医学课件免疫组化技术简介
免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
免疫组化ppt课件
蛋白-抗体结合体
抗原
标本：组织标本和细胞标本
(1).组织标本：石蜡切片、冰冻切片、振动 切片、塑料切片、超薄切片、碳蜡切片等；
(2).细胞标本：组织印片、细胞爬片和细胞 涂片等。
石蜡切片应用：其优点是组织结构保存良好， 在病理和回顾性研究中有较大的实用价值， 能切连续薄片，组织结构清晰，抗原定位准 确。缺点在于制作时间过长，步骤繁多，易 出错。
(6).加Ⅰ抗：弃去血清，加Ⅰ抗，4℃过夜或室温下5分钟— 1小时；
(7).复温：室温复温1小时，回收Ⅰ抗，PBS液洗涤3次X5分 钟；
(5).透明化：纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒 浸液，替换出组织内的酒精，这种媒浸液称为透明剂。组织先经纯酒精 和透明剂各半的混合液浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。目的： 石蜡易于浸入组织； (6).浸蜡与包埋：用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用。 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1～2小 时，再先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍3小时左右，浸蜡应在高于石蜡 熔点3℃左右的温箱中进行，以利石蜡浸入组织内。通常石蜡采用熔点为 56～58℃或60～62℃两种。 (7).切片:包埋好的蜡块用刀片修成规整的四棱台，切片机切片，切片厚 度为4～7um。 (8).贴片与烤片:用粘附剂-蛋白甘油将展平的蜡片牢附于载玻片。首先 在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，再将一定长度蜡带（连续切片） 或用刀片断开成单个蜡片于温水（45℃左右）中展平后，捞至玻片上铺 正，或直接滴两滴蒸馏水于载玻片上，再把蜡片放于水滴上，略加温使 蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥， 也可在37℃温箱中干燥，但需适当延长时间。
免疫组化科普
免疫组化科普免疫组化技术是一种通过使用特定的抗体与待检测物发生特异性结合的方法来检测和定位细胞或组织中特定分子的存在和表达情况。
它在医学诊断、疾病研究以及药物研发等领域起着重要作用。
免疫组化技术的原理是利用抗体与抗原间的特异性结合来检测细胞或组织中的分子。
抗体是一种人体免疫系统产生的特异性蛋白质，能够识别并结合到与其具有亲和性的抗原上。
在免疫组化实验中，首先需要选取与目标分子特异性结合的抗体，这些抗体可以通过人工合成或从动物免疫产生。
然后，将这些抗体标记上荧光物质、酶或放射性同位素等，使其具有可检测的特性。
最后，将标记好的抗体与待检测的组织或细胞接触，如果目标分子存在，则标记抗体会与其结合，形成复合物。
通过特定的检测方法，可以观察到这种复合物的存在和定位情况，从而了解目标分子在细胞或组织中的表达情况。
免疫组化技术在医学诊断中有着广泛的应用。
例如，在肿瘤诊断中，通过检测肿瘤细胞中特定蛋白的表达情况，可以帮助医生确定肿瘤的类型和分级。
此外，在病理学研究中，免疫组化技术可以帮助研究人员观察和定位特定蛋白在疾病发展过程中的变化，从而揭示疾病的发生机制。
免疫组化技术还可以用于检测病原体感染、免疫系统疾病以及器官移植等方面的研究。
免疫组化技术的优点在于其高度特异性和敏感性。
由于抗体与抗原的结合具有很高的特异性，因此可以准确地检测和定位目标分子。
而且，免疫组化技术可以使用多种检测方法，如荧光显微镜、酶标仪等，可以对不同类型的样本进行检测。
此外，免疫组化技术还可以进行定量分析，通过测量标记物的强度来评估目标分子的表达水平。
然而，免疫组化技术也存在一些局限性。
首先，免疫组化技术需要合适的抗体来进行实验，因此需要事先知道目标分子的抗原性质。
其次，免疫组化技术对样本的处理要求较高，包括取材、固定、切片等步骤，这些操作容易引入误差。
此外，免疫组化技术在自动化和高通量方面仍存在一定的挑战，限制了其在临床实践中的应用。
免疫组化技术是一种重要的实验方法，可以用于检测和定位细胞或组织中特定分子的存在和表达情况。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence，简称IF）是常用于研究细胞和组织中蛋白质分布和定位的实验技术。
免疫组化：免疫组化是通过使用特异性抗体来检测和定位组织切片中特定蛋白质的技术。
它包括将组织切片与特异性抗体结合，然后使用染色试剂使抗原-抗体复合物形成染色反应，从而可视化目标蛋白质的位置。
该技术常用于研究细胞分化、组织病理学和肿瘤学等领域。
免疫荧光：免疫荧光是利用荧光染料（荧光标记的二抗或直接标记的一抗）结合目标抗原的方法来检测和定位组织或细胞中的蛋白质。
通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后使用荧光标记的二抗或直接标记的一抗与抗原-抗体复合物结合，使目标蛋白质在显微镜下产生荧光信号，以观察其位置。
免疫荧光技术广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和医学诊断领域。
这两种技术在原理上非常类似，但在应用上有一些区别。
免疫组化主要用于固定的组织切片，可用于定量和定位分析。
而免疫荧光通常用于固定的细胞，可以提供更高分辨率的蛋白质定位信息，并可以进行多色荧光共标记以研究多个蛋白质的相互作用和定位。
无论是免疫组化还是免疫荧光，都依赖于合适的抗体选择和样本处理步骤来确保结果的准确性。
技术的选择应根据研究
的目的和样本的性质进行评估和决策。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
免疫组化技术ppt课件
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
《免疫组化技术》课件
高灵敏度、高特异性、定位准确、可 定量分析等。
免疫组化技术的应用领域
肿瘤诊断与鉴别诊断
检测肿瘤标志物，辅助 临床诊断。
病理学研究
探索疾病发生、发展机 制，为新药研发提供依 据。
药物作用机制研究
研究药物作用靶点，评 估治疗效果。
生物医学研究
用于基因表达、蛋白质 定位等研究。
免疫组化技术的发展历程
结果解读的注意事项
排除非特异性染色
非特异性染色可能导致假阳性或假阴性结果， 需通过设立对照等方式排除。
结合临床资料
结合患者的临床资料，如病史、症状、体征等 ，综合分析免疫组化结果的临床意义。
参考相关文献和指南
查阅相关文献和指南，了解目标蛋白的表达与疾病的关系，提高结果解读的准 确性。
05 免疫组化技术的优缺点
抗原的修复与暴露
去除抗原的掩蔽作用，使 抗原暴露出来。
使用蛋白酶、抗原提取液 等。
热修复、酸修复等。
暴露方法 修复方法
目的
抗体孵育与洗涤
抗体选择
单克隆抗体、多克隆抗体等 。
孵育条件
温度、时间、抗体浓度等。
洗涤目的
去除未结合的抗体，减少非 特异性结合。
显色反应与复染
显色反应
酶促反应、化学反应等。
提高特异性
开发更特异的抗体或采用多重免疫组化技术 ，降低交叉反应的发生率。
增强结果稳定性
通过标准化实验操作和质控，确保实验结果 的稳定性和可靠性。
06 免疫组化技术的应用案例
肿瘤诊断与鉴别诊断
肿瘤诊断
通过免疫组化技术检测肿瘤组织中的 特异性抗原，有助于确定肿瘤的性质 和来源，为临床提供准确的诊断依据 。
19世纪末
免疫组化相关技术-精品医学课件
包埋方法： ①干冰-丙酮法 ②液氮法
OCT包埋剂
是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物. 其作用是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的 连续性，减少皱折及碎裂。又因其为水溶性，故 在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增 加背景染色。
2) 将固定后或未固定的组织置于 20% ~ 30%蔗糖溶液l~3天。利用高渗吸 收组织中水分，减少组织含水量。包埋、 冷冻等后续步骤同上。
比较HE染色和免疫组织化学染色图象 （胰腺组织切片）
HE 染色
胰岛素 IHC染色
胰高血糖素 IHC染色
生长抑素 IHC染色
Nissl’s staining show neuron in SN
intact side
IHC Staining for TH in SN
intact side
lesioned side
（4）组织块不要过大，< 220.4 cm
2. 细胞标本的取材
印片法 穿刺吸取涂片法 体液沉淀涂片法 培养细胞涂片法 离心涂片机法
(1) 印片法
应用：活检标本、手术切除 的标本。 方法：将新鲜标本以最大面剖开暴露病区，
载玻片轻压病区，脱落细胞黏附于载玻 片上，立即浸入固定液中5~10min，取出 后自然干燥，低温保存。 优点：简便省时，细胞抗原保存较好。 缺点：细胞分布不均、重叠，影响观察效果。
常用附贴剂：
1)甘油-明胶： 2)甲醛-明胶： 3)铬明矾-明胶： 4)多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)： 0.5%~1%多聚赖氨酸 (分子质量>150 000) 水溶液， 涂布载片后，晾干或45℃烤干，一周内应用。此溶液需 冷冻贮藏, 可反复使用。
常用附贴剂：
5）APES（3-Amino propyltriethoxy silane）
免疫组化技术简介及相关临床应用
的抗原抗体反应为理论基础发展起来的一
门方法学。
20世纪80年代该项技术在国外开始
应用于诊断疾病，国内比国外约晚10年，
即90年代开始运用于疾病的病理诊断。
3
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最近20多年来，该项技术得到飞速发展，
特别是绝大多数抗体能够应用在福尔马林固定的
石蜡切片上，因而大大促进了它在临床病理学上
的应用。
基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体
特异性结合的原理，通过化学反应使标记
抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、
同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多
肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定
量
的
研
究
。
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基本原理：
抗体和抗原之间的结合具有高度的 特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。 先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来， 以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获 得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或 细胞中的同类的抗原物质。然后再通过化学 显色方法将抗原抗体结合所在的部位显示出
免疫组化技术简介及相关临 床应用
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提纲
1、背景知识简介
2、定义及基本原理
3、所用抗体及标本类型
4、常用染色方法
5、操作步骤及结果判断
6、临床应用
7、相关图片
7、开展该项目注意事项
2
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背景知识简介
免疫组化技术是20世纪70年代初
Sterb Berger在酶标法的基础上,以免疫学
6
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来，从而达到对组织或细胞中的未知抗原 进行定性，定位或定量的研究。
有如下基本特点： 1、特异性强 2、敏感性高 3、定位准确 4、形态与功能相结合
免疫组化 ppt课件
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
免疫组化技术 ppt课件
一.发展简史
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。
70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根 过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术， 使免疫细胞化学得到广泛应用。
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免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGF表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
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高剂量组
雷尼替丁组
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免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGFR表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
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高剂量组
雷尼替丁组
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结论
EGF和EGFR在胃溃疡粘膜表达强度呈 平行变化,表示药物在治疗胃溃疡过程 中,可能通过促进EGF与EGFR表达、进 而促进粘膜的修复过程。
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三 免疫组化的基本流程
1.染色前处理
5.一抗孵育
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
6.二抗孵育 7.染色 8.显色
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染色前处理
主要包括取材、脱水、浸蜡，福尔马林固定，防 脱片处理，以及脱蜡与水化。脱蜡与水化的目的是确 保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全容易产生非特异性背景着色。
免疫组化技术
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主要内容
一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化在药理学中的应用
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结果判读
• 抗原表达必须在特定部位 阳性标记细胞学特征可分为①胞膜型；②胞核型；③胞质(浆)型；④
微绒毛型；⑤复合型（胞膜-胞质兼有，胞核-胞质兼有，或微绒毛-胞 质兼有）等五种阳性细胞类型。
基本概念
• 抗体的结构
二抗：羊抗鼠
一抗：鼠抗人
• V区氨基酸的种类和排列顺
序千变万化，故可形成许多 种具有不同结合抗原特异性 的抗体。（抗原特异性，第 一抗体）
• C区氨基酸的组成和排列在
同一种属动物Ig同型L链和同 一类H链中都比较恒定。
• 制备第二抗体的重要基础。
基本概念
•单克隆抗体 由同一克隆细胞产生，针对抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗 体。
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基本原理
间接法 PAP法 直接法 LSAB法
显色 抗体 抗原
基本原理
• 显色系统 酶免疫组化染色中的常用的酶及显色底物
辣根过氧化物酶/HRP：DAB、AEC 碱性磷酸酶/AP ：AP-Red、NBT/BCIP
酶的选择
HRP染色结果比AP染色结果保存时间长 含有内源性HRP的组织切片：首选标记酶为AP AP和HRP结合可进行双重或3重免疫组化标记，对比清晰
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操作流程
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技术要点
• 免疫原理的选择 一抗（属种、单/多抗、浓缩/即用型） 二抗（属种、标记方法） 显色方式
体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白 质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术 (immunohistochemistry, IHC) 或 免 疫 细 胞 化 学 技 术 (immunocytochemistry, ICC)。
•多克隆抗体 由不同细胞产生，其免疫化学特性不同，能够识别抗原表面多种抗原决 定簇的多种抗体的混合物。
•基因工程抗体 在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，甚至是在人工全合成后 导入受体细胞表达产生的新型抗体。
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质
失 败 原 因
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结
技 术 要 点
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基 本 原 理
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基
决定簇发生遮蔽、致使免疫细胞化学的信号减弱或消失等不良效应。 使遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的方法，即抗原修复。
抗原修复常用方法：①酶修复法（胰蛋白酶、胃蛋白酶和无花果酶）；
②热修复（高压修复、微波炉修复、煮沸法）
技术要点
• 抗体的保存 分装密封保存，避免对抗体的污染 并注明标记（批号、名称、效价、量） 根据厂家提供的保存条件保存 避免反复冻融而使抗体效价降低
• 冰冻切片
优点：能避免石蜡切片因固定，脱水，浸蜡等对抗原的损失，较好的
保存组织抗原的免疫活性，适用于不稳定的抗原。
缺点：不易保存（-80℃）；细胞内易形成冰晶而破坏抗原结构，造成
抗原的弥散使定位不准确。
能做石蜡切片的就能做冰冻切片，能做冰冻切片的不一定能做石蜡切片！
技术要点
• 抗原修复 免疫组化在制片的过程中由于广泛的蛋白交联而使其组织的某些抗原
各种体液、穿刺液：可直接涂片（血液、组织液等）或离心后涂片（细胞少脑脊液、腹
水等）。
培养细胞：悬浮细胞离心后涂片；贴壁细胞可爬片。
取材时间要早（24小时以内），避免组织自溶，使抗原变性消失或严重弥散。 组织切块厚度不易超过0.5cm，以便固定液的及时渗透及脱水。
技术要点
• 固定
目的：①凝固蛋白，终止细胞内酶的作用，防止细胞自溶；固定细胞
反应选择适当的固定剂。如甲醇、丙酮、甲醛、乙醇等。
甲醛固定后，抗原容易被掩盖，形成醛键或羧甲基，使蛋白交联封闭部分抗原表位。
技术要点
• 石蜡切片
优点：对组织结构形态保存好，对组织的定位很准确，是观察组织和
细胞结构的理想方法，可以用于回顾性研究。
缺点：抗原常被封闭和破坏。对抗原的保存不如冰冻切片。
技术要点
• 取材
组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）；大小（1×1×0.5cm）；取病变组织与正
常组织交界处；避免对组织标本的损伤和挤压。
印片：肝、脾、淋巴结等器官或组织 (经新鲜标本最大面积剖开，充分暴露病灶，将载
玻片轻轻压与组织切面，细胞粘附于玻片上，然后固定）（缺点是细胞分布不均匀，细 胞有重叠）
形态和结构；②保持组织细胞的抗原性；③防止细胞层脱落；④去除 细胞内的脂类（妨碍抗体结合）；⑤防腐。
注意事项：①组织块不宜过大；②固定液的量一般以组织块大小的组织过度收缩或 膨胀的试剂；④固定时间一般以24小时为宜。
固定液的选择：所有的标本固定必须根据其性质及所进行的组织化学
基本概念
•抗原（Antigen, Ag） 一类能刺激机体的免疫系统发生免疫应答，即产生抗体或致敏淋巴细胞 等，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外特异性结合的物质。
•抗体（Antibody, Ab） 机体受抗原刺激后由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相 应抗原发生反应的球蛋白，称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。
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04
02
07
失 败
05
技 术
03
基 本
01
原
要
原
因
点
理
质
结
操
基
量
果
作
本
控 制
判 读
流 程
概 念
CONTENTS
目 录
结果判读
• 必须设立对照 阳性组织对照 阴性组织对照 阴性试剂对照（空白对照；替代对照；吸收试验；抑制试验） 自身对照
没有对照染色的免疫组化染色结果是不可信的！
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基本概念
• 免疫组化 应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗