、5% CO2 下培养2h,弃上清,用D-Hanks 液洗涤2次以洗去未贴壁细胞,贴壁的细胞则主要是巨噬细胞。然后换下培养用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养继续培养,此时将得到接近纯净的巨噬细胞。
4.4巨噬细胞的接种和培养
将纯化的巨噬细胞培养瓶快速冷冻至2℃,待细胞收缩后猛摇或吹打培养瓶,使巨噬细胞从瓶壁上脱落下来(Castranova et al.1996)。制成细胞悬液后,计数并调节细胞密度。以2×105 ~4×105个/cm2的密度接种细胞于12孔培养板内,加入适量RPMI1640培养液后置于37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养,每两天换一次液,以备用。
4.5巨噬细胞的鉴定
取培养板内任意一孔细胞用Gomori酸性磷酸酶(ACP)铅法染色,细胞呈阳性反应,ACP 活性颗粒呈棕黑色,则可以断断是巨噬细胞,光镜下计数200个细胞求出阳性率。
4.6巨噬细胞吞噬功能的检测:
在巨噬细胞接种和培养过程中,取适量巨噬细胞悬液放入培养瓶中,加入1%鸡红细胞悬液,37℃孵育2h,甲醇固定细胞涂片,吉姆萨染色,显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞情况。计数100个巨噬细胞,计算吞噬率和吞噬指数。
吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/100(所观察的巨噬细胞数) ×100%。
吞噬指数=100个巨噬细胞吞噬的鸡红细胞总数/100(所观察的巨噬细胞数)。