浅谈PCR技术的发展

浅谈PCR技术的发展与创新历程

姓名：娄旭学号：201218010015088单位：植物逆境生物学研究中心

PCR又称聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction )，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断。PCR的问世，引起了一场分子生物学的革命，它大大加快了各种生物基因组结构研究的过程，有力地推动了现代生物学由细胞水平向分子水平、基因水平的发展，在分子生物学史上具有跨时代的意义。

首先，我们来了解一下PCR技术的基本原理。PCR技术是一种选择性体外扩增DNA 片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。所谓引物就是与待扩增DNA 片段两翼互补的寡核苷酸。待扩增DNA模板加热变性后，两引物分别与两条DNA的两翼序列特异复性。在合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物介导的DNA合成，即引物的延伸。一个变性，退火，延伸的过程就是一个循环，PCR就是在合适条件下这种循环的不断重复，每一循环所得到的产物又可作为下一循环的模板，以此类推，以后每一循环模板均比前一循环增加一倍，理论上讲，PCR扩增DNA产物是呈指数上升的。简单来说，PCR就是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

接下来，我们来了解一下PCR技术产生的背景。20世纪70年代，“遗传工程”、“重组DNA”和“克隆”等科学技术进步产物的兴起，使生物技术产业炙手可热，它以效率和创造性为标志，为科学和商业提供了声望和商机，在科学进展与新产品开发和卫生保健行业发展直接挂钩的投资氛围下，分子生物学在美国蓬勃发展起来，也产生了孕育PCR技术的大环境：（1）“重组工程”和其他分子技术的重大突破；（2）具备了鼓励科研成果快速向应用问题转化的法规环境；（3）政府资助的研究与寻求投资的风险资本密切结合，为分子生物学的研究和开发奠定了雄厚的基础。由此，在对核酸研究了将近100年后，人们开始致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。但由于当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物，且当时Smith等发现了DNA限制性内切酶，使体外克隆基因成为可能，所以，使Khorana等的早期设想被人们遗忘。1985年美国PE-Cetus 公司人类遗传研究室的Mullis等发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应：在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件---模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变性、复性及延伸的温度与时间，并推出了第一台热循环PCR仪。Mullis也由此获得了1993年的诺贝尔化学奖。

从最初技术设想的提出到目前各种PCR方法的应用，PCR技术在分子生物学中已经有了四十多年的历史，短短四十年中，PCR及其相关技术的发展速度是惊人的。国际上分别于1988年和1990年在美国和英国召开了第一届和第二届PCR技术专题研讨会。第一届会议主要讨论了PCR的应用与技术本身的优化问题；第二届会议的主要议题是人类基因组计划与PCR的最新进展。这充分体现了生物学家对PCR的重视。接下来，本人就PCR技术

的发展历程和技术创新做简要的介绍。根据各阶段PCR技术的方法和手段，可以将其发展历程分为以下四个阶段。

（一）初创期

Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：（1）引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。（2）Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow 酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA 片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

技术创新过程：1988年Saiki 等从美国黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：（1）在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。（2）耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。（3）大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0 Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)，此酶的发现使PCR得到更为广泛的应用。

（二）奠基期

此阶段的PCR技术由于没有可以自动升降温的仪器装置而采用手动或机械操作，三个恒温水浴箱，分别恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃），低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。这样PCR标本就能完成下述形式的热循环：94℃ 30S，58℃ 45S，72℃ 60S，进行40次循环。

这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是：设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR 反应条件，事实表明实验效果还是不错的，但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中，因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰，影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶（某些PCR反应需要多于三个温阶）、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。

创新过程：为改进提高本方法的自动化水平，有人设计了机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献。