二轮——PCR技术

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重叠延伸pcr原理

重叠延伸pcr原理重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术。

它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。

这种技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，特别是在基因工程领域。

首先，我们来看一下重叠延伸PCR的基本原理。

在第一轮PCR中，我们需要设计两对引物，每对引物包含一个与目标DNA片段的末端相互重叠的序列。

这样，当PCR反应进行时，引物会将两个目标DNA片段的重叠部分进行延伸，形成两个带有重叠序列的DNA片段。

然后，在第二轮PCR中，我们使用这两个DNA片段作为模板，再次进行PCR反应。

这样，重叠部分会在第二轮PCR中连接起来，最终得到一个重组的DNA片段。

重叠延伸PCR的关键在于引物的设计。

引物的选择需要考虑到两个目标DNA片段的重叠部分，以及引物之间的相互作用。

通常情况下，引物的长度在20-30个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，Tm值在55-65°C之间。

此外，引物的末端需要与目标DNA片段的重叠部分完全匹配，以确保延伸的准确性。

在实际操作中，重叠延伸PCR需要进行两轮PCR反应。

在第一轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行优化，以确保两个目标DNA片段的重叠部分能够被准确延伸。

在第二轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行进一步的优化，以确保重叠部分能够被准确连接。

此外，我们还需要对PCR产物进行酶切、测序等验证，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。

总的来说，重叠延伸PCR是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术，它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。

在实际操作中，我们需要对引物的设计、反应条件的优化、PCR产物的验证等进行精细的操作，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。

二轮专题复习“PCR技术”

二轮专题复习“PCR技术”一、知识回顾聚合酶链反应法(PCR法)：PCR技术可模拟细胞核内DNA复制的天然过程，可在3～4h内使目的基因扩增上百万倍，达到肉眼可见的量，不需要放射性同位素标记就能分析、检测基因，大大提高了基因检测的灵敏度。

具体过程：首先，把DNA加热，使双链分开；然后将人工合成的一段单链核苷酸即DNA引物，黏附到DNA单股螺旋上；之后按照引物就能够复制出DNA来，重复放大50次后就可以制成10亿个基因。

在PCR放大过程中的关键是利用耐热DNA聚合酶使少量的DNA在短期内即能扩增数百万倍，便于分析、检测。

二、试题精练1、PCR技术是一种DNA的扩增技术。

在一定条件下，加入模板DNA、DNA聚合酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP可以实现DNA的扩增。

据此判断不合理的是A．dATP在DNA扩增中可以提供能量，同时作DNA合成的原料B．dTTP完全水解后产物有胸腺嘧啶、磷酸、核糖C．DNA扩增过程未加解旋酶，可以通过先适当加温的方法破坏氢键，使模板DNA解旋D．CTP水解脱去两个磷酸基后是组成RNA的基本单位之一２、多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历下述三十多次循环：95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新的脱氧核苷酸链）。

下列有关PCR过程的叙述中不正确的是：（）A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成C．延伸过程中需要DNA聚合酶、A TP、四种核糖核苷酸D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高3、下列有关PCR技术的叙述，不正确的是：（）A．PCR技术经过变形、复性、延伸三个阶段B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等C．PCR技术需在体内进行D．PCR技术是利用碱基互补配对的原则4、PCR技术扩增DNA,需要的条件是( )①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④DNA聚合酶等⑤mRNA ⑥核糖体A、①②③④B、②③④⑤C、①③④⑤D、①②③⑥5、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸460个）放入PCR仪中扩增4代，那么，在PCR仪中放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数至少应是A．640 B．8100 C．600 D．86406、对禽流感的确诊，先用PCR技术将标本基因大量扩增，然后利用基因探针，测知待测标本与探针核酸的碱基异同。

高三二轮复习生物：PCR技术1-重叠PCR技术课件(共19张PPT)

2024年可用课件
5
二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用（1）构建融合基因
5’
3’ 基因M
3’ 5’
3’
5’ 3’
5’
基因N
重叠PCR技术可以将基因M和基因N链接起来。其过程为：
设计引物
PCR扩增两端
回收两端片段
两端片段退火延伸
扩增全长基因
2024年可用课件
6
二.重叠PCR技术 2.重叠PCR技术的应用（1）构建融合基因
A D’5’ 3’
3’
5’A’D
D’与引物D互补配对 A’与引物A互补配对
5’ 3’
PCR扩增第二次
3’ 5’ 引物B
A D’5’ 3’ A’D 3’ 5’A’D
引物C 5’ 3’
2024年可用课件
10
二.重叠PCR技术
2.重叠PCR技术的应用
（1）构建融合基因
③回收两端片段并进行
④两端片段退火延伸 1 3’ 2 5’
2024年可用课件
3
二.重叠PCR技术 1.重叠PCR技术的定义
重叠延伸PCR技术 (gene splicing by overlap extension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。
科普课：重叠PCR技术
2024年可用课件
1
致敬：凯利·穆利斯
凯利·穆利斯（Kary Banks Mullis，1944年12月2019年8月7日），美国著名化学家，因发明高效复制 DNA片段的“聚合酶链式反应（PCR）”方法而获得1993年诺贝尔化学奖。

高三生物二轮复习微专题 ------PCR技术

标记PCR病毒分子杂交胚胎发育电泳穆利斯( K.B.Mullis ) 1944～？由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR 技术的真正诞生。

到如今2013年，PCR已发展到第三代技术。

1973 年，台籍科学家钱嘉韵，发现了稳定的Taq DNA聚合酶，为PCR技术发展也做出了基础性贡献。

不同细胞的细胞周期不同生物细胞需要的时间PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR的反应体系DNA模板原料∶ dNTP（dATP、dGTP、dCTP、TTP）;酶∶ Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物∶（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液∶维持pH，保护Taq酶其中dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶以及Mg2+的加量（或浓度）可根据实验调整，以上表格只提供大致参考值。

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

巢式pcr的原理与应用

巢式PCR的原理与应用1. 巢式PCR的概述巢式PCR（Nested PCR）是一种特殊的聚合酶链反应（PCR）技术，它通过两轮PCR反应来提高特异性和敏感性。

巢式PCR在许多领域，特别是分子生物学和医学研究中的基因检测和分析方面得到广泛应用。

2. 巢式PCR的原理巢式PCR与常规PCR相比，在引物的设计和反应过程中有所不同。

其基本原理可以概括为以下几个步骤： - 第一轮PCR反应：使用外层引物对目标DNA进行扩增。

此外层引物通常选择目标区域的外侧，并且可能包含其他序列，以增加特异性。

- 第一轮PCR反应的产物：第一轮PCR反应产生的产物作为第二轮PCR反应中的模板。

- 第二轮PCR反应：使用内层引物对第一轮PCR产物进行扩增。

内层引物与目标序列更加特异性。

- 巢式PCR的扩增效果：通过两轮PCR的反应，巢式PCR可以在初始模板含量很低的情况下扩增目标序列，从而提高特异性和敏感性。

3. 巢式PCR的应用巢式PCR作为一种高灵敏度和高特异性的PCR技术，广泛应用于各个领域，包括以下几个方面：3.1 遗传疾病诊断巢式PCR可以用于遗传疾病的检测和诊断，通过扩增患者基因组中特定基因的相关序列，可以快速、准确地诊断遗传疾病。

3.2 基因突变分析巢式PCR可以用于检测基因的突变和多态性，例如肿瘤相关基因的突变检测，以及单核苷酸多态性的分析。

通过巢式PCR的特异性扩增，可以准确地检测出基因的突变和多态性。

3.3 病原体检测巢式PCR可以用于病原体的检测，包括细菌、病毒和寄生虫等。

通过选择特定的引物，可以针对目标病原体进行特异性扩增，从而实现对病原体的快速和准确检测。

3.4 基因表达分析巢式PCR可以用于研究基因的表达模式和调控机制。

通过选择特定的引物对目标基因进行扩增，可以分析基因在不同组织和细胞类型中的表达水平和差异。

3.5 DNA指纹分析巢式PCR可以用于DNA指纹分析，即通过扩增特定微卫星标记位点来比较不同个体之间的遗传差异。

2023届高考二轮总复习试题专题8 生物技术与工程命题篇强化练10(专项命题一)

命题篇强化练10(专项命题一)1.[PCR技术及其应用](2022湖北黄冈一模)重叠延伸PCR技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板,通过多次PCR扩增,从而获得目的基因的方法。

某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性,原理如图所示。

下列说法错误的是()注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程①需要模板、含Mg2+的缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶等B.若引物2的突变位点设计为A,则引物3的突变位点应设计为GC.经过过程④获得的杂交DNA有2种,只有其中一种可以经过过程⑤获得目的基因D.以过程⑤获得的目的基因为模板,可以使用引物1和引物4进行PCR2.[PCR技术及其应用](2022天津一模)通过设计引物,运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。

如图为基因工程中获取突变基因的过程,其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对,但不影响引物与模板链的整体配对,反应体系中引物1和引物2的5'端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。

有关叙述不正确的是()A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离的脱氧核苷酸、Taq DNA聚合酶等C.第3轮PCR,引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因D.第3轮PCR结束后,含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/23.[PCR技术及其应用](2022北京一模)小鼠肿瘤转移抑制基因(kissl基因)仅在特定组织中表达。

在雌激素的诱导下,细胞内信号转导分子可以与kissl基因启动子的特定区域结合,激活kissl基因的转录。

研究者扩增了kissl基因启动子不同长度的片段P1、P2、P3和P4,分别构建这些片段与绿色荧光蛋白基因(G)融合的载体,转入体外培养的特定细胞中,在培养液中添加雌激素,以确定不同片段的转录活性。

2012overlap原理总结

∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙∙简单讲，原理如下：引物1（正向）和引物2（反向）扩增产物为A；引物3（正向）和引物4（反向）扩增产物为B，现在欲将产物A和B融合为产物C。

在设计引物时，先按照普通引物设计好，然后在引物2的5’端和引物3的5'端分别加上4-8个碱基（引物2所加的碱基应为产物B的5' 端4-8个碱基序列；引物3所加的碱基应为产物A的3' 端4-8个碱基序列）。

第一轮PCR，先分别用引物1、引物2扩增出片段A；引物3、引物4扩增出片段B。

分别割胶回收产物A和产物B，这样扩增出来的产物A和B会具有相同的末端。

第二轮PCR，用引物1和引物4来扩增，用第一轮的两种扩增产物A和B混合稀释之后为模板，进行扩增。

因为产物A和B有相同重叠的末端，在PCR反应时，模板变性、退火、延伸，就会将A和B融合成产物C。

overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。

所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC 含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。

另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。

前后两段越长越容易形成某种空间结构。

而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。

当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。

如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。

遇到这种情况建议使用TouchDown PCR试试。

TouchDown PCR方法在分子克隆上有介绍。

2019版世纪金榜高三二轮专题生物复习课件PCR技术

PCR技术
原理
①PCR技术利用热变性原理使DNA双链间的氢键断裂，称为变性；而体内DNA复制则是用解旋酶处理 ②DNA双链复制的原理
四种脱氧核苷酸，与体内DNA复制相同碱基互补配对原则，与体内DNA复制相同除模板、原料、酶以外，PCR至少需要液体环境、 PCR仪调控温度和缓冲液三个条件在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，确保实验的准确性；离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；离心10 s的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效果
原料
PCR 技术条件原则 Nhomakorabea装置

2022年高考生物二轮复习核心素养串讲课5 科学探究之PCR

【解析】(1)PCR技术是在体外模拟体内DNA复制过程，利用DNA的热变性原理，替代原有的解旋酶的作用，通过控制温度来控制DNA的解聚(解旋)与结合。 (2)利用PCR技术扩增DNA的过程中还需增加耐高温的DNA聚合酶，DNA聚合酶发挥作用需要提供现成的引物，引物序列和目的基因的两端的碱基互补配对。所用引物Ⅰ为：5'—GTTA—OH，与一段DNA序列中3'—CAATTGGAATC—5' 的3'端互补，故引物Ⅱ要与一段DNA序列中5'—GTTAACCTTAG—3'的3'端互补，故引物Ⅱ为：5'—CTAA—OH。
2.(不定项选择)(2021·潍坊三模)聚合酶链式反应(PCR)是一种用于扩增特定DNA 片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述正确的是 ( ) A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列 B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3'端加上限制酶识别序列 C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化 D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
【解析】选B。新型冠状病毒为RNA病毒，由RNA与蛋白质构成，RT-PCR技术利用病毒RNA进行逆转录获得cDNA，该过程以RNA为模板，脱氧核苷酸为原料，需要逆转录酶进行催化。新型冠状病毒为RNA病毒，遗传物质为RNA，其中含有尿嘧啶核糖核苷酸，A正确；检测过程含有RNA的逆转录与DNA的复制，原料均为脱氧核苷酸，不需要核糖核苷酸，B错误；RT-PCR反应过程中包括 RNA的逆转录与DNA的复制，需要逆转录酶与DNA聚合酶，C正确；相同反应时间内，病毒含量越高，逆转录复制后获得的DNA含量越多，D正确。

2024届高考生物二轮复习教师用书(学案) 第一篇主题五高考热点(五) PCR的应用

PCR的应用随着生物技术的飞速发展，曾经遥不可及的PCR技术逐步走进了高中实验室。

PCR技术应用广泛，如实时荧光定量RT－PCR技术、重叠延伸PCR、大引物PCR、反向PCR、巢式PCR等，高考试题中有关PCR的问题越来越多，设问考查深度也明显提升。

各种PCR技术不是孤立的，它们均以常规PCR为基础，为实现特定目的而进行了一定改进，但也有各自的局限性，因此在必要时可同时使用几种扩增技术，如多重巢式PCR、反向实时荧光定量PCR 等。

在高考备考中，要关注不同扩增技术的本质差异，同时总结此类试题的解答步骤：一是寻找题图有效信息，确定所考PCR类型；二是迅速再忆所考PCR的独特性，猜测出题人可能的意图；三是根据设问对前述猜测进行验证，并领悟出题人挖掘的新考点，进而对知识框架进行完善。

1．实时荧光定量RT－PCR技术检测病毒核酸病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。

实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。

当探针完整时，不产生荧光。

在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q 分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。

2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。

如某科研团队运用重叠延伸PCR 技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。

原理如图：3．PCR定点突变——大引物PCR技术大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。

桥式PCR 原理

桥式PCR 原理桥式PCR（Bridge PCR）是一种PCR扩增技术，通过引入两个外部引物和两个内部引物，以两轮PCR反应的方式将目标DNA扩增。

在桥式PCR中，目标DNA被分别扩增为两个矩形片段，然后通过第二轮PCR反应桥接起来。

桥式PCR的原理如下：1. 第一轮PCR反应：在第一轮PCR反应中，使用两个外部引物，用于扩增目标DNA的两端。

其中，一个引物与目标DNA的5'端互补，称为外部正向引物（forward primer），另一个引物与目标DNA的3'端互补，称为外部反向引物（reverse primer）。

这两个引物的设计要求遵循PCR的一般原则，如适当的长度（一般为15-30碱基）、适当的GC含量（50-60%）等。

2. 目标DNA的扩增：在第一轮PCR反应中，模板DNA的双链被解旋，外部引物与目标DNA的两端结合，DNA聚合酶沿模板DNA合成新的DNA链，产生两个与目标DNA互补的DNA片段。

这两个片段分别包含外部正向引物的扩增产物和外部反向引物的扩增产物。

3. 第二轮PCR反应：在第二轮PCR反应中，为了将两个扩增片段桥接在一起，需要引入两个内部引物，即内部正向引物（forward internal primer）和内部反向引物（reverse internal primer）。

这两个内部引物各自与外部两个扩增片段中的其中一个片段互补。

4. 内部引物的扩增：在第二轮PCR反应中，内部引物与扩增片段互补结合，DNA聚合酶合成新的DNA链，并且扩增片段在两个方向上延伸，形成更长的桥接片段。

这个过程需要适当的条件，如适当的温度，适当的引物浓度等。

5. 桥接产物的扩增：在第二轮PCR反应中，桥接片段作为目标DNA，通过内部引物的扩增，得到更长的扩增产物。

这些扩增产物包含了外部引物和内部引物之间的片段，相对较长。

桥式PCR的特点如下：1. 扩增产物长度可控：通过合理设计外部引物和内部引物的位置，可以控制桥接产物的长度。

高三二轮复习生物PCR引物设计和定点突变课件

(1)已知t-PA蛋白第84位是半胱氨酸,相应
引物b与上链相同，是G
的基因模板链(图中t-PA基因的上链)上的
碱基序列是ACA，丝氨酸的密码子是
AGA UCU。重叠延伸PCR示意图中的黑点表示突变部位的碱基，引物b中该部位的碱
基是__G____，引物c该部位的碱基是__C____。
PCR中需要引物的原因是
引物的设计：引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 ①引物的5’端能与模板链的3’端进行碱基互补配对
②引物之间或引物内部，不能发生互补配对
⑤
⑥
5`
①
② 3` 5`
3`
目的基因
3`
③
④
5`
⑦
⑧
扩增目的基因用：扩增目的基因两侧的序列用：检测目的基因是否正向插入载体用：
②③ ①④ ③⑥
让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE 三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进
行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者
免疫缺陷产生的机制是
。
IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化
如下图1所示。回答下列问题：
(2)从P2，P3两种引物的角度分析，LTB和
ST1基因能够融合的关键是R1和PCR2
不能在同一个反应体系中进行，原因是：引物之间的结合会干扰引物和模板链
(3的)②结过合程，从而影（响填PC“R需过要程”或“不需要
”）加入引不物需，要原因是
。
两条母链的起始段位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3'端

双重pcr的原理

双重pcr的原理双重PCR（Nested PCR）是一种PCR技术的扩展应用，在常规PCR的基础上增加了一轮反应。

通过两轮PCR反应的相互配合，可以提高PCR的特异性和敏感性，用于检测稀有DNA序列或低拷贝数的目标序列。

双重PCR的原理如下：第一轮PCR：第一轮PCR反应与常规PCR无异，包括DNA模板、引物和核酸酶切的引物标记片段。

在第一轮PCR中，引物被设计成覆盖目标序列的外部区域，但不会扩增目标序列。

该反应的主要目的是扩增出外部区域的DNA片段。

第一轮PCR的条件和步骤与常规PCR相同，包括变性、退火和延伸。

第一轮PCR的产物：第一轮PCR扩增出的产物是外部区域的DNA片段，其中也含有一部分内部区域的序列。

第二轮PCR：在第一轮PCR的基础上，将外部区域的扩增产物作为第二轮PCR 的模板。

第二轮PCR中，引物被设计成覆盖目标序列内部区域，包括第一轮PCR 产物中的一部分序列和目标序列内部的部分序列。

第二轮PCR的条件和步骤与常规PCR相同。

第二轮PCR的产物：第二轮PCR扩增出的产物是目标序列的内部区域的DNA 片段，该片段不仅包括外部区域的序列，还包括目标序列的内部序列，因此对目标序列具有更高的特异性和敏感性。

双重PCR的优势：1. 提高特异性：双重PCR通过两轮反应的设计，可以根据目标序列的内外部特征，设计引物对目标序列进行两次扩增，从而提高特异性。

第一轮PCR扩增出的产物作为第二轮PCR的模板，能够排除非特异性的扩增产物，从而提高特异性。

2. 提高敏感性：双重PCR的第一轮扩增从较大的模板中选择性扩增出目标片段的外部片段，然后将该片段作为第二轮PCR的模板，连续扩增出目标片段的内部片段。

通过两次扩增的方式，可以从稀有的目标序列或低拷贝数的样本中提高特异性和敏感性。

3. 抑制非特异性扩增：由于引物的设计更具有特异性，双重PCR可以避免非特异性扩增的问题。

如果只进行常规PCR，存在引物与非目标序列结合扩增的可能性。

高三生物二轮复习高考热点专项练11PCR技术新人教版(2021年整理)

热点11 PCR技术专项专练，突破高考热点大关，冲刺满分!1.下列有关PCR反应的叙述,正确的是（）A。

PCR反应所需要的引物是RNAB.PCR反应所需要的原料是核糖核苷酸C。

PCR反应所需要的酶在60℃会变性D.PCR反应需要在一定的缓冲液中进行【解析】选D。

PCR反应需要的引物是DNA,反应所需要的原料是脱氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高温的，在60℃条件下不会变性。

2。

有关PCR技术,下列叙述不正确的是( )A.用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C。

PCR反应只需一定的缓冲液和DNA模板以及四种脱氧核苷酸D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为高温变性、低温复性、中温延伸【解析】选C。

PCR反应中需要的条件有模板（DNA分子)、原料（4种脱氧核苷酸)、酶（DNA 聚合酶）、引物（DNA片段）和一定的缓冲液等.3.利用PCR技术扩增某DNA片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生( ）世纪金榜导学号73414260A.1次B.2次C.3次D.4次【解析】选B。

PCR技术中，第一次循环产生两个DNA分子，每个DNA分子只有一条链具有引物.第二次循环产生四个DNA分子，其中两个DNA分子只有一条链具有引物,另两个DNA分子两条链都具有引物。

4。

多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

PCR过程一般经历下述三十多次循环:95℃条件下使模板DNA变性、解链→55℃条件下复性(引物与DNA模板链结合）→72℃条件下引物链延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。

下列有关PCR过程的叙述中不正确的是世纪金榜导学号73414261( ）A。

变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现B.复性过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成C。

延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D。

overlap pcr名词解释

overlap pcr名词解释
Overlap PCR（Overlap扩增）是一种用于合成特定DNA序列的
技术，其中两个互补的引物在其3'末端具有重叠的序列。

这种PCR
方法通常用于构建DNA片段、基因克隆、基因突变等实验中。

在Overlap PCR中，两个引物的设计使得它们在3'末端有一段
重叠的序列。

这段重叠序列使得两个引物可以互相结合，并在PCR
反应中扩增出目标DNA序列。

通常，Overlap PCR需要进行两轮PCR
反应。

在第一轮PCR中，两个引物分别与模板DNA的两个相邻片段
结合，扩增出两个片段。

在第二轮PCR中，这两个扩增片段作为模板，再次使用两个引物进行扩增，最终得到目标DNA序列。

Overlap PCR在基因工程和分子生物学研究中具有广泛的应用。

它可以用于构建重组蛋白、插入特定的DNA序列、制备探针等。

通
过设计引物的重叠部分，可以精确控制目标DNA序列的连接方式和
长度，从而实现特定的实验目的。

Overlap PCR的优点包括灵活性高、操作简单、成本低廉等。

然而，也存在一些挑战，如引物设计的准确性、重叠序列的长度选
择等。

因此，在使用Overlap PCR时需要仔细设计引物，优化反应
条件，以确保扩增得到高质量的目标DNA序列。

总结来说，Overlap PCR是一种利用引物的重叠序列在PCR反应中扩增特定DNA序列的技术。

它在基因工程和分子生物学研究中有着广泛的应用，可以用于构建DNA片段、基因克隆、基因突变等实验。

[二轮复习5.1] PCR的原理和多项复杂情景

启示：寻找目的菌种时要 ? 根据微生物对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
考法1 PCR的原理和操作 1. PCR的原理 ① 概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外（体内/体外）复制特定DNA片段核酸合成技术 ② 原理：__D_N__A_ 双链复制。
备注：如果有两个空，可以回答“DNA分子的热变性原理”
考法2 引物的设计（为目的基因添加酶切位点等）
1. 引物的基本要求：引物自身不能环化两种引物之间不能互补配对引物长度不宜过短，防止引物随机结合
2. ③ 两种引物与模板链如何配对？引物的5′端与模板链3′端互补配对
专题五：结合科学前沿的生物科学技术专题
[高考揭秘] 从3年高考试题来看，高考命题思路常以某一生产生活或医学治疗为背景，内容考察内容几乎都与基因工程相关，也就是是说，即便主体是考察微生物培养，它仍然能够涉及微生物的转基因，所以我们这一块的复习一定要紧紧围绕基因工程，在复习中从以下几方面内容发力，还需多做新情景，将会收到良好的效果。 ① PCR为目的基因提供酶切位点等内容相对困难，需要做全方位梳理 ② 基因工程难度大，需要多练限制酶选择，正反接检测和基因编辑等情景 ③ 微生物的选择和鉴别是核心考点，结合基因工程改造近几年命题趋势 ④ 细胞工程和胚胎工程：常以中国最新的技术为背景考察。 ⑤ 热点考察：新冠检测相关技术，酵母双杂等复杂情景 (题目主要来源：2019-2022年山东、湖南、湖北、河北、北京、广东卷)
2）生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是__D_N__A__解__旋___酶__。在体外利PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是__加__热__至___9_0_℃___以__上_____。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的____氢__键_______。

二轮复习微专题PCR中的引物

1.引物存在的必要性
DNA的复制需要引物
例1（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题;PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 ______________。
答案：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合至双链 DNA 片段的引物链上。
2.引物的设计
引物的处理
由于引物延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，引物5'端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5'端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经 PCR扩增的目的基因能与运载体正常结合，需要在 2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列。在 2种引物的5'端上添加不同的限制酶识别序列，是为了保证目的基因定向插入运载体并可避免目的基因自身环化。
随机选取F2植株若干，提取各植株的总DNA ，分别用引物“Ⅰ+Ⅲ”组合及“Ⅱ+Ⅲ”组合进行PCR，检测是否扩增（完整的T-DNA过大，不能完成PCR）。如果引物“I+Ⅲ”组及“Ⅱ+Ⅲ”组进行PCR 均可完成扩增，则相应植株的基因型为____。如果_______________，则相应植株的基因型为_____________；如果_______________，则相应植株的基因型为______________。
高中生物二轮复习微专题·PCR引物
PCR技术中“引物”归类分析
PCR技术中“引物”归类分析
01 引物存在的必要性 02 引物的设计 03 PCR循环时与引物相关的计算 04 引物的选择和互补链的判断
05 引物与PCR反应时复性温度和时间的关系