胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

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胰岛细胞药物筛选模型的建立_小鼠胰岛的原代培养_丘渭遥

文章编号： 1006－6233（ 2011） 12－1654－04
胰岛细胞药物筛选模型的建立—小鼠胰岛的原代培养
丘渭遥
（深圳大学医学院生化中心，广东深圳 518057）
摘要：目的：用胰岛细胞作为糖尿病新药的细胞筛选模型需保持其结构完整、生理功能稳定和
足够长的存活时间，为此本文对小鼠胰岛分离纯化和培养方法进行优化。方法：用胶原酶、透明质酸酶和 DNA 酶消化，Ficoll 400 密度梯度离心法分离胰岛； DTZ 染色法和台盼兰染色测定胰岛的纯度和
参考文献：［1］姜泗长，方耀云．耳鼻咽喉科临床误诊误治及处理［M］．
昆明：云南科技出版社，2000． 128－129．［2］中华医学会耳鼻咽喉科学分会、中华耳鼻咽喉科杂志编
辑委员会．慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准［J］．中华耳鼻咽喉科杂志，1998，33 （ 3）： 134．［3］江满杰，李泽卿，王秋萍．南京城区儿童慢性鼻窦炎流行病学调查［J］．医学研究生学报，2006，19（ 1）： 613．［4］陈和平，李春林，樊宏．鼻内镜手术治疗慢性鼻窦炎鼻息肉［J］．中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，15 （ 4）： 842 － 843．［5］李轶． 38 例内窥镜鼻窦手术临床观察和分析［J］．中国实用医药，2008，3（ 20）： 288－290．［6］尹秋鸿，刘虹，李长国，等．鼻内镜手术治疗鼻窦炎鼻息肉 87 例分析［J］．中国内镜杂志，2006，12 （ 1）： 456－458．
Ficoll 液 1mL，然后依次沿管壁慢慢分层加入 23% 、 20% 和 11% 的 Ficoll 液各 1mL。4℃ 400rpm 离心 4min，继之 2000rpm 离心 12min。收集位于第二层面的胰岛加入 Hanks 液 600rpm，1min 离心清洗。之后加入 RPMI1640 完全培养基（含 10% FBS） 37℃ 5% 二氧化碳培养。培养 24h 后，成纤维细胞均已贴壁，再次收集胰岛并反复洗涤离心，获得完整单离的纯净胰岛。 1． 4 胰岛的培养 1． 4． 1 培养基质的预处理方法： Poly －L －Lys 的处理方法： Poly－L－Lys 均匀涂附培养板壁面，置于 37℃ ，0． 5h，用去离子水洗涤，晾干即可。明胶和 laminim 的处理方法：将相应培养基质溶液均匀涂附培养板壁面，置于 4℃ 过夜，用前再用少许培养基冲洗一次。胶原处理方法：用吸管吸少许胶原涂于灭菌培养瓶 /孔板内壁培养面上；向培养瓶内通以氨气后封上瓶盖，作用 30min，待胶原凝固，然后用无菌生理盐水冲洗、凉干，即可使用。 1． 4． 2 胰岛的培养：用以上方法处理的培养板培养胰岛。 1． 5 胰岛生物活性的测定 1． 5． 1 胰岛数目和活力的测定： DTZ 染色计算收获胰岛数目。台盼兰染色计算细胞活力，参照 Freshneiy 方法［6］。 1． 5． 2 培养上清中胰岛素含量的测定：每天取培养孔内全部上清用胰岛素放射免疫试剂盒检测胰岛素含量，同时补充等量的新鲜培养基。以接种后培养第 1 天内的胰岛素分泌良为基准，胰岛素的分泌水平表达为同一培养孔后来检测的胰岛素含量与第 1 天的胰岛素分泌量相除所得到的比值。 2 结果与讨论 2． 1 不同酶体系对小鼠胰岛分离效果的影响：采用不同组分配比的酶液分别对小鼠胰腺组织进行消化，结果如表 1。

糖尿病小鼠模型的制备

、糖尿病的概念及分类糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。

目前我国己成为世界第一糖尿病大国。

糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病（多原因引起的综合症）。

糖尿病分为：i型糖尿病、n型糖尿病和其它特异性糖尿病。

I型糖尿病即胰岛B细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。

本型病因及发病是由于胰岛B细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。

n型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。

以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。

其它特异性糖尿病包括，B细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。

（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。

人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。

为了提高人们的生活质量，近几年对糖尿病的研究日益加深）二、糖尿病模型的建立近年来，随着国内外对糖尿病治疗药物研究的深入开展，建立比较理想的糖尿病动物模型显得尤为重要。

目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。

自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。

实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛B细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。

实验性糖尿病动物模型的建立主要有6种方法：胰腺切除法致糖尿病、免疫性糖尿病、激素性糖尿病、下丘脑损伤性糖尿病、化学性糖尿病、病毒性糖尿病。

建立基因敲除小鼠颈动脉粥样硬化模型PPT课件

2020年10月2日
5
A 1x2-mm strip of filter paper saturated with 10% FeCl3 solution was
applied to the adventitial surface of the surgically exposed carotid artery
2020年10月2日
7
neointima formation after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
carotid artery stained with H&E
noninjured
2020年10月2日
ELK
injured
8
EK
neointima formation after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks
2020年10月2日
1
Candidate genes in lipoprotein metabolism
2020年10月2日
Lusis et al Circulation. 20024
Lipoprotein Lipase in the Arterial Wall
2020年10月2日
3
Pentikäinen et al Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2002
noninjured
2020年10月2日
ELK
injured
12
EK
lipid deposit after carotid artery injury by FeCl3 for 8 weeks

糖尿病动物模型建立

糖尿病动物模型建立糖尿病是一种常见的慢性代谢性疾病，严重影响着人类的健康。

为了深入研究糖尿病的发病机制、预防和治疗方法，建立可靠的糖尿病动物模型至关重要。

糖尿病动物模型的建立方法多种多样，主要包括化学药物诱导、手术诱导、自发性糖尿病动物模型以及基因工程技术诱导等。

化学药物诱导是较为常用的方法之一。

其中，链脲佐菌素（STZ）是常用的诱导剂。

STZ 能够选择性地破坏胰岛β细胞，导致胰岛素分泌不足，从而引发糖尿病。

在使用 STZ 诱导糖尿病模型时，剂量和给药途径是关键因素。

一般来说，小鼠的常用剂量较低，大鼠的剂量相对较高。

给药途径可以是腹腔注射或静脉注射。

此外，还有一些其他的化学药物，如四氧嘧啶，也可用于诱导糖尿病模型，但相对而言，STZ 更为常用。

手术诱导糖尿病模型主要是通过胰腺切除或胰岛切除的方式。

例如，切除大部分胰腺组织会使胰岛素分泌显著减少，从而导致糖尿病的发生。

这种方法的优点是模型的致病机制明确，但手术操作复杂，对动物的创伤较大，术后护理要求高，且模型的稳定性和重复性可能受到一定影响。

自发性糖尿病动物模型则是指某些特定的动物品系在自然状态下自发出现糖尿病症状。

例如，db/db 小鼠和 ob/ob 小鼠就是常见的自发性糖尿病模型。

这些小鼠由于基因突变，导致胰岛素抵抗或胰岛素分泌缺陷，从而自然发展为糖尿病。

自发性糖尿病动物模型的优点是更接近人类糖尿病的自然病程，但缺点是价格昂贵，饲养条件要求高。

基因工程技术诱导的糖尿病动物模型是近年来发展起来的新技术。

通过基因编辑技术，如敲除或过表达某些与糖尿病相关的基因，可以构建出特定类型的糖尿病模型。

这种方法可以精准地模拟特定的糖尿病发病机制，但技术难度较大，成本较高。

在建立糖尿病动物模型时，需要考虑多种因素。

首先是动物的选择。

常用的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠等。

小鼠和大鼠因其繁殖快、饲养成本低、遗传背景清晰等优点，被广泛应用。

但不同品系的动物对糖尿病的易感性可能不同，因此需要根据研究目的选择合适的品系。

胰岛β细胞Metrnl_基因敲除小鼠的鉴定及初步表型分析

胰岛β细胞Metrnl 基因敲除小鼠的鉴定及初步表型分析*扈腊英，黄亚莉，刘露，王贵芳，常雪冰，宋铃榆，周宇霞△，郭兵△（贵州医科大学病理生理学教研室，贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室，贵州贵阳 550025）［摘要］目的：基于Cre -LoxP 重组酶系统，构建胰岛β细胞Metrnl 基因敲除小鼠（Metrnl -KO ），为进一步探究Metrnl 基因在糖尿病疾病中的发病机制提供动物模型。

方法：将雌雄基因型均为Metrnl floxp/+的小鼠合笼杂交，筛选出基因型为Metrnl floxp/floxp 的小鼠，将该基因型小鼠与胰岛β细胞特异性表达Cre 重组酶（Ins -2）工具鼠进行杂交繁育，获得基因型为Metrnl floxp/+；Cre+的小鼠；再将Metrnl floxp/+；Cre+小鼠与Metrnl floxp/floxp 小鼠杂交获得Metrnl floxp/floxp ；Cre+小鼠，基因型为Metrnl floxp/floxp ；Cre+的小鼠即为目的鼠。

采用RT -qPCR 检测Metrnl 和胰岛素（Ins -1和Ins -2）的mRNA 水平；免疫组化和免疫荧光染色观察胰岛组织Metrnl 和胰岛素的蛋白表达情况；记录小鼠体重，同时测定小鼠糖耐量和胰岛素耐量。

结果：RT -qPCR 和免疫组化结果均显示Metrnl -KO 小鼠胰岛组织中Metrnl 的mRNA 和蛋白水平显著低于对照鼠（P <0.01）；Metrnl -KO 小鼠与对照鼠相比，体重无明显变化，但糖耐量受损且对胰岛素敏感性降低（P <0.05）；RT -qPCR 结果显示胰岛组织中Ins -1和Ins -2的mRNA 水平显著下调（P <0.01），且免疫荧光结果提示胰岛组织中胰岛素表达低于对照鼠（P <0.05）；葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验结果显示，Metrnl 敲除可引起小鼠胰岛素分泌减少（P <0.05）。

基因敲除小鼠技术共9页word资料

转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。

尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。

二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies 于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。

同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

小鼠肝脏胰岛素受体的特异性敲除降低极低密度脂蛋白中三酰甘油分泌的研究

ｄｎｉｐｐｏｉ（ＬＬａｄｔｍｎｄｂｊｃｏｆｒｏ１３．ｅｕｔ：ｈｏｓｍｄｌｆｃｔｅｓｙｌｏｒｅＶＤ）ｗｓｅｒｉｅｙｉｅｔｎｏｉｎＷＲ３９ＲｓｌＴｅｕｅｏｅｏｕｅｔｉｔｎｅｎｉＴｔｓｍａ
温过夜抽提脂质，入００％硫酸１２ｍＬ混合后加．５．，
键基因固醇调控原件结合蛋白ｌｓｒｌｅｕａｏｙＣ（ｔｏｒｇｌｔｅｒ
ｅｍｎｂｎｉｇｐｏｅｌ，ＲＢ１）调节细胞内ｌｅｔｉｎｒｔｎｅＳＥＰｅ来ｅｄｉ
胰岛素抵抗在代谢综合征形成的过程中起着关
基金项目：家自然科学基金资助项目（０７７２，１７６４国３８２１８００３，８１０８）国家重点基础研究发展计划（７１７３１；９３计划）课题
（０２Ｂ１５２２１Ｃ５７０）
ｐａｉｄｂｄｅｒａｅｅｐｒｓｉｎｆｌｐｏｅｎｎｅｙｃｅｓｄｘｅｓｏｏｉｒｔｉｍｅａｏｌｍｅａｅｇｎｓｎｅａｉｉｓｉｒｃｐｏ — ｐｅｉｎｐｏｔｂｉｓｒｌｔｄｅｅｉｈｐｔｃｎｕｌｎｅｅｔｒｄｅｌｔｏ
通信作者：黎健， — ａ：ｉｉ＠ｈｔａｌｃｒＥｍｉｌｌｌｊｙｏｍｉｏ．ｎ
２１０２年５月第３ｌ卷第３期
ＪｕｎｌｆＣｒｉａｃｌｒｕｍｎｒｉａｅ，ｙ２１Ｖ１３，ｏ３ｏｒａｏａｄｏｓｕａ＆ＰｌｏａｙＤｓｓｓＭａ０２ｔｏ．１Ｎ．ｖｅ

Igf1r基因敲除小鼠模型构建技术原理

Igf1r基因敲除小鼠模型构建技术原理
Liu et al通过同源重组构建了Igf1r基因敲除小鼠模型。

纯合KO 小鼠在出生时因呼吸衰竭而死亡，并表现出严重的生长缺陷（约为正常大小的45%）。

除了Igf1r-/-胚胎（包括肌肉）全身器官发育不全和骨化发育延迟之外，还观察到中枢神经系统和表皮与正常状态存在偏差。

[2]
图. Igf1r KO小鼠表型：（A）野生型（w）、杂合子（h）和纯合子（r）。

纯合子大小上不同，而且在皮肤的外观上也不同。

[2] Holzenberger et al使用杂合敲除小鼠进行了寿命相关的研究，Igf1r+/-小鼠的平均寿命比野生型小鼠的平均寿命长26%，其中雌性Igf1r+/-小鼠的寿命比野生型雌性的寿命长33%，雄性Igf1+/-小鼠的寿命比野生型雄性的寿命增加了16%。

长寿的Igf1r+/-小鼠不发生侏儒症，能量代谢正常，营养摄取、体力活动、生育力和繁殖力不受影响。

Igf1r+/-小鼠对氧化应激表现出更强的抵抗力（氧化应激是已知的衰老决定因素）。

这些结果表明IGF1R基因可能是哺乳动物寿命的中枢调节因子。

[3]
图. Igf1r 杂合小鼠小鼠相对于WT小鼠的寿命延长。

[3]
图. Igf1r 杂合小鼠抗氧化应激比WT更强：百草枯腹腔注射可诱导氧化应激。

雌性突变体表现出较高的抗逆性，而雄性的增幅很小。

[3]。

胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

尊敬的《上海医学》编辑老师：您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。

1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一；在文章中已做修改。

2.从图3可以看出，β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型，原因何在?正如文章所提及，我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本，western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组实验数据来作为结果图。

3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应多关注β细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血糖数据。

这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。

4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条在文章中我已做补充。

此致敬礼李晓雯2015.1．30胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备李晓雯1 李羚1林紫薇1 孙赟1 陈辰2王琛1* 贾伟平1【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。

方法采用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。

Western blot检测APPL1蛋白表达水平。

结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比，胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。

条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠构建及鉴定

条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠构建及鉴定赖舒畅;邱鸿;王肖;潘道延;王桢钰;李凯;白晓春;沈洁【摘要】Objective To study the function of Deptor gene on the regulation of diabetes mellitus in suc-cessfully constructed and identified islet β-cell conditionally DEPTOR knockout mice model. Method By cross-breeding Deptorflox/floxmice with Cre mice expressed conditional specifically in pancreatic β-cell,Deptorflox/+Cre+/-mice were acquired and their genotypic identification was then performed. As the mice model of this study, Deptorflox/floxCre+/-mice were generated by crossing Deptorflox/+Cre+/-mice with Deptorflox/floxmice.Genotypic identifica-tion was performed by PCR at the age of 3 weeks. Tamoxifen was administered through intraperitoneal injection to induce the activation of the Cre recombination in islet beta cells of 8 weeks mice.Double immunofluorescence label-ing was then applied to identify the knockout effect of DEPTOR gene. Results Ten Islets Deptor knockout mice models were successfully acquired after 10-month cross-breeding. Validated genotype by PCR analysis were Deptorflox/floxCre+/- and double immunofluorescence labeling showed a significant difference between knockout mice and rodent controls. Conclusion Our study successfully constructs the islets conditionally Deptor deleted mice model by using Cre-loxp recombination system,providing a promising appliable animal model for study of dia-betes mellitus pathogenetic mechanism.%目的构建并鉴定条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠,为研究DEPTOR基因在糖尿病发生机制的研究提供动物模型.方法将引进的条件性胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶小鼠与DEPTORloxp/loxp小鼠进行杂交繁殖,并对子代进行基因型鉴定,获得基因型为DEPTORloxp/-Cre+/-的小鼠;再让DEPTORloxp/-Cre+/-的小鼠与DEPTORloxp/loxp小鼠杂交获得DEPTORloxp/loxpCre+/-小鼠;基因型为DEPTORloxp/loxpCre+/-的小鼠即为本实验所需要构建模型小鼠.3周龄时通过PCR法鉴定小鼠的基因型;8周龄时腹腔注射他莫昔芬诱导Cre重组酶表达后,免疫荧光验证DEPTOR基因敲除效果.结果从引进这两种小鼠开始繁殖10个月,共获得基因型为DEPTORloxp/loxpCre+/-的小鼠10只,PCR结果证实小鼠的基因型符合DEPTORloxp/loxp-Cre+/-.免疫荧光结果提示敲除效果明显.结论利用Cre/loxp系统,本研究成功构建并鉴定了条件性胰岛β细胞DEPTOR基因敲除小鼠,为在动物水平研究DEPTOR基因在糖尿病发病机制中的作用提供研究平台.【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2018(034)004【总页数】4页(P552-555)【关键词】DEPTOR;Cre/loxp系统;胰岛β细胞【作者】赖舒畅;邱鸿;王肖;潘道延;王桢钰;李凯;白晓春;沈洁【作者单位】南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515;南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515;南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515;南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515;广州中医药大学经济与管理学院广州510515;南方医科大学第三附属医院医学实验研究中心广州510515;南方医科大学第三附属医院医学实验研究中心广州510515;南方医科大学第三附属医院内分泌科广州510515【正文语种】中文糖尿病的病因十分复杂，遗传、环境、行为等多种因素共同参与、相互作用而导致糖尿病的发生。

unc13基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定

２０２０年２月㊀㊀㊀㊀㊀第４１卷㊀第１期㊀㊀㊀㊀首都医科大学学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ㊀㊀㊀Ｆｅｂ２０２０Ｖｏｌ４１㊀Ｎｏ１基金项目:国家重点研发计划(２０１７ＹＦＣ０９０９６００)ꎬ国家自然科学基金(８１８００６８８)ꎬ首都医科大学附属北京同仁医院科研基金(ＴＲＹＹ￣ＫＹＪＪ￣２０１６￣０１３)ꎬ北京市属医院科研培育计划(ＰＸ２０１９００６)ꎮＴｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｓｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＰ＆ＤＰｒｏｇｒａｍｏｆＣｈｉｎａ(２０１７ＹＦＣ０９０９６００)ꎻＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ(８１８００６８８)ꎻＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＢｅｉｊｉｎｇＴｏｎｇｒｅｎＨｏｓｐｉｔａｌꎬＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(ＴＲＹＹ￣ＫＹＪＪ￣２０１６￣０１３)ꎻＢｅｉｊｉｎｇＭｕｎｉｃｉｐａｌＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＨｏｓｐｉｔａｌｓＩｎｃｕｂａｔｉｎｇＰｒｏｇｒａｍ(ＰＸ２０１９００６) ∗ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉｎｋｕｉｙａｎｇ＠ｇｍａｉｌｃｏｍ网络出版时间:２０２０－０１－１５㊀１１ʒ３１㊀网络出版地址:ｈｔｔｐ://ｋｎｓ.ｃｎｋｉ.ｎｅｔ/ｋｃｍｓ/ｄｅｔａｉｌ/１１.３６６２.Ｒ.２０２００１１５.０８５４.００４.ｈｔｍｌ[ｄｏｉ:１０３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ１００６￣７７９５２０２００１００３]糖尿病的临床与基础研究Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定李㊀奇㊀卢㊀晶㊀朱晓蓉㊀熊枫然㊀杨金奎∗(首都医科大学附属北京同仁医院内分泌科㊀糖尿病防治研究北京市重点实验室㊀北京市糖尿病研究所ꎬ北京㊀１００７３０)ʌ摘要ɔ㊀目的㊀构建Ｃｒｅ重组酶系统调控的Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠ꎬ为Ｕｎｃ１３基因在胰岛素分泌中扮演的角色和作用机制的体内实验研究提供更特异的动物模型ꎮ方法㊀运用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术构建Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘ转基因小鼠ꎬ将其与胰岛β细胞特异性表达Ｃｒｅ重组酶(Ｉｎｓ２￣ｃｒｅ)工具鼠进行杂交ꎬ采用聚合酶链反应(ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎꎬＰＣＲ)和测序等方法对其子代小鼠的基因型进行鉴定ꎬ并对该基因敲除(ｋｎｏｃｋｏｕｔꎬＫＯ)小鼠及其同窝野生(ｗｉｌｄｔｙｐｅꎬＷＴ)小鼠的体质量㊁糖耐量㊁胰岛素分泌水平进行测定ꎮ结果㊀成功构建胰岛β细胞特异性Ｕｎｃ１３基因条件性敲除小鼠(以下简称为Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠)ꎮ进一步研究显示Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠与ＷＴ鼠相比ꎬ体质量无明显变化ꎬ但糖耐量受损ꎬ胰岛素第一时相分泌下降ꎮ结论㊀成功构建了Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件敲除小鼠动物模型ꎬ为探讨Ｕｎｃ１３基因在糖尿病发生㊁发展中的作用提供研究平台ꎮʌ关键词ɔ㊀基因敲除ꎻＣｒｅ￣ＬｏｘＰ重组酶系统ꎻ胰岛素分泌ꎻＵｎｃ１３基因ʌ中图分类号ɔ㊀Ｒ５８７ＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＵｎｃ１３ｇｅｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｍｏｄｅｌ㊀ＬｉＱｉꎬＬｕＪｉｎｇꎬＺｈｕＸｉａｏｒｏｎｇꎬＸｉｏｎｇＦｅｎｇｒａｎꎬＹａｎｇＪｉｎｋｕｉ∗(ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙꎬＢｅｉｊｉｎｇＴｏｎｇｒｅｎＨｏｓｐｉｔａｌꎬＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＤｉａｂｅｔｅｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＣａｒｅꎬＢｅｊｉｎｇＤｉａｂｅｔｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＢｅｉｊｉｎｇ１００７３０ꎬＣｈｉｎａ)ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＵｎｃ１３ｇｅｎｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｂｙｔｈｅＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍｆｏｒｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｒｏｌｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＵｎｃ１３ｉｎｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｍｉｃｅｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄｗｉｔｈｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃＣｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ(Ｉｎｓ２－ｃｒｅ)ｔｏｏｌｍｉｃｅ.ＴｈｅｐｒｏｇｅｎｙｇｅｎｏｔｙｐｅｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｉｔｈＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.Ｔｈｅｋｎｏｃｋｏｕｔ(ＫＯ)ａｎｄｔｈｅｉｒｗｉｌｄｔｙｐｅ(ＷＴ)ｍｉｃｅｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｍｅａｓｕｒｅｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔꎬｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｌｅｖｅｌ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｓｐｅｃｉｆｉｃＵｎｃ１３ｇｅｎｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅ(ｈｅｒｅｉｎａｆｔｅｒｒｅｆｅｒｒｅｄｔｏａｓＵｎｃ１３ＫＯｍｉｃｅ)ｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ.ＦｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＵｎｃ１３ＫＯｍｉｃｅｈａｄｉｍｐａｉｒｅｄｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔｐｈａｓｅｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｂｕｔｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＷＴｍｉｃｅ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＵｎｃ１３ＫＯｍｉｃｅｍｏｄｅｌｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｓａｒｅｓｅａｒｃｈｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｅｘｐｌｏｒｉｎｇｔｈｅｒｏｌｅｏｆＵｎｃ１３ｇｅｎｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｄｉａｂｅｔｅｓ.ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀ｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔꎻＣｒｅ￣ＬｏｘＰｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｓｙｓｔｅｍꎻｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎꎻＵｎｃ１３ｇｅｎｅ㊀㊀２型糖尿病(ｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓꎬＴ２ＤＭ)由于其经常累及身体多个系统和器官以及严重的合并症ꎬ截至２０１７年ꎬ我国成年人糖尿病患病人数已达１１４亿ꎬ占世界糖尿病患者总数的２５％[１]ꎮＴ２ＤＭ的主要致病原因为胰岛β细胞的损害导致的胰岛素分泌功能障碍ꎬ或者因为胰岛素抵抗致使胰岛细胞超负荷运转造成功能的损伤ꎮ就胰岛素分泌功能而言ꎬＴ２ＤＭ患者的主要表现为胰岛素双相分泌模式的紊乱ꎬ即第一时相分泌延迟和第二时相分泌降低[２]ꎮ因此ꎬ深入了解胰岛素双相分泌的产生和调节机制对于理解糖尿病的发生㊁发展过程是非常重要的ꎮ研究[３]显示ꎬ胰岛素分泌的第一时相为预备释放池中胰岛素分泌颗粒的释放ꎬ第二时相则涉及储存池中胰岛素分泌颗粒的动员和启动[３]ꎮ然而ꎬ由于胰岛素双相分泌第１期李㊀奇等:Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定过程可能涉及多种因素的协同作用ꎬ胰岛素颗粒分泌的调节过程仍有待进一步研究加以明确ꎮ对于哺乳动物中Ｍｕｎｃ１３蛋白来说ꎬ他们的秀丽隐杆线虫直系同源物Ｕｎｃ１３ｓ和果蝇直系同源物Ｄｕｎｃ１３ｓ已经有十多年的研究历史[４]ꎮＵｎｃ１３基因首次在秀丽隐杆线虫突变表型中发现ꎬ这些突变体携带一种未协调(ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ/ｕｎｃ)的ꎬ与神经递质的突触前胞吐作用受损有关的表型ꎬ故被命名为Ｕｎｃ１３基因[５]ꎮＭｕｎｃ１３蛋白家族在哺乳动物中由３个亚型(Ｍｕｎｃ１３￣１㊁Ｍｕｎｃ１３￣２㊁Ｍｕｎｃ￣３)构成ꎬ主要为脑特异性佛波酯受体[６]ꎬ含有结合佛波酯的Ｃ１结构域和两个Ｃ２结构域[７]ꎬ可以调节囊泡运输ꎬ参与囊泡的引导㊁锚定及释放过程ꎮ研究[８]显示ꎬＭｕｎｃ１３－１与胰岛素分泌颗粒的启动密切相关ꎬ其缺失会损害第二时相胰岛素分泌[８]ꎮ但是Ｕｎｃ１３基因具体如何调节胰岛素颗粒分泌仍不清楚ꎮ因此ꎬ本研究构建了特异性的基因修饰动物模型为研究提供帮助ꎮ基因修饰动物模型是在活体动物上开展基因功能研究ꎬ是寻找合适药物作用靶标的重要工具[９]ꎮ条件性基因敲除技术作为新一代基因敲除技术ꎬ与第一代基因敲除技术相比ꎬ有更高的特异性ꎬ因此具更为广泛的应用前景ꎮ其中基于Ｃｒｅ￣ＬｏｘＰ系统的条件性基因敲除小鼠因良好的实验效果得到了青睐[１０]ꎮＣｒｅ重组酶是大肠杆菌噬菌体Ｐ１中Ｃｒｅ基因编码表达的由３４３个氨基酸组成的相对分子质量为３８０００的蛋白质ꎬ它可以特异性识别ＤＮＡ上的ＬｏｘＰ序列ꎬ并根据ＬｏｘＰ序列的位置和ＬｏｘＰ序列之间的关系介导不同的特异性重组反映ꎮ本研究采用Ｃｒｅ￣ＬｏｘＰ系统构建了Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件敲除小鼠ꎬ为２型糖尿病发病机制研究提供了动物模型ꎮ１㊀材料与方法１１㊀实验动物胰岛β细胞表达Ｃｒｅ重组酶的小鼠(以下简称ＣｒｅＴ小鼠)由香港大学徐爱民教授馈赠ꎬ实验动物许可证号:ＳＣＸＫ(京)２０１１－００１２ꎮＵｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘ转基因小鼠(即仅插入了ＬｏｘＰ序列ꎬ未与Ｃｒｅ重组酶进行结合的小鼠ꎬ以下简称纯合Ｆｌｏｘ小鼠)采用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术构建ꎮ遗传背景均系Ｃ５７/Ｂ６小鼠ꎬ按照ＳＰＦ级动物饲养标准在北京大学医学部ＳＰＦ级实验动物中心进行饲养ꎮ实验室温度２０~２５ħꎬ相对湿度５０％~７０％ꎮ１２ｈ光照ꎬ１２ｈ黑暗ꎬ所有小鼠自由采食ꎬ饮水ꎬ小鼠饲料㊁饮水㊁垫料均经高温高压灭菌处理ꎮ实验所使用的所有动物均经过首都医科大学附属北京同仁医院动物委员会批准ꎮ１２㊀采用ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９技术构建Ｆｌｏｘ小鼠１２１㊀构建打靶载体从ＮＣＢＩ小鼠基因组网站得到Ｕｎｃ１３基因(ＧｅｎｅＩＤ:２０８８９８)的序列和结构信息ꎮ在基因的非编码区中选择距离和长度适宜的２个区域插入同向的ＬｏｘＰ序列ꎬ并在ＬｏｘＰ序列两端携带相应的同源序列ꎬ构建出两段同源序列－ＬｏｘＰ－同源序列的ＤＮＡ片段作为打靶载体ꎮ１２２㊀显微操作与Ｆ０代鉴定将纯化后的打靶载体通过显微注射的方法注入小鼠胚胎干细胞中ꎬ得到携带ＬｏｘＰ突变基因的靶细胞ꎮ将中靶细胞注入小鼠囊胚中内ꎬ将囊胚植入假孕小鼠子宫ꎬ发育得到Ｆ０代ＬｏｘＰ突变基因的嵌合体小鼠ꎮ取小鼠尾部细胞进行培养ꎬＰＣＲ扩增后通过ＤＮＡ印迹确认ＬｏｘＰ突变基因已经整合到小鼠染色体上ꎮ为进一步验证ꎬ将ＰＣＲ产物进行ＴＡ克隆测序ꎮ１２３㊀繁育纯合突变小鼠将嵌合体小鼠与野生型Ｃ５７/Ｂ６小鼠进行繁育ꎬ得到Ｆ１代小鼠ꎮ通过基因型鉴定筛选出Ｆ１代杂合子ꎬ并用其作为亲本ꎮ交配繁育Ｆ２代ꎬ得到的Ｆ２代再进行基因鉴定ꎬ最终得到两条染色体均带有ＬｏｘＰ突变基因的纯合突变小鼠(以下简称为纯合Ｆｌｏｘ小鼠)ꎬ从而建立突变群体ꎮ１３㊀Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件敲除小鼠构建由于纯合Ｆｌｏｘ小鼠的目的基因片段上下游均插入了同向的ＬｏｘＰ片段ꎬ将其与ＣｒｅＴ小鼠进行杂交后ꎬ即能在特异性表达Ｃｒｅ重组酶的组织(本研究中为胰岛β细胞)中将２段ＬｏｘＰ序列之间的基因删除ꎬ同时生成一个终止子ꎬ以达到条件性敲除目的基因的作用ꎬ最终得到Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型ꎮ１４㊀小鼠基因型的鉴定１４１㊀小鼠尾部基因组ＤＮＡ提取剪取２１日龄小鼠尾尖０５ｃｍ置于１５ｍＬ的ＥＰ管内ꎬ加入４００μＬ裂解液和１μＬ蛋白酶Ｋ储存液ꎬ将上述ＥＰ管置于５５ħ恒温水浴锅水浴过夜ꎬ待消化完全ꎬ使用酚/氯仿法抽提基因组ＤＮＡꎮ１４２㊀小鼠基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增反应下列反应物构成２０μＬ的反应体系:模板ＤＮＡ５１首都医科大学学报第４１卷２０μＬꎬ缓冲液(含Ｍｇ２＋)２０μＬꎬｄＮＴＰ混合物(１０ｍｍｏｌ/Ｌ)０５μＬꎬ引物混合液(１０ｍｏｌ/Ｌ)０５μＬꎬＤＮＡ聚合酶(５Ｕ/μＬ)０５μＬꎬ超纯水１４５μＬꎮＰＣＲ反应条件:预变性９５ħ５ｍｉｎꎻ变性９５ħ３０ｓꎻ退火５８ħ３０ｓꎻ延伸７２ħ３０ｓꎻ共４０个循环ꎬ最后再延伸７０ħ１０ｍｉｎꎬ之后２５ħ保存ꎬ引物序列见表１ꎮ表１㊀引物序列Ｔａｂ１㊀ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓＰｒｉｍｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)Ｓｉｚｅ/ｂｐＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＵｎｃ１３－ＦＴＣＣＡＡＴＴＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＦｌ＝４６６Ｄｅｔｅｃｔ３ᶄｌｏｘＰＵｎｃ１３－ＲＡＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＷｔ＝３６８Ｄｅｔｅｃｔ３ᶄｌｏｘＰＣｒｅ￣ＦＴＧＣＣＡＣＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＴ＝４８１ＤｅｔｅｃｔＩｎｓ￣ＣｒｅＣｒｅ￣ＲＡＣＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＡＡＴＣＣＡＴＣＧＣＴＣ㊀㊀Ｆｌ:ＦｌｏｘꎻＷｔ:ｗｉｌｄｔｙｐｅꎻＴ:Ｃｒｅｇｅｎｅｐｏｓｉｔｉｖｅ.１４３㊀琼脂糖凝胶电泳及结果分析ＰＣＲ之后通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定ꎮ制备２％(质量分数)琼脂糖凝胶ꎬ取ＰＣＲ反应终产物５μＬ进行电泳ꎬ１３５Ｖ２０ｍｉｎꎮ电泳后利用凝胶成像系统进行电泳图片分析ꎮ根据电泳结果筛选含有目的条带的小鼠ꎬ判断对应小鼠是杂合子还是纯合子ꎮ图１㊀Ｃａｓ９设计策略Ｆｉｇ１㊀ＤｅｓｉｇｎｓｔｒａｔｅｇｙｏｆＣａｓ９ＵＴＲ:ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄｒｅｇｉｏｎｓ１５㊀小鼠腹腔葡萄糖耐量实验(ｉｎｔｒａ￣ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｇｌｕ￣ｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔꎬＩＰＧＴＴ)及血清胰岛素浓度测定小鼠禁食１２~１４ｈ后ꎬ腹腔注射２０％(质量分数)葡萄糖溶液ꎬ注射体积为小鼠体质量(ｇ)ˑ１０μＬꎬ用固定器固定小鼠ꎬ分别测定葡萄糖负荷后０㊁１５㊁３０㊁６０和１２０ｍｉｎ时小鼠尾静脉血糖浓度ꎮ并于０㊁１５㊁３０ｍｉｎ自眼眶静脉丛采血ꎬ留取血清ꎬ采用小鼠超敏胰岛素ＥＬＩＳＡ试剂盒(美国Ｍｉｌｉｐｏｒｅ公司)测定血清胰岛素浓度ꎮ血糖测定用美国强生公司Ｏｎｅ￣Ｔｏｕｃｈ血糖仪及配套试纸ꎮ１６㊀统计学方法采用Ｐｒｉｓｍ７(ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ)软件进行统计分析ꎮ两组间均数比较采用独立样本的Ｍａｎｎ￣ＷｈｉｔｎｅｙＵ检验ꎮ组间和时间均数比较ꎬ采用双因素重复测量方差分析ꎮ以Ｐ<００５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２１㊀Ｆｌｏｘ小鼠构建策略通过ＮＣＢＩ小鼠基因组网站得到Ｕｎｃ１３基因(ＧｅｎｅＩＤ:２０８８９８)的序列和结构信息ꎬ选择Ｅｘｏｎ２和Ｅｘｏｎ３作为目的基因片段ꎬ在其上下游分别插入一段同向的ＬｏｘＰ序列ꎬ构建出携带有ＬｏｘＰ序列的Ｆｌｏｘ小鼠(图１)ꎮ２２㊀Ｆ１代杂合Ｆｌｏｘ小鼠构建及基因型鉴定将Ｆ０代Ｆｌｏｘ小鼠与野生型Ｃ５７/Ｂ６小鼠进行繁育ꎬ得到Ｆ１代小鼠ꎮ从鼠尾中提取出ＤＮＡ样品ꎬ采用ＰＣＲ扩增的方法检测ＬｏｘＰ片段ꎮ理论上ꎬ不含ＬｏｘＰ片段的小鼠可见条３６８ｂｐ条带ꎬＬｏｘＰ纯合子只有一条４６６ｂｐ条带ꎬ杂合子有３６８ｂｐ和４６６ｂｐ两条带(图２Ａ)ꎮ为进一步验证ꎬ将ＰＣＲ产物进行ＴＡ克隆测序(图２Ｂ)ꎮＬｏｘＰ序列成功结合到小鼠Ｕｎｃ１３基因相应部位ꎬ２７㊁２８㊁２９㊁３６㊁３８㊁３９号均为杂合子Ｆｌｏｘ小鼠ꎮ６１第１期李㊀奇等:Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定图２㊀Ｆｌｏｘ小鼠Ｆ１代基因型鉴定Ｆｉｇ２㊀ＦｌｏｘｍｉｃｅｇｅｎｏｔｙｐｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＡ:２７－３９:ｍｉｃｅꎻＢ:ＦｌｏｘｍｉｃｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓꎬＬｏｘＰｓｅｑｕｅｎｃｅｉｓｈｉｇｈｌｉｇｈｔꎻＴＲＡＮＳ２Ｋ:ｍａｒｋｅｒꎻＴＲＡＮＳ２ＫＰＬＵＳＩＩｍａｒｋｅｒ(ｂｐ):８０００ꎬ５０００ꎬ３０００ꎬ２０００ꎬ１０００ꎬ７５０ꎬ５００ꎬ２５０ꎬ１００ꎻ５００ｂｐｉｓｈｉｇｈｌｉｇｈｔꎻＰ:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻＢ６:Ｃ５７/Ｂ６ꎻＮ:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ.２３㊀胰岛β细胞条件性敲除鼠构建及基因型鉴定将纯合Ｆｌｏｘ小鼠与ＣｒｅＴ小鼠进行杂交ꎬ得到特异性表达Ｃｒｅ重组酶的Ｆｌｏｘ杂合鼠(基因型为Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｗｔＣｒｅＴ)和没有特异性表达Ｃｒｅ重组酶的Ｆｌｏｘ杂合鼠(基因型为Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｗｔＣｒｅＷ)ꎮ将其作为亲本进行杂交ꎬ可得到表达或不表达Ｃｒｅ重组酶的Ｆｌｏｘ纯合鼠(基因型为Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘＣｒｅＴ或Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘＣｒｅＷ)ꎬ即为本研究构建的Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除鼠及其对照鼠ꎮ从鼠尾中提取出ＤＮＡ样品ꎬ采用ＰＣＲ扩增的方法分别检测ＬｏｘＰ片段(图３Ａ)和Ｃｒｅ片段ꎮ表达Ｃｒｅ重组酶的鼠在４８１ｂｐ处可见条带ꎬ不表达者则在相应位置没有条带(图３Ｂ)ꎮ成功构建出Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除鼠(编号为８７㊁９１㊁９２㊁９３ꎬ基因型为Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘＣｒｅＴꎬ即Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠)及其对照鼠(编号为８８㊁８９㊁９０ꎬ基因型为Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘＣｒｅＷꎬ即ＷＴ鼠)ꎮ２４㊀Ｕｎｃ１３ＫＯ小鼠葡萄糖代谢能力下降选取９周龄的基因型为ＣｒｅＴＵｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘ(以下简称Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠)和ＣｒｅＷＵｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘ(以下简称图３㊀条件性敲除小鼠基因型鉴定结果Ｆｉｇ３㊀ＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｋｎｏｃｋｏｕｔｍｉｃｅｇｅｎｏｔｙｐｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎＡ:８７－９３:ｍｉｃｅꎬｉｄｅｎｔｉｆｙＬｏｘＰｇｅｎｅꎬＬｏｘＰｉｓ４６６ｂｐꎻＢ:８７－９３:ｍｉｃｅꎬｉｄｅｎｔｉｆｙＣｒｅｇｅｎｅꎬＣｒｅＴｉｓ４８１ｂｐꎬＣｒｅＷｉｓｎｏｎｅꎻＤＬ２０００:ｍａｒｋｅｒꎻＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ(ｂｐ):２０００ꎬ１０００ꎬ７５０ꎬ５００ꎬ２５０ꎬ１００７５０ｂｐｉｓｈｉｇｈ￣ｌｉｇｈｔꎻＰ:ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌꎻＢ６:Ｃ５７/Ｂ６ꎻＮ:ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ.ＷＴ鼠)两种小鼠作为实验组和对照组进行ＧＴＴ和胰岛素分泌实验ꎮ雌雄Ｕｎｃ１３ＫＯ小鼠在３０ｍｉｎ和６０ｍｉｎ的血糖浓度均明显高于对照组(Ｐ<００５)ꎮ７１首都医科大学学报第４１卷Ｕｎｃ１３ＫＯ雄鼠的血糖值曲线下面积较对照组明显升高(Ｐ<００５)ꎬ雌鼠的血糖值曲线下面积虽较对照组也有升高ꎬ但差异无统计学意义(Ｐ>００５)ꎬ详见图４ꎮ图４㊀ＩＰＧＴＴ实验结果Ｆｉｇ４㊀ＩＰＧＴＴｒｅｓｕｌｔｓＡ:ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅｌｅｖｅｌｓｏｆｍａｌｅｍｉｃｅꎬＷＴꎬｎ＝６ꎬＫＯ:ｎ＝３ꎻＢ:ＡＵＣｏｆｍａｌｅｍｉｃｅꎻ∗Ｐ<００５ｖｓＷＴꎻＣ:ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅｌｅｖｅｌｓｏｆｆｅｍａｌｅｍｉｃｅꎻＷＴ:ｎ＝５ꎬＫＯ:ｎ＝３.Ｄ:ＡＵＣｏｆｆｅｍａｌｅｍｉｃｅꎻＩＰＧＴＴ:ｉｎｔｒａ￣ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌｇｌｕｃｏｓｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔꎻＫＯ:ｋｎｏｃｋｏｕｔꎻＷＴ:ｗｉｌｄｔｙｐｅꎻＡＵＣ:ａｒｅａｕｎｄｅｒｃｕｒｖｅ.２５㊀Ｕｎｃ１３ＫＯ小鼠胰岛素分泌功能受损分别测量普通饲养的１１周龄Ｕｎｃ１３ＫＯ小鼠与ＷＴ小鼠的胰岛素分泌水平ꎮＵｎｃ１３ＫＯ小鼠在１５ｍｉｎ和３０ｍｉｎ的胰岛素质量浓度明显低于对照组(Ｐ<００５)ꎬＵｎｃ１３ＫＯ雄鼠的胰岛素质量浓度曲线下面积较对照组明显升高(Ｐ<００５)ꎮ雌鼠的胰岛素分质量浓度曲线下面积虽较对照组也有升高ꎬ但差异无统计学意义(Ｐ>００５)ꎬ详见图５ꎮ３㊀讨论胰岛素抵抗与胰岛β细胞缺陷是２型糖尿病两个重要的病理生理改变ꎮ目前认为ꎬ胰岛素抵抗在２型糖尿病发生㊁发展过程中发挥重要的作用[１１]ꎬ但单独的胰岛素抵抗不足以引发糖尿病ꎬ只有当胰岛β细胞不能代偿胰岛素抵抗时ꎬ糖尿病才发生[１２]ꎻ胰岛β细胞缺陷在２型糖尿病发生㊁发展中发挥中心性作用[１３]ꎮ胰岛β细胞的主要功能为胰岛素的合成㊁储存㊁运输和释放ꎮ就胰岛素的释放而言ꎬ其需要一系列的准备过程ꎬ包括分泌囊泡向细胞质膜的迁移ꎬ囊泡的锚定ꎬ胞吐过程的启动等步骤[１４]ꎬ此过程受蛋白激酶Ｃ(ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣꎬＰＫＣ)[１５]㊁环磷酸腺苷(ｃｙｃｌｉｃａｄｅｎｏｓｉｎｅｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬｃＡＭＰ)[１６]㊁蛋白激酶Ａ(ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＡꎬＰＫＡ)[１７]㊁腺嘌呤核苷三磷酸(ａｄｅｎｏｓｉｎｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅꎬＡＴＰ)[１７]和Ｃａ２＋[１８]等因子调控ꎬ任何一个环节受损都可能导致胰岛素分泌功能障碍ꎮＭｕｎｃ１３￣１蛋白可作用于囊泡的锚定过程ꎬ通过辅助ＳＮＡＲＥｓ蛋白促进囊泡膜与细胞膜半融合中间体的形成[１９２３]ꎮ而Ｕｎｃ１３基因在胰岛素释放过程中的作用仍不得而知ꎬ所以ꎬ构建动物模型进行研究就显得极为重要ꎮ基于Ｃｒｅ￣ＬｏｘＰ系统的条件性基因敲除技术因其良好的实验效果而成为热门的基因编辑技术[２４２５]ꎮ本实验通过构建Ｕｎｃ１３ｆｌｏｘ/ｆｌｏｘ转基因小鼠ꎬ并将其与Ｉｎｓ２￣Ｃｒｅ鼠杂交ꎬ通过繁育最终得到Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件敲除小鼠ꎮ通过进行小鼠葡萄糖耐量实８１第１期李㊀奇等:Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件性敲除小鼠模型的构建和鉴定图５㊀胰岛素分泌实验结果Ｆｉｇ５㊀ＩｎｓｕｌｉｎｒｅｌｅａｓｅｒｅｓｕｌｔｓＡ:ｓｅｒｕｍｉｎｓｕｌｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍａｌｅｍｉｃｅꎻＷＴ:ｎ＝６ꎬＫＯ:ｎ＝３ꎻＢ:ＡＵＣｏｆｍａｌｅｍｉｃｅꎻ∗Ｐ<００５ꎻＣ:ｓｅｒｕｍｉｎｓｕｌｉｎｌｅｖｅｌｓｏｆｆｅｍａｌｅｍｉｃｅꎻＷＴ:ｎ＝５ꎻＫＯ:ｎ＝３ꎻＤ:ＡＵＣｏｆｆｅｍａｌｅｍｉｃｅꎻＫＯ:ｋｎｏｃｋｏｕｔꎻＷＴ:ｗｉｌｄｔｙｐｅꎻＡＵＣ:ａｒｅａｕｎｄｅｒｃｕｒｖｅ.验及胰岛素测定ꎬ笔者发现Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠的确存在糖耐量降低ꎬ胰岛素分泌水平下降的表现ꎮ后期实验将通过增加样本量ꎬ高糖㊁高脂等特色条件诱导Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠ꎬ相信能对Ｕｎｃ１３基因的作用有更深入的了解ꎮ本研究成功构建了Ｕｎｃ１３基因胰岛β细胞条件敲除小鼠模型并进行了初步实验ꎬ但还存在一些问题ꎮ比如对Ｕｎｃ１３ＫＯ鼠的胰岛β细胞的功能研究还不够深入ꎬ也并没有阐明Ｕｎｃ１３基因发挥作用的具体机制ꎮ后续应在提取原代胰岛β细胞后ꎬ进行形态学检查㊁葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验㊁探究蛋白质之间相互作用等实验来更进一步的研究Ｕｎｃ１３基因的功能ꎬ从而为Ｕｎｃ１３基因与胰岛素分泌的相关性研究提供新的基础研究数据和结果ꎮ４㊀参考文献[１]㊀ＫａｈｎＳＥ.Ｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｖｉｅｗ:Ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｏｆｂｅｔａ￣ｃｅｌｌｆａｉｌｕｒｅｉｎｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅ￣ｔｅｓ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＭｅｔａｂꎬ２００１ꎬ８６(９):４０４７－４０５８.㊀[２]㊀ＰｏｒｔｅＤꎬＪＲꎬＫａｈｎＳＥ.Ｂｅｔａ￣ｃｅｌｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｆａｉｌｕｒｅｉｎｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓ.ｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ[Ｊ].Ｄｉａｂｅｔｅｓꎬ２００１ꎬ５０(Ｓｕｐｐｌ１):Ｓ１６０－１６３.[３]㊀ＮｅｓｈｅｒＲꎬＣｅｒａｓｉＥ.Ｍｏｄｅｌｉｎｇｐｈａｓｉｃｉｎｓｕｌｉｎｒｅｌｅａｓｅ:ｉｍ￣ｍｅｄｉａｔｅａｎｄｔｉｍｅ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｆｆｅｃｔｓｏｆｇｌｕｃｏｓｅ[Ｊ].Ｄｉａｂｅ￣ｔｅｓꎬ２００２ꎬ５１(Ｓｕｐｐｌ１):Ｓ５３－５９.[４]㊀ＫｏｓＣＨＪＮＲ.Ｃｒｅ/ｌｏｘＰｓｙｓｔｅｍｆｏｒｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｔｉｓｓｕｅ￣ｓｐｅｃｉｆ￣ｉｃｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｓ[Ｊ].ＭｅｔｈｏｄｓＮｕｔｒＳｃｉꎬ２０１０ꎬ６２(６):２４３－２４６.[５]㊀ＲｉｃｈｍｏｎｄＪＥꎬＤａｖｉｓＷＳꎬＪｏｒｇｅｎｓｅｎＥＭ.ＵＮＣ－１３ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｓｙｎａｐｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｆｕｓｉｏｎｉｎＣ.ｅｌｅｇａｎｓ[Ｊ].ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ１９９９ꎬ２(１１):９５９－９６４.[６]㊀ＫｏｃｈＨꎬＨｏｆｍａｎｎＫꎬＢｒｏｓｅＮ.ＤｅｆｉｎｉｔｉｏｎｏｆＭｕｎｃ１３￣ｈｏ￣ｍｏｌｏｇｙ￣ｄｏｍａｉｎｓａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｕｂｉｑｕｉ￣ｔｏｕｓｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄＭｕｎｃ１３ｉｓｏｆｏｒｍ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍＪꎬ２０００ꎬ３４９(Ｐｔ１):２４７－２５３.[７]㊀ＢｒｏｓｅＮꎬＨｏｆｍａｎｎＫꎬＨａｔａＹｅｔａｌ.Ｍａｍｍａｌｉａｎｈｏｍｏ￣ｌｏｇｕｅｓｏｆＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓｕｎｃ￣１３ｇｅｎｅｄｅｆｉｎｅｎｏｖｅｌｆａｍｉｌｙｏｆＣ２￣ｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].ＪＢｉｏｌＣｈｅｍꎬ１９９５ꎬ２７０(４２):２５２７３－２５２８０.[８]㊀ＫａｎｇＬꎬＨｅＺꎬＸｕＰꎬｅｔａｌ.Ｍｕｎｃ１３￣１ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｓｕｓｔａｉｎｅｄｒｅｌｅａｓｅｏｆｉｎｓｕｌｉｎｆｒｏｍｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａｃｅｌｌｓ[Ｊ].９１首都医科大学学报第４１卷ＣｅｌｌＭｅｔａｂꎬ２００６ꎬ３(６):４６３－４６８.[９]㊀傅继良ꎬ王铸钢.基因工程小鼠[Ｍ].上海:上海科学技术出版社ꎬ２００６:７９－８０.[１０]㊀ＺｈｕＰꎬＷｕＦꎬＭｏｓｅｎｓｏｎＪꎬｅｔａｌ.ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９￣ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｃｏｒｒｅｃｔｓｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎａｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｍｕｓｃｌｅｄｙｓｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓꎬ２０１７ꎬ７:３１－４１. [１１]㊀戴盈ꎬ崔巍ꎬ施秉银.早期胰岛素抵抗胰岛β细胞代偿机制的研究进展[Ｊ].中华内分泌代谢杂志ꎬ２００８ꎬ２４(３):３４５－３４７.[１２]㊀ＰｉｍｅｎｔａＷꎬＫｏｒｙｔｋｏｗｓｋｉＭꎬＭｉｔｒａｋｏｕＡꎬｅｔａｌ.Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｂｅｔａ￣ｃｅｌｌｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｔｈｅｐｒｉｍａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｌｅｓｉｏｎｉｎＮＩＤ￣ＤＭ.Ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｒｏｍｓｔｕｄｉｅｓｉｎｎｏｒｍａｌｇｌｕｃｏｓｅ￣ｔｏｌｅｒａｎｔｉｎ￣ｄｉｖｉｄｕａｌｓｗｉｔｈａｆｉｒｓｔ￣ｄｅｇｒｅｅＮＩＤＤＭｒｅｌａｔｉｖｅ[Ｊ].ＪＡＭＡꎬ１９９５ꎬ２７３(２３):１８５５.[１３]㊀ＷｅｙｅｒＣꎬＢｏｇａｒｄｕｓＣꎬＭｏｔｔＤＭꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｎａｔｕｒａｌｈｉｓｔｏｒｙｏｆｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｉｎｓｕｌｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆｔｙｐｅ２ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＩｎ￣ｖｅｓｔꎬ１９９９ꎬ１０４(６):７８７－７９４.[１４]㊀ＷｈｉｔｅＪＭ.Ｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｉｏｎ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９２ꎬ２５８(５０８４):９１７－９２４.[１５]㊀ＧｉｌｌｉｓＫＤꎬＭｏｓｓｎｅｒＲꎬＮｅｈｅｒＥ.ＰｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｅｎ￣ｈａｎｃｅｓｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓｆｒｏｍｃｈｒｏｍａｆｆｉｎｃｅｌｌｓｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｓｉｚｅｏｆｔｈｅｒｅａｄｉｌｙｒｅｌｅａｓａｂｌｅｐｏｏｌｏｆｓｅｃｒｅｔｏｒｙｇｒａｎｕｌｅｓ[Ｊ].Ｎｅｕｒｏｎꎬ１９９６ꎬ１６(６):１２０９－１２２０.[１６]㊀ＬｅｅＡＫ.Ｄｏｐａｍｉｎｅ(Ｄ２)ｒｃｅｐｔｏｒｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕ￣ｌａｒｃａｌｃｉｕｍａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｃａｐａｃｉｔａｎｃｅｃｈａｎｇｅｓｉｎｒａｔｍｅｌ￣ａｎｏｔｒｏｐｈｓ[Ｊ].ＪＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９９６ꎬ４９５(３):６２７－６４０. [１７]㊀ＳｉｋｄａｒＳＫꎬＫｒｅｆｔＭꎬＺｏｒｅｃＲ.Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｕｎｉｔａｒｙ㊀㊀㊀㊀ｅｘｏｃｙｔｉｃｅｖｅｎｔａｍｐｌｉｔｕｄｅｂｙｃＡＭＰｉｎｒａｔｍｅｌａｎｏｔｒｏｐｈｓ[Ｊ].ＪＰｈｙｓｉｏｌꎬ１９９８ꎬ５１１(３):８５１－８５９.[１８]㊀ＶｏｎＲüｄｅｎＬꎬＮｅｈｅｒＥ.ＡＣａ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅａｒｌｙｓｔｅｐｉｎｔｈｅｒｅｌｅａｓｅｏｆｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｓｆｒｏｍａｄｒｅｎａｌｃｈｒｏｍａｆｆｉｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ１９９３ꎬ２６２(５１３６):１０６１－１０６５. [１９]㊀ＳｈｅｕＬꎬＰａｓｙｋＥＡꎬＪｉＪꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｓｕｌｉｎｅｘｏ￣ｃｙｔｏｓｉｓｂｙＭｕｎｃ１３－１[Ｊ].ＪＢｉｏｌＣｈｅｍꎬ２００３ꎬ２７８(３０):２７５５６－２７５６３.[２０]㊀ＣｈｅｎＺꎬＣｏｏｐｅｒＢꎬＫａｌｌａＳꎬｅｔａｌ.ＴｈｅＭｕｎｃ１３ｐｒｏｔｅｉｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｒｅｇｕｌａｔｅｒｅａｄｉｌｙｒｅｌｅａｓａｂｌｅｐｏｏｌｄｙｎａｍｉｃｓａｎｄｃａｌｃｉｕｍ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｃｏｖｅｒｙａｔａｃｅｎｔｒａｌｓｙｎａｐｓｅ[Ｊ].ＪＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１３ꎬ３３(１９):８３３６－８３５１.[２１]㊀朱莉莉ꎬ陈哲ꎬ刘鑫ꎬ等.糖耐量正常人群ＯＧＴＴ１ｈ血糖与胰岛素敏感性和胰岛β细胞功能的关系[Ｊ].首都医科大学学报ꎬ２０１７ꎬ３８(４):５９２－５９６.[２２]㊀ＳａｋａｍｏｔｏＨꎬＡｒｉｙｏｓｈｉＴꎬＫｉｍｐａｒａＮꎬｅｔａｌ.ＳｙｎａｐｔｉｃｗｅｉｇｈｔｓｅｔｂｙＭｕｎｃ１３－１ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ[Ｊ].ＮａｔＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１８ꎬ２１(１):４１－４９.[２３]㊀ＳｃｈｉｆｅｒｅｒＭꎬＹｕｓｈｃｈｅｎｋｏＤꎬＳｔｅｉｎＦꎬｅｔａｌ.Ａｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃｓｅｎｓｏｒｆｏｒｉｍａｇｉｎｇｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｓｉｎｇｌｅβｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＣｈｅｍＢｉｏｌꎬ２０１７ꎬ２４(４):５２５－５３１.[２４]㊀ＬａｎｇｅｍｅｙｅｒＬꎬＦｒｏｈｌｉｃｈＦꎬＵｎｇｅｒｍａｎｎＣ.ＲａｂＧＴＰａｓｅｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｅｎｄｏｓｏｍｅａｎｄｌｙｓｏｓｏｍｅｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌＢｉｏｌꎬ２０１８ꎬ２８(１１):９５７－９７０.[２５]㊀ＨｏｌｚＲꎬＺｉｍｍｅｒｂｅｒｇＪ.ＤｙｎａｍｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｏｆｔｈｅＳＮＡＲＥｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａｍｅｍｂｒａｎｅ[Ｊ].Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌꎬ２０１９ꎬ１１７(４):６２７－６３０.(收稿日期:２０１９－１２－１２)编辑㊀慕㊀萌０２。

基因组编辑技术在胰岛素依赖性糖尿病治疗中的应用

基因组编辑技术在胰岛素依赖性糖尿病治疗中的应用胰岛素依赖性糖尿病，简称1型糖尿病，是一种由胰岛β细胞功能障碍引起的自身免疫性疾病，主要表现为高血糖、糖尿、多食、多饮、多尿、体重下降等症状。

目前，1型糖尿病的治疗仍面临一些挑战，例如胰岛素注射次数多、治疗费用高、并发症风险等。

随着基因组编辑技术的不断发展，人们开始研究利用这一技术来治疗1型糖尿病。

基因组编辑技术是一种人工干预染色体DNA序列的技术，主要分为基因敲除和基因修饰两种。

基因敲除是通过靶向剪切DNA分子来去除某一位点上的基因，从而改变细胞在表达各个基因时的模式；而基因修饰是在DNA序列上添加、删除或更改碱基、转录因子结合位点等，从而影响基因的转录和翻译。

虽然目前的基因组编辑技术已经十分先进，但是其应用在人体内仍面临诸多限制，例如技术成熟度、安全性、输出效果等。

此外，基因组编辑也涉及风险和伦理问题，例如会不会对人类遗传基因稳定性造成影响，是否会出现基因不均或出现不可预测的变异等问题，在研究应用时必须谨慎。

针对1型糖尿病，基因组编辑技术的研究主要集中在两个方面：补充胰岛素分泌和调节自身免疫反应。

当前已有一些相关研究成果，下面分别进行介绍。

一、补充胰岛素分泌1型糖尿病患者由于自身免疫攻击导致胰岛β细胞功能受损，所以无法分泌足够的胰岛素。

基因组编辑技术可以在胰岛细胞中增强胰岛素基因的表达，从而补充胰岛素分泌。

目前已有研究表明，敲除Panx1基因（Pannexin 1）可以在胰岛细胞中增加钙离子的浓度，从而引起膜电位下降，促进内向整流钾离子通道的开放，继而促进胰岛素分泌。

此外，研究人员还利用CRISPR/Cas9技术在胰岛β细胞中敲除了AP2S1基因（Adaptor Related Protein Complex 2 Subunit Sigma 1），发现敲除后细胞可以分泌更多的胰岛素。

这些研究结果为1型糖尿病的治疗提供了一定的思路。

另外，国际上还有一些使用基因组编辑技术治疗1型糖尿病的研究。

Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911060539.5(22)申请日 2019.11.01(71)申请人上海交通大学地址 200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人隋中泉　徐义娟　高海德　李紫君　马梦婷　温雅迪　(74)专利代理机构上海汉声知识产权代理有限公司 31236代理人胡晶(51)Int.Cl.C12N 15/90(2006.01)C12N 15/85(2006.01)C12N 15/56(2006.01)A01K 67/027(2006.01)(54)发明名称Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用(57)摘要本发明公开了一种Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法与应用；基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Amy1基因敲除小鼠模型，其构建方法包括如下步骤：步骤一、设计sgRNA和Cas9 RNA 并体外转录成mRNA，将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Amy1基因敲除小鼠；步骤二、对Amy1基因敲除小鼠动物模型的鉴定。

其优点表现在：本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次建立了Amy1基因敲除的小鼠动物模型，为研究Amy1基因与相关疾病的关系提供便捷、可靠的动物模型。

权利要求书1页说明书7页序列表13页附图5页CN 110885858 A 2020.03.17C N 110885858A1.一种Amy1基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：S1，确定Amy1基因的特异性靶位点sgRNA1和sgRNA4，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；S2，将有活性的sgRNA1、sgRNA4和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Amy1基因敲除小鼠；所述sgRNA1如SEQ ID NO:1所示，所述sgRNA4如SEQ ID NO:2所示。

糖尿病小鼠模型的制备

一、糖尿病的概念及分类糖尿病已成为全人类继恶性肿瘤和心脑血管病之后的严重威胁人类健康的第三大非传染性疾病。

目前我国己成为世界第一糖尿病大国。

糖尿病是一类由遗传、环境、免疫等因素引起的、具有明显异质性的慢性高血糖症及其并发症所组成的综合征，并非单一病因所引起的单一疾病(多原因引起的综合症）。

糖尿病分为：Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病和其它特异性糖尿病。

Ⅰ型糖尿病即胰岛β细胞大量破坏，常导致胰岛素绝对性缺乏，以往称为胰岛素依赖型糖尿病、青年发病型糖尿病，“三多一少”症状明显。

本型病因及发病是由于胰岛β细胞受到细胞介导性自身免疫性破坏。

Ⅱ型糖尿病由于胰岛素抵抗并胰岛素分泌不足所致，以高血糖高血脂为显著特点。

以往称为非胰岛素依赖型糖尿病、成年发病型糖尿病，常伴有明显的遗传因素，但遗传机制尚未阐明。

其它特异性糖尿病包括，β细胞功能的基因缺陷、胰岛素作用的基因缺陷、胰腺外分泌疾病、内分泌疾病、药物或化敏学制剂所致的糖尿病、感染、非常见型免疫介导性糖尿病以及有时并发糖尿病的其它遗传综合症。

（糖尿病是无法根治的，现在随着人们生活水平的提高，饮食习惯，生活方式的改变糖尿病的发病率节节攀升，成为威胁人类健康的一大难题。

人们曾经一度把糖尿病称为富贵病这也是有一定道理的。

目前常用的动物模型有实验性动物模型和自发性动物模型。

自发性模型应用价值较高，但因价格昂贵，饲养、繁殖条件要求严格，而不能得到广泛应用。

实验性模型则应用比较广泛，实验性糖尿病动物模型的建立，是用各种方法损伤动物胰脏或胰岛β细胞导致胰岛素的缺乏，或用化学药物对抗胰岛素作用，导致动物出现高血糖形成糖尿病。

条件性敲除小鼠模型构建原理

方法是在要敲除的区域两侧插入loxp得到的floxed小鼠与组织特异表达cre的小鼠杂交在cre的作用下两个loxp之间的区域被删除可以实现在特异的组织敲除目的基因
条件性敲除小鼠模型构建原理
当目的基因敲除致死时，只能做条件敲除，常用 Cre-loxp 系统。那么如何操作呢？方法是在要敲除的区域两侧插入 loxp，得到的 floxed 小鼠与组织特异表达 Cre 的小鼠杂交，在 Cre 的作用下，两个 loxp 之间的区域被删除，可以实现在特异的组织敲除目的基因。条件敲除虽然也是敲除，但是制备这种小鼠实际是要定点插入 loxp 序列。
条件敲除小鼠制备示Байду номын сангаас图

1型糖尿病小鼠模型构建及胰岛B细胞表达_张璞_李容誽_李一欣_李占淳_梁文妹

糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ，ＤＭ）是一个世界范ｔｙｐｅ１ｄｉａｂｅｔｅｓ围内的健康问题，其中１型糖尿病（，Ｔ１ＤＭ）临床症状较严重且多累及年轻人，ｍｅｌｌｉｔｕｓ其患病率也以２％～５％的速度增长
ＺＨＡＮＧＰｕ，ＬＩＲｏｎｇｒｏｎｇ，ＬＩＹｉｘｉｎ，ＬＩＺｈａｎｃｈｕｎ，ＬＩＡＮＧＷｅｎｍｅｉ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｉｓｔｏｌｏｇｙａｎｄＥｍｂｒｙｏｌｏｇｙ，ＧｕｉｙａｎｇＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）

１型糖尿病小鼠模型构建及胰岛Ｂ细胞表达
张璞，李容誽，李一欣，李占淳，梁文妹
（贵阳医学院组织学与胚胎学教研室，贵州贵阳５５０００４）
［摘要］目的：构建１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）小鼠模型，研究Ｔ１ＤＭ小鼠胰岛Ｂ细胞表达胰岛素（Ｉｎｓ）及血清Ｉｎｓ
水平的变化。方法：正常雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠１０４只，随机分为实验组、盐水对照组和正常对照组；模型的诱导采用连续多次小剂量链脲佐菌素给药法（ＭＬＤＳＴＺ）制作Ｔ１ＤＭ小鼠模型；分别于注射后第３、７、１０、１４、２１及２８天检测小鼠的空腹血糖、体重，取血清及胰腺组织，应用免疫组织化学ＳＡＢＣ单染法、图像分析、形态计量法及酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）进行空腹血糖、胰岛面积、面数密度（ＮＡ）及胰岛Ｉｎｓ阳性细胞研究。结果：与正常及盐０天以后出现明显的多饮、多尿、活动减少等典型糖尿病（ＤＭ）表现，空腹血糖水水对照组比较，实验组小鼠第１平从实验第１４天开始明显升高，以第２８天组最高，差异有统计学意义（Ｐ＜００１）；实验组小鼠胰岛面积有所减ｎｓ阳性细胞在实验第１０、１４及２１ｄ组染色加深，免疫反应强度增强，平均灰度值降低，差异有统计学小。胰岛ＩＰ＜００１）；Ｎ天开始减小，呈逐渐下降趋势，与正常及盐水对照组比较，差异有统计学意义（Ｐ＜意义（Ａ从第７００１）；实验组小鼠与对照组相比，血清Ｉｎｓ浓度从实验第７天后均处于较低水平。结论：Ｔ１ＤＭ模型小鼠胰岛面积减小，胰岛Ｂ细胞数量减少，合成和分泌Ｉｎｓ总量减少且表达下调，血清Ｉｎｓ水平下降。

Myo1h基因敲除小鼠模型的建立与初步观察

Myo1h基因敲除小鼠模型的建立与初步观察温士强;孙榕榕;时函;李永明【期刊名称】《口腔医学》【年(卷),期】2022(42)8【摘要】目的构建Myo1h(Myosin 1H)基因与人同源的第30号外显子敲除模型小鼠(Myo1h小鼠)并验证其敲除效率。

方法采用Crispr/Cas9技术构建Myo1h 基因敲除F0(the founder)代嵌合体小鼠,并进行配笼繁殖,经过基因型鉴定后获得纯合F2(the second filial generation,子2代)代实验鼠。

利用实时荧光定量PCR 技术和免疫印迹技术从mRNA水平和蛋白层面验证敲除效果;利用免疫荧光染色技术,对小鼠髁突区域Myo1h的表达进行观察,从体内验证敲除效果;通过Micro-CT 三维重建测量有效下颌骨长度,对F2代小鼠进行表型评估;采用Prism 8.0软件包对数据进行统计学分析。

结果实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Myo1h基因的mRNA水平显著降低(P<0.05)、蛋白表达降低。

免疫荧光染色结果显示,Myo1h 小鼠体内脑部、肺部以及髁突组织的Myo1h表达显著降低(P<0.05)。

通过Micro-CT和身长测量分析进行表型评估后发现,Myo1h基因敲除后小鼠的有效身长比正常对照组短(P<0.05)。

结论本研究成功构建出Myo1h基因敲除小鼠,且该基因敲除小鼠与正常对照相比,身长发育受到抑制影响。

随着Myo1h基因对发育影响研究的继续深入,或许能为颅颌面骨的生长发育研究提供新的思路。

【总页数】8页(P673-680)【作者】温士强;孙榕榕;时函;李永明【作者单位】上海市牙组织修复与再生工程技术研究中心同济大学口腔医学院·附属口腔医院口腔正畸科【正文语种】中文【中图分类】R349.64【相关文献】1.Apr3条件性基因敲除小鼠模型的建立及初步表型研究2.Msx2条件性基因敲除小鼠动物模型的建立和表型的初步研究3.单核细胞特异性KCNQ1基因条件性敲除小鼠模型的建立及初步分析4.TDO2基因敲除小鼠模型的建立和初步表型研究5.少突胶质细胞条件性敲除FGF9基因小鼠模型的建立、鉴定及初步表型因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。