小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定

增强、 自由基生成增多， 最终导致神经损伤。严格、 稳定地控制血糖能够减 ［ ］ 叶 山东， １ 朱诸星． 临床 糖尿病学［ ． Ｍ］ 合肥 ： 安徽科学技术 出版社， 轻症状， 延缓 Ｄ Ｎ进 程， Ｐ 但许多血糖 控制较理 想 的糖尿 病患者仍 会发 ２ ０ ２ ２—２ ８ ０ ５： １ １．
医学信 息
临床 医学
Ｍ ＤＣ ＬＩＦ Ｒ Ａ ＩＮ Ｅ ＩＡ Ｏ Ｍ ＴＯ Ｎ Ｎ． ００ ｏ９ １ ２ ・ ４ ９・ ２０
与对照组 比较 ｖ Ｃ ｎｏ ｇ ｕ ， Ｐ＜ ．５ 卯 ＜ ．１ ｓ ｏｔ ｌｒ ｐ ’ ０ ０ ， ０ ０ 。 ｒ ｏ ３ 讨 论 ． 周围神经病变临床症状和神经传导速度 ， 治疗糖尿病周 围神经病变有明显 仅依靠 严格 血糖控制 并不能完 全防 止 Ｄ Ｎ发生 。糖 尿病患 者如果 长期 疗效， Ｐ 具有临床应用价值。 高血糖 将会导致 微血管 内皮病 变 ， 成神 经 缺血 、 氧 ， 而 引起 氧 化应 激 造 缺 从 参 考文献
Βιβλιοθήκη Baidu生 ＤＮ Ｐ。
［ ］ 奚雁． ２ 川芎嗉治疗糖尿病周 围神经病变４ ６例疗效观察． 中国基层 医 ａ 硫辛酸是一种强大的抗氧化剂， 一 作为丙酮酸脱氢酶和 ａ 一戊二酸脱 药 ， ０ ，：１ ４５ ２ ０７４ ４－ １． ０ 氢酶 一 线粒体酶系复合物的辅助因子起作用。ａ 一硫辛酸降低脂质过氧化， ［ ］ 章晓燕， ３ 刘芳， 伟平． 一 贾 ａ 硫辛酸与糖尿病周围神经病变［ ］ 国外医 Ｊ． 增加神经营养血管的血流量 ， 改善神经传导速度， 增加神经 Ｎ 一 一 Ｔ ａ Ｋ ＡＰ 学： 内分泌分册 ， ０ ， （ ）２２— ６ ． ２ ５２ ４ ： ０ ５ ６ ２３ 酶 活性及保 护血管 内皮功 能等 作用 机 制治疗 糖尿 病 周 围神经 病变 口Ｉ］ 可 ４， ［ ］ 凌丹芸， ４ 汤正义， 王卫庆． 抗氧化荆 ａ 一硫辛酸在糖屎病神经病变治疗 以预 防或治疗 高血糖诱 导 的神经 损 伤 ， 即使 在 血糖 失控 的 糖尿 病 患者 中也 中的作用［］ 世界Ｉ床药物，０５２ （２ ：２ — ２ ． Ｊ． 临 ２０ ，６ １ ）７ ６ ７８ 同样 发挥作用 ； 它的抗氧 化作用表 现在清 除 自由基 ， 合金 属离 子及再 生其 螯 ［ ］ 刘国良， ５ 张海燕， 曹翠平． 一硫辛酸保护 Ｂ细胞治疗神经病交等并发 ａ 他抗 氧化剂 （ 如谷胱 苷肽 、 维生素 Ｅ 维生素 ｃ等 ） ， 、 Ｊ 能显著 改善 Ｄ Ｎ的 临 Ｐ 症的多功能强效氧化应激抑制剂［ ］ 实用糖尿病杂志，０６ １ （ ） Ｊ． ２０ ，２ ６ ： 床症 状和神经 传导 速度 及 氧化 应 激 增加 和 抗氧 化 防 御能 力 下 降之 间 的不 ５ —５ ． ４ ８
【 摘要】 本文结合文献报道及本课题组实验研究， 对小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定进行了总结。同时， 由于前脂肪细胞的分化与肥胖病的形成有密 切 的关 系， 前脂肪 细胞的培养 具有很 重要 的研 究意 义。 故 【 关键词】 前脂肪细胞 ； 原代培养； 鉴定 ｄｊ ０ ３６／． ｓ．０６—１５ ．０ ００ ．２ ｏ： ．９９ｊｉ ｎ１０ ９９２ １．９ １４ １ ｓ 文章鳊 号：０６—１５ （００ ０ ２０ ０ １０ ９９ ２ １）一 ９— ４９— ２ 脂肪组织在体 内有在胞浆内积聚脂滴的成熟脂肪细胞和虽未在胞浆内 长基 本规律 的重要方 法 。现 在 ， 数实验 室 利用 培养 板采用 Ｍ Ｔ比色法 大多 Ｔ 积聚脂 滴但有 这种潜 能的前 脂肪 细胞 。成 熟 的脂 肪 细胞 呈 圆形 ， 脂 肪细 测 Ｏ 前 Ｄ值来进行 生长 曲线的绘 制 Ｊ 。 胞呈梭 形 ， 成熟 的脂 肪细胞 失去分裂 及增殖 的能力 ， 前脂肪 细胞 则有 分裂 而 １２２３ 油红 Ｏ染色 提 取 法测 定 细胞 内脂肪 含 量 的动 态变 化 ： 据 ．．． 根 和增殖 的能力 。 由于 前脂 肪细胞 是一类 具有 增殖 和 向脂 肪 细胞分 化能 力 的 Ｒｍｒ 等 方 法动态 测定 ， Ｏ ａ ｌｚ ｅ 以 Ｄ值 表示 ， 画出时 间 一Ｏ Ｄ值 曲线。 １２ ２４ 酶组织 化学 提取 法 测定 前脂 肪细 胞 分化 过程 中的标 志物 一 ． ．． 特异化 了的前体 细胞 ， 与肥胖 有着非 常密切 的关 系 ， 笔者 参照 多本参 考 书及 有关文 献报道 ， 在科研 中对 前脂 肪 细胞 的培 养及 鉴定 方法 进 行 了验证 和 比 甘 油磷酸脱 氢酶 （ Ｐ Ｈ） 量的 动态变化 ：Ｐ Ｈ是前脂 肪细胞分 化 中晚期 ＧＤ 含 ＧＤ 较， 结合本课 题组反 复的实践对 其进行 了总结 ， 进一步研 究奠定基 础 。 拟为 的标志， 根据 Ｓ ａ 等 的方法进行测定， Ｄ值表示， ｔｒ ｕｔ 以Ｏ 画出时问一Ｏ Ｄ值 由于小 鼠的取材 比较 方便 ， 且 关于 小 鼠前 脂肪 细胞 的培 养研 究碍 比 曲线 。 而 较多 ， 教本课题 组所采用 的前脂 肪细胞 均取 自小 鼠。 １３ 统 计方法 ： 数据 均以均数 ４标准差 （ ４ ） ． 实验 － ｘ ｓ 表示 ， － 采用 Ｓ Ｓ１． ＰＳ２ １材料与 方法 ． ０ 软件 进行统 计学分 析。单 因素方差分 析 、 组问差异 分析采用 ｔ 检验 。 １１ 实 验材 料 ： 验选 用体 重为 １ ２ ｇ的 ４周 龄 昆明 种雄 性小 鼠。 ２实验 结果与分 析 ． 实 ８— ２ ． 由成都 中医药大学 实验动 物 中心提 供 。动物 在 实验 前 适应 性 马养 １ ， Ｉ ｆ Ｉ 周 动 ２ １ 原 代培养小 鼠前 脂肪细胞 的增殖过 程 ： ． 物房温度 和湿度分别 维 持在 ２ ￣ ７％ 左 右。 实验 药 品主 要有 Ｆ２培 养 ０Ｃ和 ０ １ ２ １１ 小 鼠前脂 肪细胞 的形态 学观察 ： ．． 接种 消化分离 的细胞 １ 时基 ２小 基 、 酶（ ｒ ｓ ）小 牛血 清 、 甲基 亚砜 （ Ｍ Ｏ） 噻唑 蓝 （ Ｔ ） 油 红 Ｏ 本可 以贴壁 ， 胰 Ｔｙ ｉ 、 ｐｎ 二 ＤＳ 、 Ｍ ｒ、 贴壁后初 为小 圆形 ， 浆 比例较 大（ 图 １ 。培养过程 中始终 核／ 见 ） 等 。实验 主要使用仪 器设备包 括二氧 化碳 培养箱 、 超净 工作 台、 倒置相 差 显 应用含 高血清 （０ ２ ％小 牛血清 ） １ Ｆ２培养液 。２天即可 观察 到细胞 渐成梭形 ， 微镜 等 。 在 ３天左 右此梭形 细胞开始 增殖 ， １ ４— ０天加速 ， 聚集 性生长成放 射状 （ 图 见 １２ 实验方 法 ： ． ２ ， 融合后 生长减慢 。增殖 过程 中 的前脂 肪细 胞使 用油 红 Ｏ完全 不能 ） 细胞 １２ １ 小 鼠前脂 肪细胞 的取材 及原代 培养 ： 鼠前脂肪 细胞 的培 养 方 着色 。２周左右时部 分 细胞 内出现少量脂 滴 ， ．． 小 而这种 自然成 脂分 化的细胞 所 法。 参照杨建梅等所发表文献Ｌ ３及＜ 】 ］ 体外培养的原理与技术＞４、组织培 占 比例较 少。 － ＿ ‘ Ｊ 养技术及其在医学研究中的应用＞ 等书所载方法进行培养。 Ｊ １２ １１ 断脊髓处死雄性小鼠， ．．． 在培养室无菌条件下解剖小鼠， 剪取 小 鼠附睾附近 的脂肪组 织 ， 放人培养 皿 中的 Ｄ—Ｈ ｎｓ 中 ， 复洗 涤之 后 ， ａｋ 液 反 用剪刀 充分剪碎 ， 织移 人离心管 。 将组 １２ １２ 用吸管加 入适 量 ０２％ 胰酶在 ３℃条 件下 消化 （ ．．． ．５ ７ 消化 时间根 据具体情 况而定 ） 离心后 ， 沉底 的细胞 ， ， 收集 在离心 管内加入 适量 含 ２ ％小 ０ 牛血清 的 Ｆ２培养液 ， 吸管混 匀后 吸取 细 胞及 培 养液 经筛 网过滤 入 另一 １ 用 离心管 。 上清及 漂浮 的脂 肪组 织弃去不 用。 １２ １３ 再次离心后 ， 上清 ， ．．． 弃 沉积 的细胞 用 培养 液制 成细 胞悬 液 ， 接 种至培养 板或培养 瓶 中， 根据 实验 需要 高 调整 细 胞 的密 度。 在倒 置显 微 并 镜下观察细胞呈小圆形， ３ｑ ， 置 ７Ｃ 体积分数５ Ｏ 培养箱内培养。 ％Ｃ １２ １４ ４ 后 ， Ｐ Ｓ轻轻洗 去培养板 或培养 瓶 内未粘 附的 物质 ， ．．． ２ ｈ 用 Ｂ 并 更 换培养液 ， 要维持前 脂肪 细胞 的增 殖则 用含 高血 清 （０ 小 牛血 清 ） 如 ２％ 的 Ｆ ２培养 液 ， Ｉ 如实验 的 目的是 研究 前 脂 肪细 胞 的分 化则 可 更换 为 含低 血 清 （０ １％小牛血清） 或无血清的 Ｆ２培养液， １ 以后每２—３ 天换一次培养液。 １２２ 小 鼠前 脂肪细 胞 的鉴定 方法 ： ．． Ｉ２２ １ 细胞形 态学 观察 ： ． ．． 在倒 置显 微 镜 下 ， 态观 察胞 浆 内 出现 脂 动 肪颗 粒的程度 和快慢并 照相 。也可进行 油红 Ｏ染色并 照相 。 １２２ ２ ＭＩ 比色法及生 长曲线 的绘制 ： ． ．． ＇ Ｔ 细胞 生长 曲线是 观察 细胞 生
平衡 。 综 上所述 ， 一硫辛酸是 一 种强 有力 的 抗 氧化 剂 ， 够 明显改 善 糖 尿病 ａ 能
小鼠前脂肪细胞的原代培养及鉴定
陈筱 玲 陈
１ 成都市计 划生育指导所 ， ． 四川 成都
瑾 陈 洁
成 都 ６ ０ ７ １０ ５
６ ０ ３ ； ． 都 中医药大 学病 理教研室 ， １０ １２ 成 四川