脂肪细胞培养试剂

脂肪细胞培养所需试剂

1、低糖-DMEM、高糖DMEM/F12 (1∶1)各2袋

2、胎牛血清10%1瓶

3、胰蛋白酶0.25%

4、0.1%胶原酶Ⅰ

5、1μmol.L-1地塞米松、50μmol.L-1吲哚美辛（200）、0.5 mmol 3-异丁基-1-甲基黄

嘌呤（IBMX）和胰岛素(Sigma, USA)链霉素、青霉素、10μmol.L-1胰岛素

6、25ml培养瓶20个

7、6孔培养板8个、24孔板4个

8、PBS、酒精、无菌棉球、油性记号笔、封口膜

10、油红O

11、4%多聚甲醛、苏木精

眼科剪、眼科镊各2把、200目筛网2个、150目筛网2个、CO2培养箱、25ml 离心管15支、吸管40支（长嘴）、5ml塑料带盖离心管10支、37℃水温摇床、培养皿5个、50ml烧杯4个

所需配制的试剂

1、PBS液：

2、DMEM普通培养基：

3、成脂诱导培养基

4、0.075%胶原酶

5、0.5%胰蛋白酶

方法

1、MA 提纯及去分化

手术切除的腹部脂肪5ml, 冷冻，在2h内将脂肪组织送至实验室。PBS反复冲洗，在通用培养液剔除血管，剪碎。PBS 反复冲洗，置于 0.075% Ⅰ型胶原酶 37℃恒温摇床消化 45 min，期间反复震荡混匀，等量体积的完全培养基（高糖 DMEM、10%FBS、1% 青、链霉素）中和后，200 μm 尼龙网过滤，滤过物以离心半径 4 cm、180r/min离心10min，收集第2层脂肪细胞用200μm和150μm尼龙网过滤，去除其他细胞污染。

采用 Tholpady 等 [11] 方法收集人成熟脂肪细胞（mature adipocytes，MA）接种于 25 cm2培养瓶，每瓶（0.5 ～ 1.0）×105个细胞，瓶内充满完全培养基，将培养瓶翻转倒置于 37℃、5%CO2 培养箱内，使漂浮的脂肪细胞接触培养瓶底；48 h 后翻正培养瓶，吸出漂浮的 MA 悬液，接种于新的 25 cm2 培养瓶，进行新一轮天花板贴壁培养；48 h 后重复上一过程，以清除成纤维细胞状贴壁细胞；重复该过程至倒置相差显微镜下观察无成纤维细胞状细胞污染为止。吸出 MA悬液，接种于一倒置、密封、充满完全培养基的 25 cm2培养瓶内，放入孵箱培养 10 d 使 MA 贴壁牢固。10 d后翻正培养瓶，每 2 天更换完全培养基，

每天倒置相差显微镜下观察贴壁MA的变化。当MA完全脱去脂滴，呈长梭形，去分化为 DA，并且生长融合达 80% 时，即可传代。原代 DA 行油红 O 染色鉴定。

2、成脂分化：取第 4 代黏附贴壁的 DA 和 ADSCs，0.25% 胰蛋白酶消化后，调整细胞密度为1×105个/培养皿接种于培养皿中。在完全培养基下孵育24h，使细胞贴壁并伸展。24h后更换脂肪诱导DMEM培养基（含10%FBS、1%青、链霉素、1μmol/L 地塞米松、10μmol/L胰岛素、200μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/LIBMX）。以仅含10%FBS、1% 双抗的DMEM 完全培养基培养作为阴性对照。每3天更换1次培养基。

3、油红O染色形态学观察：成脂诱导14天后，弃原培养液，PBS 漂洗后，4%多聚甲醛固定20 min,, PBS洗2次，0.5%油红O染色30min,, PBS洗1次,显微镜下观察细胞内脂质。并于14d时计数任意10个培养皿内100倍视野下共500 个细胞中油红 O 染色阳性细胞数，计算细胞成脂分化率，公式为：油红 O 染色阳性细胞数 /500 × 100%

即无菌条件下,取猪脂肪组织,用Ⅰ型胶原酶消化,消化后的混和液过200目细胞筛;收集滤液,离心5 min (1 000r/min);收集上清液,加适量无血清培养基稀释洗涤,离心5 min (500 r/min);取500μl(4×105)上层离心液加入25 cm2培养瓶中(此培养瓶预先灌满含10%胎牛血清的DMEM/F12的培养基,在37℃、5%CO2培养箱中静止培养4~6 h,使培养瓶内保持均衡),移去瓶内所有气泡;盖紧瓶盖,颠倒放置培养瓶(凸面朝上)并使其保持水平,在37℃、5% CO2培养箱中培养.成熟脂肪细胞由于浮力小将漂浮贴壁到“天花板”面.