细胞培养试剂及操作流程
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养操作规范
细胞传代方法： 传代指针： 观察培养基颜色：当培养基的颜色由红色渐渐褪成橙黄色，颜色清亮，无杂质，无浑浊 显微镜观察细胞生长状态：细胞生长状态良好，铺满培养瓶80%以上，细胞透亮，形态清晰，间隙无杂质，确认无细菌真菌污染
传代方法：
将新的培养皿、吸管、废液缸放入工作台开启细胞培养房及工作台紫外消毒20分钟， 开启恒温水浴箱，培养液、消化液预热 关毕紫外灯，开灯，通气，点燃酒精灯 吸弃培养基，PBS清洗两次 加入2ml消化液晃动培养瓶使消化液覆盖整个细胞界面后吸弃培养液 肉眼观察细胞培养瓶底部出现一层云雾状，轻轻敲打底部有块状物脱落，显微镜下观察看到细胞间隙变大，细胞回缩变圆少量漂浮后加入10ml含血清培养基终止消化，吹打管吹打数次 将细胞悬液吸至离心管，1000rpm离心5分钟 吸弃上清，加入PBS吹打混匀， 1000rpm再次离心5分钟 吸弃上清，加入新鲜培养基，吹打混匀，按比例接种到细胞培养瓶
细胞消化时间的控制：Leabharlann 细胞冻存：胰酶消化
细胞计数
贰
壹
叁
细胞计数
细胞计数板计数室构造 数红色边框标记的四个方格内的细胞总数（如有压线则计上不计下，计左不计右） 细胞数/ml=（4个大方格细胞总数/4）×104×稀释倍数
四、细胞培养注意事项
实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射20-30分钟灭菌，以75 %酒精 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 %酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养操作流程
细胞培养操作流程细胞培养是一种人工环境中扩增和维持活细胞的技术。
它对于研究细胞生物学、药物筛选和治疗等方面有着重要的应用。
下面是一个常见的细胞培养操作流程，具体步骤如下：1.准备培养器具和试剂：首先需要准备好培养器具和所需试剂，包括培养皿、离心管、培养基、培养液、胶原蛋白贴士等。
2.细胞的分离和收获：将待培养的组织或细胞样品取出，用适当的方法将细胞分离开来。
可以使用酶消化、机械切割或筛选等方法。
分离好的细胞通过离心将细胞沉淀，将上清液吸掉，得到细胞沉淀。
3.细胞计数和浓度调整：使用细胞计数仪或血球计数室等工具，将细胞计数。
根据需要可以进行浓度调整，使其适合在培养器具中的扩增。
4.细胞的接种和培养：将得到的细胞沉淀重新悬浮于培养基中，并将其放置于培养皿中。
确定适宜的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
定期观察细胞的生长情况，并更换培养基，以维持细胞的健康生长。
5.细胞的传代：当细胞在培养皿中达到一定密度时，需要进行传代，以防止细胞群体过于致密导致细胞生长受限。
传代前需先将细胞沉淀，并用如十倍的细胞培养基将其重新悬浮。
将悬浮的细胞分装至新的培养皿中，培养基的更换和细胞的观察也是相同的。
6.试验处理：在细胞培养过程中，可能需要对细胞进行各种试验处理，如药物处理、感染等。
根据需要，将试验处理物加入培养基中，确保细胞接触到试剂，并保持正常生长。
7.细胞固定和染色：进行一些试验或者观察时，对细胞进行固定和染色可以帮助观察或者分析细胞的形态、细胞器分布等。
选择适合的固定和染色方法，将细胞固定在培养皿中，并使用染色剂染色。
8.细胞的收集和保存：在实验完毕后，可以用适当的方法将培养皿中的细胞收集起来。
例如，轻轻洗涤细胞，然后加入适当的缓冲液，用吸管吸出，或者使用离心机离心沉淀。
收集好的细胞可以用于下一步的实验，或者进行冷冻保存。
9.培养器具的清洁和消毒：一旦细胞收集完毕，需要对使用过的培养器具进行清洗和消毒，以防止细菌、真菌、病毒等的传播。
细胞培养液配制操作规程
细胞培养液配制操作规程
试剂和器材准备：
1. 用三角瓶装1L 超纯水，放入搅拌子，盖上铝箔纸，121摄氏度高压灭菌30分钟，冷却过夜。
2. 过滤器装好滤膜后用报纸包装好，121摄氏度高压灭菌30分钟。
3. 装培养液的试剂瓶瓶口用铝箔纸包好，140摄氏度烘烤3小时。
配制过程：
1. 将盛有灭菌超纯水的三角瓶放到磁力搅拌器上，搅拌速度以液面恰能产生漩涡为宜。
2. 打开干粉培养液的包装，将干粉慢慢加入容器，边加边搅拌
3. 往包装袋内加入适量的超纯水使残留的培养液粉末溶解并倾倒入三角瓶内，如此清洗数遍
4. 添加NaHCO3。
RPMI1640添加2.0g NaHCO3，DMEM添加3.7g NaHCO3。
5.搅拌约2小时待干粉完全溶解。
6. 用1N NaOH 和1N HCl调节培养液pH在
7.1～7.2，调节好pH后盖紧容器。
7. 加入5 mL 200×的PS双抗，搅拌均匀。
8. 0.22um微孔滤膜过虑除菌，分装到试剂瓶中，盖好瓶盖密封，4摄氏度保存。
使用前添加血清，使血清含量为10％。
未加血清的培养液可在4摄氏度保存8个月，加血清后应在1个月内用完。
9. 检验。
取过滤后的培养液3～5mL，置于无菌的35mm培养皿中，放入培养箱中培养两天，检查是否有长细菌。
注：
1. 过滤完毕后应及时把过滤器和试剂瓶清洗干净。
清洗过程：自来水冲洗，蒸馏水洗3遍，超纯水洗一遍，沥干，烘干
2. 本操作规程以配制1L为例，配制量多时各组分应等比例增加。
1。
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640培养液。
2、10%FBS DMEF/12培养液。
3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。
4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。
5、胰酶6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为16407、真核抗生素：G418: 50mg/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/mlT47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/mlMDA-MB-231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。
（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。
（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。
（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。
2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。
cck8具体操作流程
cck8具体操作流程
以下是使用CCK8试剂盒进行细胞活力检测的步骤：
1. 准备细胞：取生长状态良好的细胞制备成一定浓度的细胞悬液。
如果是贴壁细胞，需要37℃培养箱进行预培养2-6小时等细胞贴壁后再开展实验，
如果是悬浮细胞，不需要预培养。
2. 制备培养基：在无酚红DMEM高糖培养基中加入双抗、谷氨酰胺和血清。
3. 准备96孔板：根据实验需求，准备适当数量的96孔板。
每孔加入
100ul细胞悬液，通常细胞增殖实验每孔加入2×10³个/100ul 细胞，细胞
毒性实验每孔加入5×10³个细胞/100ul。
如果是贴壁细胞，可以直接在96
孔板中进行实验，如果是悬浮细胞，需要离心后取沉淀进行实验。
4. 加药处理：根据实验需求，在各组细胞中加入不同浓度的药物或对照组不加药。
5. 孵育：将96孔板放入37℃培养箱中孵育一定时间，通常为24小时。
6. 检测：在检测前，将CCK8试剂加入96孔板中，轻轻混匀后继续孵育1-4小时。
然后使用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度，记录数据并计算
细胞活力。
以上步骤仅供参考，具体操作请根据实验需求和实际情况进行调整。
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本
细胞培养相关常用液体配制标准SOP操作规程样本（一）胰酶的配制：（浓度为1‰，1L）1、认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2、称取牛胰蛋白酶1.0g；EDTA 2 g；3、用超纯水溶解；4、磁力搅拌器搅拌至胰酶完全溶解，溶液变得澄清；5、超纯水定容至1L；6、不锈钢滤器加0.22um滤纸两张高温灭菌后，在超净工作台过滤；7、在血清瓶中加入少量滤好的胰酶，置于细胞培养箱中检测是否染菌，其余置于4℃待用；8、过滤后洗净滤器再次灭菌，避免残留的胰酶降解蛋白。
（二）DMEM配制：1、所需试剂及材料：试剂：DMEM干粉（GIBCO 10L）、超纯水（Milli-Q）、Na2CO3 （Sigma）材料：10L玻璃瓶、500ml盐水瓶（灭菌）、0.22um滤膜、滤器（事先放好两层滤膜并高压灭菌）、磁力搅拌器大号搅拌子蠕动泵胶塞2、操作步骤：(1)10L玻璃瓶洗涤，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
(2)在10L玻璃瓶中加入超纯水9.5L，将DMEM干粉倒入，在磁力搅拌器上搅拌溶解。
(3)按照3.7g/L 加入Na2CO3 。
(4)调节pH值至7.2~7.4。
(5)过滤分装，并注明名称及配制日期。
此过程注意无菌操作！(6)最后用血清瓶取10ml左右置于细胞培养箱中检测是否染菌。
(7)清洗滤器，10L玻璃瓶，软管，将所有实验器具归位。
（三）1640、MEM培养基的配制同上，Na2CO3的用量见包装说明（四）细胞间100×双抗（青霉素、链霉素）的配制青霉素及链霉素配制的终浓度为1万单位/毫升。
配制的步骤以400ml为例：1.认真清洗配制容器，自来水20遍，去离子水5遍，超纯水润洗3遍。
2.准备5瓶青霉素（80万单位/瓶）、4瓶链霉素（100万单位/瓶）。
3.加入1-2ml细胞间专用PBS进入青霉素、链霉素的瓶子内，浸泡后吹吸数次至全部溶解，溶解后的液体吸入配制容器内。
细胞培养标准操作规程
细胞培养标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事细胞培养的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂细胞培养液、血清、胰酶、PBS或Hank`s液
2、规程：
2.1 细胞株的培养
2.1.1 获取所需细胞株（一般细胞株的运送是把细胞放在培养瓶中，干冰保存运输的）
2.1.2 得到所需细胞株后弃掉多余的培养液，放到5%的CO2培养箱中培养
2.1.3 每天至少观察一次，待细胞长满整个培养瓶的80%时传代
2.1.4 倒掉培养液，用1mlPBS 漂洗细胞一次，加入500ul胰酶消化，消化时间视细胞种类、胰酶浓度和消化温度而定，一般3-5min
2.1.5 终止消化，向上一步消化液中加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.1.6 吹打，用吸管轻轻吹打至细胞全部脱落，注意尽量减少气泡产生
2.1.7 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.1.8 将细胞接种到另外的培养瓶中
2.1.9 换液，根据细胞生长情况，间隔一定时间半量换液。
2.2 原代细胞培养
2.2.1 原代细胞的获取无菌条件下取动物组织剪碎
2.2.2 向剪碎的动物组织加入适宜浓度的胰酶，消化，时间因细胞种类和胰酶浓度而定
2.2.3 终止消化，向上一步消化叶重加入含10%血清的培养液，一般5ml
2.2.4 吹打将终止消化后的组织转入一培养皿中，加入一定量的培养液轻轻吹打数次，静置5-10分钟
2.2.5 细胞计数，取少量液体于细胞计数板上，确定接种密度
2.2.6 将细胞接种到培养瓶或培养板中，放入5%的CO2培养箱中培养。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、2设施检查:确认空调、传递窗工作状态完好。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。
1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：DMSO18ml+胎牛血清2ml。
依次比例酌量配置。
超净工作台常规配置移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，保种管所需试剂：gibco高糖培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，苯扎溴氨，75%酒精……实验前准备：所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。
首次传代前细胞的复苏，首先用一大烧杯盛满37℃的温水放于液氮罐旁边，待细胞株取出后留上端1/3于37℃水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。
若种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。
这一过程可在超净工作台外操作。
实验步骤一、原代细胞的培养1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。
2.将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。
特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
3.取1个高压后的新培养瓶，瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次分别放于酒精灯两侧，把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边，取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液，悬空移入培养瓶内。
4.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取4ml培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3次后拧紧平放，在瓶身做好实验标记。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
细胞培养操作步骤及注意事项
细胞培养操作步骤及注意事项细胞培养操作步骤1. 准备培养基和培养器具：选择适合细胞生长的培养基，如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium），RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）等。
准备培养器具，如细胞培养瓶、组织培养皿、离心管等。
2. 培养器具的消毒：将培养器具放入70%的乙醇或漂白水中浸泡约15-30分钟，然后用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）清洗3次。
将培养器具在100摄氏度的烘箱中高温烘干或使用紫外线灯照射15-30分钟。
3. 细胞传代：将细胞从旧的培养瓶中移至新的培养瓶中，以防止细胞过度增殖和细胞衰老。
首先将培养瓶中的培养基抽吸掉，然后用PBS洗涤细胞2次，最后加入适量的胰酶消化细胞，使其与培养基充分接触，放置一段时间，观察细胞的离培情况，离心沉积细胞，弃去上清液，加入新的培养基。
4. 细胞培养条件控制：维持培养环境的适宜条件，包括温度、湿度、CO2浓度和培养基的pH值等。
通常细胞在37摄氏度、5%的CO2和95%湿度下生长。
定期检查培养器的培养基水平，保持培养基的适当量。
5. 细胞观察和记录：使用显微镜观察细胞的形态和数量，记录细胞培养的过程和实验结果。
注意控制细胞的密度，防止过度密集或过度稀疏。
6. 细胞分化和实验处理：根据需要，可以进行细胞的分化处理或实验处理，如加入药物、生化试剂等。
在处理时要注意药物的浓度、处理时间和处理温度等。
7. 细胞冻存：当需要长期保留细胞时，可以进行细胞冻存。
将细胞与冻存液混合，分装入冻存管中，置于液氮中冻存，以备将来使用。
细胞培养注意事项- 细胞培养实验应在无菌条件下进行，避免污染。
- 培养器具应事先消毒处理，防止细菌、真菌和病毒的污染。
- 培养基的配制要准确无误，严格按照操作手册或厂家提供的方法进行。
- 培养过程中要保持培养器的密闭性，以确保适宜的气体交换和温度控制。
细胞培养标准操作程序
细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：培养液、PBS、胰蛋白酶的配制1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后PH值会升高～，故配时调PH 至左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2OKH2PO4（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2）Na2HPO4*H2O 则Na2HPO4*12 H2O需（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉EDTA（乙二胺四乙酸二钠）NaClKCl` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML NaHCO3Glucose(葡萄糖)酚红（1）配出来的PH值为，在PH值～范围内，故不需调PH值。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞培养_实验报告
一、实验目的1. 熟悉细胞培养的基本操作流程。
2. 掌握原代细胞培养和传代细胞培养的方法。
3. 了解细胞培养在生物学研究中的应用。
二、实验原理细胞培养是指将生物体中的组织或细胞取出，在人工条件下模拟其生理环境，使其生存、生长、繁殖或传代的技术。
细胞培养技术具有操作简便、可控性强、成本低等优点，在生物学、医学、药物研发等领域具有广泛的应用。
三、实验材料1. 仪器：显微镜、培养皿、移液枪、离心机、超净工作台等。
2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、抗生素等。
3. 组织：动物组织（如小白鼠胚胎组织）。
四、实验方法1. 原代细胞培养（1）取动物组织，用无菌手术刀切成小块。
（2）将组织块放入含有胰蛋白酶的离心管中，37℃水浴消化30分钟。
（3）消化结束后，用移液枪吹打组织块，使细胞分散。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。
（5）加入DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿中。
（6）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。
2. 传代细胞培养（1）待原代细胞生长到一定密度后，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）加入胎牛血清终止消化，用离心机离心去上清液。
（3）加入DMEM培养基重悬细胞，按1:2的比例接种于新的培养皿中。
（4）将培养皿放入细胞培养箱中培养，观察细胞生长情况。
五、实验结果1. 原代细胞培养：细胞呈圆形，排列紧密，生长较快。
2. 传代细胞培养：细胞形态与原代细胞相似，生长速度略慢。
六、实验讨论1. 细胞培养过程中，无菌操作至关重要，避免细菌、真菌等污染。
2. 培养基的成分和pH值对细胞生长有重要影响，需严格控制。
3. 细胞培养技术广泛应用于生物学、医学、药物研发等领域，具有广阔的应用前景。
七、实验总结通过本次实验，我们掌握了细胞培养的基本操作流程，了解了细胞培养在生物学研究中的应用。
在实验过程中，我们体会到无菌操作的重要性，以及培养基成分和pH值对细胞生长的影响。
细胞培养标准流程
细胞间基本规定每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min)。
显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。
超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。
带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾.细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。
基培需写上开启时间。
细胞培养标准流程1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例）Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。
所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。
步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌2。
弃旧：细胞生长融合达90％时，吸出培养基3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1—2次4。
消化：加入1ml 0。
25％胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min，，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。
5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10％FBS的完全培养基终止消化。
6。
吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁,呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿.再加入10ml全培。
（大盘10ml全培，小盘6ml全培）（细胞生长快留30％，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA）7。
培养:每天或每两天更换一次培养基,直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况.PS：六孔板一般加培养基2300μL/孔。
2、细胞转染TurboFect 转染试剂转染(用于质粒的转染,说明书附后）细胞接板24 h 后转染。
转染时细胞密度需达到70-90%。
以6 孔板为例，转染前细胞先换液,加4ml全培。
取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL,混匀(转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是生物学实验中常用的一项技术。
通过细胞培养，可以研究细胞的生理活动、疾病发生机制以及药物的毒性和疗效等。
本文将为大家介绍细胞培养的基本操作步骤，帮助读者更好地进行细胞培养实验。
一、实验前准备1.1 材料准备首先，准备好所需的实验材料和试剂。
主要包括细胞培养基、培养皿、移液器、离心管、冰桶、显微镜和相应的培养器具等。
1.2 密切关注无菌操作细胞培养需要在严格无菌条件下进行，以避免细胞受到污染而影响实验结果。
实验前要正确佩戴防护服和洗手，确保操作台面、培养皿和使用的器械都经过高温高压消毒。
二、细胞的处理2.1 细胞种植将培养基加热至37摄氏度，并取出暖培养皿备用。
从细胞库中取出所需细胞的冻存管，在冰上迅速解冻，并将细胞转移到暖培养皿中。
注意，细胞数量应适量，不宜过多，否则会影响细胞的生长和适应。
2.2 细胞传代当细胞在培养皿中达到一定的密度后，需要进行传代操作，以保证细胞的健康和活力。
传代前，首先用生理盐水或PBS洗净细胞，并加入胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养皿表面脱落。
然后，将细胞转移到新的培养皿中，并加入新鲜的培养基。
三、细胞培养条件的控制3.1 细胞培养环境将细胞培养皿置于37摄氏度的培养箱内，以提供适宜的温度和湿度。
此外，还要保持适当的氧气和二氧化碳浓度，可以通过培养箱上的气体调节装置进行控制。
3.2 培养基的更新培养基中含有丰富的营养物质，但随着时间的推移，这些营养物质会逐渐降解消耗，影响细胞的生长。
因此，需要按照一定的时间间隔进行培养基的更新，保持细胞在新鲜和富有营养的环境中。
四、细胞观察与处理4.1 细胞观察使用相差显微镜或荧光显微镜观察细胞的形态、数量和状态。
可以观察细胞的生长情况、染色效果以及细胞内特定蛋白的表达等。
4.2 细胞处理根据实验需求，可以对培养的细胞进行不同的处理。
例如，给细胞添加特定的药物、激素或化合物，刺激细胞产生某种反应或模拟特定的生理环境等。
cart细胞培养标准操作流程
Car-T细胞培养标准操作流程1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3 责任人：实验员人、临床相关人员。
4 内容4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
4.3环境：4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百级生物安全柜内进行。
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
4.4.2操作前准备4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安全柜运行稳定。
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
4.4.3 分离单个核细胞（PBMC）：4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋内外周血转入50ml离心管中。
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。
方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
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实验规范化流程
一、细胞培养所需
1、10%FBS 1640培养液。
2、10%FBS DMEF/12培养液。
3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。
4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。
5、胰酶
6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为1640
7、真核抗生素：
G418: 50mg/ml
MDA-MB-231 800ug/ml
MCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/ml
T47D 400ug/ml)
嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、
MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/ml
MDA-MB-231 5ug/ml
潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/ml
MDA-MB-231 800ug/ml
MCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）
环丙沙星
左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）
9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）
10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）
一、细胞培养相关技术
1、细胞复苏
准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：
（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。
（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。
（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。
（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。
2、细胞传代
准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管
实验流程：
（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。
（2）加入适量胰酶（一般25cm2培养瓶加0.5ml，10cmdish加1ml），并且晃动几下使胰酶在平底分布均匀，放入37℃培养箱孵育。
（3）适当时间后（231、SK-BR3用1min，MCF-7、T47D用2min，依据细胞不同时间不同）将培养瓶从培养箱拿出来，显微镜下观察细胞形态变圆、粘附性变弱后加入培养液终止酶反应。
（4）用培养液冲洗瓶底，然后吹打细胞悬液使其均匀单个分布。
（5）将悬液1000r离心5min后重悬，安装实际需要将悬液平分到培养瓶内，一般按1:3传代较好。
3、细胞冻存
准备：培养液、胰酶、15ml离心管、滴管、冻存管、冻存盒
试验流程：
（1）将已经长满的细胞取出，弃去培养液后加入适量胰酶，放入37℃孵育适当时间后，观察细胞变化。
（2）用培养液终止反应后，吹匀，将悬液转移到15ml离心管内。
（3）以1000r的速度离心5min
（4）弃去上清，加入1-1.5ml冻存液，重悬，加入冻存管内（冻存管注意做好标记）。
（5）将冻存管放入冻存盒内。
盖好，放入-80℃冰箱冻存。
4、细胞计数
准备：胰酶、培养液、滴管、15ml离心管、计数板、移液器
实验流程：
（1）取对数生长期细胞，用适量胰酶消化后，1000r离心5min，重悬。
（2）用微量移液器取10μL悬液，沿计数板一侧缓慢加入，确保悬液均匀充满计数池。
（3）显微镜下计数四角大方格内的细胞数目，求平均值。
（4）根据公式n=四角大方格内细胞数/4 *104 （个）/ml
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