胰岛细胞特异性敲除基因appl1小鼠模型的制备

尊敬的《上海医学》编辑老师：

您好！首先非常感谢您及评审专家对我们文章的审修，目前已按照修改意见进行了修改，以下是对修改意见的具体答复，希望回答专家的问题，谢谢。

1.“胰岛细胞特异性敲除APPL1基因”和“β细胞APPL1特异性敲除APPL1基因”这两种表达方法应该统一；

在文章中已做修改。

2.从图3可以看出，β细胞APPL1敲除小鼠脂肪组织APPL1的表达显著高于野生型，原因何在?

正如文章所提及，我们收集APPL1flox/flox和β-APPL1KO两组小鼠多例样本，western结果并未发现APPL1蛋白水平表达的脂肪组织中有统计学差异，为了消除之前结果容易给人的误解，我们另外选择两组实验数据来作为结果图。

3.该研究目的是建立β细胞APPL1基因敲除小鼠模型，因此在表型分析方面应多关注β细胞功能，至少要提供血胰岛素水平方面的数据，而不是仅仅提供血糖数据。

这个意见提得很好，事实上我们研究组已经研究了APPL1flox/flox和β-APPL1KO小鼠的空腹血胰岛素水平差异，这部分内容我在文章的方法和结果中也已作了修改和补充。

4.如可以请引用《上海医学》杂志和《中国实用内科杂志》的参考文献各一条

在文章中我已做补充。

此致

敬礼

李晓雯

2015.1．30

胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型的制备

李晓雯1 李羚1林紫薇1 孙赟1 陈辰2王琛1* 贾伟平1

【摘要】目的制备转接蛋白APPL1胰岛细胞特异性敲除小鼠模型。方法采用基因剔除打靶技术，囊胚显微注射法制备嵌合小鼠，利用Cre-loxp系统繁育APPL1胰岛特异性敲除小鼠。Western blot检测APPL1蛋白表达水平。结果成功制备胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型，与APPL1flox/flox小鼠相比，胰岛细胞特异性敲除基因APPL1并不影响小鼠体重，空腹血糖以及空腹胰岛素水平，western blot从蛋白水平印证敲除小鼠胰岛中的APPL1蛋白无表达。结论胰岛细胞特异性敲除基因APPL1小鼠模型制备成功，为探讨APPL1在胰岛中的功能提供研究工具。

【关键词】APPL1；胰岛；条件性敲除

Establishment of APPL1 conditional knock out model in mice islet LI Xiaowen1, LI Ling1,

LIN Zeiwei1, SUN Yun1, CHEN Chen2 , WANG Chen1*, JIA Weiping1.

1Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People’s Hospital, Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai 200233, China

2 Shanghai Research Center for Model Organisms, Shanghai 201210, China Corresponding author: WANG Chen, wangchen@

【Abstract】Objective To discuss the method of APPL1 knock out mouse model in islet. Methods Mouse embryonic stem (ES) cells were targeted knockout of APPL1 by the homologous recombination vector, and screened .The APPL1-knockout embryonic stem cells were microinjected into blastula of C57BL/6J mice.F1 hybrid mice were bred to obtain mouse aggregation chimeras. The conditional KO mice were generated by cross-breeding APPL1 floxed mice with mice expressing Cre in islets. Western blot was conducted to measure protein expression. Results Mice with conditional APPL1 knockout (KO) in islets were generated. Compared with APPL1flox/flox mice, APPL1 conditional knockout in islets does not affect the mice weight, fasting plasma glucose and fasting insulin levels, no APPL1 protein expression was found in APPL1 KO mice islets with western blot. Conclusions The conditional APPL1-knockout mouse model is successfully established, it lays a foundation for study APPL1 function in mouse islets.

【Key words】APPL1; islet; conditional knockout

2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病，对公共健康造成严重威胁，是由胰岛素抵抗和β细胞受损/死亡造成胰岛素分泌缺乏共同作用而引起的一种进展性疾病[1]。近年研究表明，脂肪细胞因子对糖尿病的发病起着重要作用，其中脂联素(Adiponectin)因其可增加胰岛素敏感性、降低胰岛素抵抗、增加胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌[2, 3]，在2型糖尿病的发生和发展中可能起重要作用，因而引起了极大的关注并成为研究热点。脂联素通过脂联素受体发挥作用，2006

年[4]报道APPL1 (Adaptor protein containing PH domain, PTB domain and Leucine zipper motif 1)可与脂联素受体1（Adiponectin receptor-1，adipoR1）结合，介导脂联素信号传导，该发现为药物干预提供了一个潜在靶点[5]。遗传研究结果显示，APPL1基因单核苷酸多态性位点rs4640525和rs3806622的变异与中国人2型糖尿

病患者肥胖发病风险有关[6]。为了从生物整体水平上来探讨脂联素-APPL1传导系统在胰岛素抵抗发生和发展中的作用以及APPL1对胰岛β细胞功能的影响，本研究利用Cre-LoxP 系统介导技术及RIP-Cre转基因小鼠在胰岛细胞中特异性表达特点, 建立胰岛细胞特异性APPL1基因敲除小鼠。

1材料与方法

1.1实验动物

所有实验小鼠饲养于上海市第六人民医院实验动物中心SPF级动物室，小鼠自由进食消毒颗粒饲料（上海斯莱克公司），及饮用消毒水，室温控制于23±1℃，湿度56％，12 h间隔照明，定期紫外线消毒与通风。实验和操作程序经所在单位的动物实验伦理委员会审核通过（实验动物合格证号：SYXK（沪）2008-0052）。对照组和APPL1基因敲除纯合子小鼠于8-12周龄测定体重，空腹血糖采用ACCU-CHEK血糖仪（美国罗氏公司）检测，空腹胰岛素水平用ELISA药盒测定（瑞典Mercodia公司）。分离上述小鼠的胰岛，脂肪组织于-80℃冻存备用。

1.2APPL1flox/+小鼠建立及鉴定

APPL1flox/+小鼠模型在上海南方模式生物研究中心[SYXK(沪) 2008-0035]制备，具体为基因剔除打靶载体构建、胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES）基