CIK逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ERCC1的相关性
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ｏｎ
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｋｉｌｌｅｒ（ＣＩＫ）ｃｅｌｌｓ
ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ＤＤＰ——ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ａ５４９／ＤＤＰ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ
ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ
ｎｆｉｎ，最后５５
ｏＣ
种Ａ５４９细胞及１个Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的９６孔培养 板中加入不同浓度的顺铂（０．５、１、２、４、８、１６、３２ 斗∥ｍＬ），各１００斗Ｌ，每个浓度设置６个复孔，对照 孔加入无菌ＰＢＳ，置３７ ｏＣ，５％ＣＯ，培养箱中培养
２４
１．２．５
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ＥＲＣＣｌ蛋白表达Ａ５４９／
ｅｍ
ｂｌｏｔ测得Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ和蛋白表达量比Ａ５４９细胞高（Ｐ＜０．０５），ＣＩＫ细胞共培养前后Ａ５４９／ＤＤＰ细
胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ和蛋白表达量无明显变化。结论ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐荮陛，其逆转耐药的机制 与ＥＲＣＣｌ的表达无明显相关性。 ［关键词］肺癌；Ａ５４９细胞；Ｊ＇Ｆｉ４自；耐药逆转；ＣＩＫ细胞 ［中图法分类号］Ｒ７３４．２ ［文献标志码］Ａ ［文章编号］１０００－２７１５（２０１４）０３－０３３８－０５
ｃａｎｃｅｒ；ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａ５４９；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ；ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｃｙｔｏｋｉｎｅ
［基金项目］贵州省科技计划资助项目（ＮＯ：黔科合ＳＹ（２００９）３０５５）。 ［通信作者］李宁，女，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤化疗耐药的逆转，Ｅ
［摘要］目的观察脐血来源的ＣＩＫ细胞对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的耐药逆转作用。并探讨ＣＩＫ逆转耐药机制是否与核苷酸切 除修复交叉互补基因１（ｅｘｃｉｓｉｏｎ
ｒｅｐａｉｒ
ｃｒｏｓｓ
ｃｏｍｐｌｅｎｍｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ
１，ＥＲＣＣｌ）的表达存在相关性。方法采集脐血单个核细
ｍｉｎ。然后吸取中问白膜层，加入５倍体积ＰＢＳ重
悬细胞，１
５００ ｒ／ｒａｉｎ，１０
养液，调零组不接种细胞，余步骤与实验组相同）置
３７
ｍｉｎ，洗涤细胞，最后以含
ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中培养２４ ｈ后，酶联免疫检
５％ＡＢ型血清的ＲＰＭＩ一１６４０培养液重悬细胞，调 整细胞数，分装入培养瓶中，在第０天向其中加入 ＩＦＮ一吖，使其终浓度为１
ＣＩＫ细胞的诱导及培养于我院产科手术
室无菌条件下采集脐血约５０ ｍＬ，肝素抗凝，于超
净台内将脐血缓慢加入到盛有人淋巴细胞分离液 的离心管中，脐血与人淋巴细胞分离液的比例约为 ２：１，放入低速冷冻离心机中离心２
０００ ｒ／ｒａｉｎ，２５
１０：１；２０：１；４０：１；８０：１，每组设６个复孔，同时设对
照组和调零组（对照组不加ＣＩＫ细胞，加等体积培
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＤＤＰ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ２．３９１．ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｒｅ—
ｖｅｒｓａｌ ｆｏｌｄ ｏｆ ３．９６７．Ｔｈｅ ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ Ａ５４９
・３３８・
Baidu Nhomakorabea万方数据
３期
田昕等・ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，目前缺乏简单 有效的早期检查方法，因此，约２／３的患者确诊时
１材料与方法
１．１
已经出现远处转移，无手术机会，化疗是其主要的
治疗手段，化疗耐药是亟待解决的问题。肿瘤耐药 是多因素参与的过程，其生物化学机制有很多，
ｃｒｏｓｓ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ
１（ＥＲＣＣｌ）
ｔｏ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｎｌｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｂｅ—
ｃｏｍｅ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ．ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ
ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ，Ｔｈｅ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｕｎｙｉ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ
５６３０９９，Ｃｈｉｎａ）
山羊抗兔ＩｇＧ／辣根酶标记，中杉金桥生物技术有 限公司，ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒、ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝 胶配制试剂盒，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司。ＰＣＲ引物，由
ＴａＫａＲａ公司合成（见表１）。
确ＣＩＫ对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药的逆转作用，并探讨
这种逆转作用是否与ＥＲＣＣｌ有关。
表１基因引物序列
１．２
方法
别为５ ｔｘＬ／１０６个细胞、１００、３００ Ｕ／ｍＬ。之后每３ Ａ５４９细 天更换新鲜培养液，同时补加ＩＬ一２，并调整细胞浓 度。置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ，孵箱中培养，２周后收获细 胞。
万方数据
遵义医学院学报
３７卷
ｏＣ
养板，其中，Ａ５４９／ＤＤＰ细胞接种于２个９６孔培养 板，设置调零孔，不加细胞，加入等体积培养液。置
于３７ ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中培养过夜。次日向已接
反应条件为：９５
６０ ｏＣ ４５
１４ ｎｆｉｎ。
２ｒａｉｎ预变性，然后按９５
ｏＣ
１
ｏＣ
１５
Ｓ，
Ｓ，共４０做个循环；９５
作用于Ａ５４９／ＤＤＰ细胞．检测其ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ及 蛋白的表达情况，与未予ＣＩＫ干预组进行比较，明
—ＰＣＲ反转录试剂盒，Ｔａｋａｒａ公司；ＥＲＣＣｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｉ—ｂｅｔａ Ａｃｔｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；Ｒａｂｂｉｔ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；
胞经细胞因子体外诱导获得ＣＩＫ细胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｃｅｌｌｓ，ＣＩＫ），ＭＴＴ法检测顺铂（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ＤＤＰ）对Ａ５４９细胞和
ＲＴ—ＰＣＲ
Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的体外杀伤作用，以及ＣＩＫ细胞与Ａ５４９／ＤＤＰ细胞共培养前后对ＤＤＰ敏感性的变化。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
法检测Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ的表达情况。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测 Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ蛋白的表达情况。结果Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ耐 药，耐药指数为２．３９１。ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药性，逆转倍数为３．９６７。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ、Ｗｅｓｔ—
ＤＤＰ细胞消化后进行细胞计数，调整两瓶细胞数一
致，向其中一个培养瓶中加入无毒剂量的ＣＩＫ细胞
（效靶比１０：１），另一培养瓶加等体积培养液，继续 培养２４ ｈ，ＰＢＳ洗涤细胞３遍，吸干液体后每瓶加 入４００¨Ｌ含ＰＭＳＦ的细胞裂解液，冰上裂解３０
０００
测仪０Ｄ４９０ ｎｎｌ处测量各孔吸光度值，通过线性回
归计算出ＩＣｌＯ值。②分别取对数生长期的Ａ５４９
及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓 度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔培
．３３９．
Ｕ／ｍＬ，第１天加入抗
人ＣＤ３单克隆抗体、ＩＬ一１０Ｌ、ＩＬ一２，使其终浓度分
第３７卷第３期 ２０１４年６月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ
遵义医学院学报 Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖ０１．３７
ＮＯ．３
Ｊｕｎ．２０１４
临床医学研究
ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌－幺￥Ｂｆｉ对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性
田
昕，李
宁，李
冉
（遵义医学院附属肿瘤医院胸部肿瘤科，贵州遵义５６３０９９）
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＤＰ ａｇａｉｎｓｔ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
ｔｏ
Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ＣＩＫ
ＤＤＰ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＣＩＫ．
Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＥＲＣＣｌ ｉｎ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ，Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｎｌ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ
系统，ＢＩＯ—ＲＡＤ公司；ＮＤ一２０００核酸蛋白测定
修复的限速步骤，ＥＲＣＣｌ为ＮＥＳ中ＤＮＡ损伤识别
和链问切割的关键基因，ＥＲＣＣｌ表达上调可致肿
瘤细胞ＤＮＡ修复加快，导致耐药ｕ Ｊ。细胞因子活
仪，Ｔｈｅｍｌｏ公司；注射用顺铂（冻干型），齐鲁制药
有限公司；ＭＴＴ，ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；抗人ＣＤ３单克隆抗 体、ＩＦＮ一吖、ＩＬ一２，ｓｉｇｍａ—ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＩＬ一１０ｔ， ｐｒｏｓｐｅｃ公司；人淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制 品科技有限责任公司；ＲＮＡｉｓｏ
１．２．３
１．２．１
Ａ５４９及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的培养
胞及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞均采用改良型ＲＰＭＩ一１６４０ 培养基，向其中加入胎牛血清及青链霉素配制的双 抗，置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ：孵箱中培养。０．２５％胰蛋 白酶消化传代。
１．２．２
ＭＴＴ法检测耐药逆转倍数①取对数生长
期的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞 浓度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔 培养板，置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ，培养箱中培养过夜。 次日早上向其中加入ＣＩＫ细胞，效靶比分别为５：１；
Ｐｌｕｓ、Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＲＴ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎ—
化的杀伤细胞被认为是新一代肿瘤过继治疗的首
选方案之一。近年来，有学者发现ＣＩＫ能逆转肿 瘤耐药，其逆转耐药的机制涉及了多种蛋白质及通
路的改变，ＥＲＣＣｌ作为介导耐药的重要基因，是否 也能被ＣＩＫ所改变从而实现耐药的逆转，是我们 需要思考的问题。因此，本研究通过在体外用ＣＩＫ
ａｎｃｅ
ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔ—
ｅｘ—
ｏｆ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＤＤＰ ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ＥＲＣＣｌ
ｐｒｅｓｓｌｏｎ・
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｌｕｎｇ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｌｌ Ｓ
Ｓｔｕｄｙ
ｏｎ
ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＥＲＣＣｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｒｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃｙ—
ｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ—．ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｃｉｓｏｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ Ｃｅｌｌｓ Ｔｉａｎ Ｘｉｎ．丘Ｎｉｎｇ．丘Ｒａｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｅｒｅａｓ
ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＣＣ １
ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎｓ ｉｎ
ｒｅｖｅｒｓｅ
Ａ５４９／ＤＤＰ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ Ａ５４９／ＤＤＰ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＣＩＫ ｃｏｕｌｄ
主要实验材料
１．１．１实验细胞Ａ５４９细胞和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞 购自中国医学科学院肿瘤细胞库。
ＤＮＡ修复机制是目前研究较多的机制之一，核酸
切除修复（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｅｘｃｉｓｉｏｎ
１．ｅｐａｉｒ，ＮＳＥ）为ＤＮＡ
１．１．２主要试剂及仪器ｉＭａｒｋ“”Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、 ＭＩＮＩ电泳系统、Ｃｈｅｍｉ ＤｏｓＸＲＳ电泳凝胶成像分析
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｋｉｌｌｅｒ（ＣＩＫ）ｃｅｌｌｓ
ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ＤＤＰ——ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ Ａ５４９／ＤＤＰ ａｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅ
ｗｈｅｔｈｅｒ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｓｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ
ｎｆｉｎ，最后５５
ｏＣ
种Ａ５４９细胞及１个Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的９６孔培养 板中加入不同浓度的顺铂（０．５、１、２、４、８、１６、３２ 斗∥ｍＬ），各１００斗Ｌ，每个浓度设置６个复孔，对照 孔加入无菌ＰＢＳ，置３７ ｏＣ，５％ＣＯ，培养箱中培养
２４
１．２．５
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测ＥＲＣＣｌ蛋白表达Ａ５４９／
ｅｍ
ｂｌｏｔ测得Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ和蛋白表达量比Ａ５４９细胞高（Ｐ＜０．０５），ＣＩＫ细胞共培养前后Ａ５４９／ＤＤＰ细
胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ和蛋白表达量无明显变化。结论ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐荮陛，其逆转耐药的机制 与ＥＲＣＣｌ的表达无明显相关性。 ［关键词］肺癌；Ａ５４９细胞；Ｊ＇Ｆｉ４自；耐药逆转；ＣＩＫ细胞 ［中图法分类号］Ｒ７３４．２ ［文献标志码］Ａ ［文章编号］１０００－２７１５（２０１４）０３－０３３８－０５
ｃａｎｃｅｒ；ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａ５４９；ｃｉｓｐｌａｔｉｎ；ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｃｙｔｏｋｉｎｅ
［基金项目］贵州省科技计划资助项目（ＮＯ：黔科合ＳＹ（２００９）３０５５）。 ［通信作者］李宁，女，教授，硕士生导师，研究方向：肿瘤化疗耐药的逆转，Ｅ
［摘要］目的观察脐血来源的ＣＩＫ细胞对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的耐药逆转作用。并探讨ＣＩＫ逆转耐药机制是否与核苷酸切 除修复交叉互补基因１（ｅｘｃｉｓｉｏｎ
ｒｅｐａｉｒ
ｃｒｏｓｓ
ｃｏｍｐｌｅｎｍｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ
１，ＥＲＣＣｌ）的表达存在相关性。方法采集脐血单个核细
ｍｉｎ。然后吸取中问白膜层，加入５倍体积ＰＢＳ重
悬细胞，１
５００ ｒ／ｒａｉｎ，１０
养液，调零组不接种细胞，余步骤与实验组相同）置
３７
ｍｉｎ，洗涤细胞，最后以含
ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中培养２４ ｈ后，酶联免疫检
５％ＡＢ型血清的ＲＰＭＩ一１６４０培养液重悬细胞，调 整细胞数，分装入培养瓶中，在第０天向其中加入 ＩＦＮ一吖，使其终浓度为１
ＣＩＫ细胞的诱导及培养于我院产科手术
室无菌条件下采集脐血约５０ ｍＬ，肝素抗凝，于超
净台内将脐血缓慢加入到盛有人淋巴细胞分离液 的离心管中，脐血与人淋巴细胞分离液的比例约为 ２：１，放入低速冷冻离心机中离心２
０００ ｒ／ｒａｉｎ，２５
１０：１；２０：１；４０：１；８０：１，每组设６个复孔，同时设对
照组和调零组（对照组不加ＣＩＫ细胞，加等体积培
ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ＤＤＰ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ２．３９１．ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｒｅ—
ｖｅｒｓａｌ ｆｏｌｄ ｏｆ ３．９６７．Ｔｈｅ ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ Ａ５４９
・３３８・
Baidu Nhomakorabea万方数据
３期
田昕等・ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌细胞对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，目前缺乏简单 有效的早期检查方法，因此，约２／３的患者确诊时
１材料与方法
１．１
已经出现远处转移，无手术机会，化疗是其主要的
治疗手段，化疗耐药是亟待解决的问题。肿瘤耐药 是多因素参与的过程，其生物化学机制有很多，
ｃｒｏｓｓ
ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ
１（ＥＲＣＣｌ）
ｔｏ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｎｌｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｂｅ—
ｃｏｍｅ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ．ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ
ｏｆ Ｔｈｏｒａｃｉｃ，Ｔｈｅ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｕｎｙｉ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ—ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ
５６３０９９，Ｃｈｉｎａ）
山羊抗兔ＩｇＧ／辣根酶标记，中杉金桥生物技术有 限公司，ＢＣＡ蛋白浓度测定试剂盒、ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝 胶配制试剂盒，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司。ＰＣＲ引物，由
ＴａＫａＲａ公司合成（见表１）。
确ＣＩＫ对Ａ５４９／ＤＤＰ细胞耐药的逆转作用，并探讨
这种逆转作用是否与ＥＲＣＣｌ有关。
表１基因引物序列
１．２
方法
别为５ ｔｘＬ／１０６个细胞、１００、３００ Ｕ／ｍＬ。之后每３ Ａ５４９细 天更换新鲜培养液，同时补加ＩＬ一２，并调整细胞浓 度。置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ，孵箱中培养，２周后收获细 胞。
万方数据
遵义医学院学报
３７卷
ｏＣ
养板，其中，Ａ５４９／ＤＤＰ细胞接种于２个９６孔培养 板，设置调零孔，不加细胞，加入等体积培养液。置
于３７ ｏＣ，５％ＣＯ：培养箱中培养过夜。次日向已接
反应条件为：９５
６０ ｏＣ ４５
１４ ｎｆｉｎ。
２ｒａｉｎ预变性，然后按９５
ｏＣ
１
ｏＣ
１５
Ｓ，
Ｓ，共４０做个循环；９５
作用于Ａ５４９／ＤＤＰ细胞．检测其ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ及 蛋白的表达情况，与未予ＣＩＫ干预组进行比较，明
—ＰＣＲ反转录试剂盒，Ｔａｋａｒａ公司；ＥＲＣＣｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｉ—ｂｅｔａ Ａｃｔｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司；Ｒａｂｂｉｔ
Ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｂｅｙｏｔｉｍｅ公司；
胞经细胞因子体外诱导获得ＣＩＫ细胞（ｃｙｔｏｋｉｎｅ
ｃｅｌｌｓ，ＣＩＫ），ＭＴＴ法检测顺铂（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ，ＤＤＰ）对Ａ５４９细胞和
ＲＴ—ＰＣＲ
Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的体外杀伤作用，以及ＣＩＫ细胞与Ａ５４９／ＤＤＰ细胞共培养前后对ＤＤＰ敏感性的变化。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ
法检测Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ ｍＲＮＡ的表达情况。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测 Ａ５４９细胞、Ａ５４９／ＤＤＰ细胞以及ＣＩＫ干预后的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞中ＥＲＣＣｌ蛋白的表达情况。结果Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ耐 药，耐药指数为２．３９１。ＣＩＫ细胞能逆转Ａ５４９／ＤＤＰ细胞对ＤＤＰ的耐药性，逆转倍数为３．９６７。Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ、Ｗｅｓｔ—
ＤＤＰ细胞消化后进行细胞计数，调整两瓶细胞数一
致，向其中一个培养瓶中加入无毒剂量的ＣＩＫ细胞
（效靶比１０：１），另一培养瓶加等体积培养液，继续 培养２４ ｈ，ＰＢＳ洗涤细胞３遍，吸干液体后每瓶加 入４００¨Ｌ含ＰＭＳＦ的细胞裂解液，冰上裂解３０
０００
测仪０Ｄ４９０ ｎｎｌ处测量各孔吸光度值，通过线性回
归计算出ＩＣｌＯ值。②分别取对数生长期的Ａ５４９
及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓 度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔培
．３３９．
Ｕ／ｍＬ，第１天加入抗
人ＣＤ３单克隆抗体、ＩＬ一１０Ｌ、ＩＬ一２，使其终浓度分
第３７卷第３期 ２０１４年６月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ
遵义医学院学报 Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｖ０１．３７
ＮＯ．３
Ｊｕｎ．２０１４
临床医学研究
ＣＩＫ逆转耐顺铂人肺腺癌－幺￥Ｂｆｉ对顺铂耐药与ＥＲＣＣｌ的相关性
田
昕，李
宁，李
冉
（遵义医学院附属肿瘤医院胸部肿瘤科，贵州遵义５６３０９９）
ｅｖａｌｕａｔｅ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＤＤＰ ａｇａｉｎｓｔ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ
ｔｏ
Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ＣＩＫ
ＤＤＰ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅ ｗｉｔｈ ＣＩＫ．
Ｔｈｅ ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＥＲＣＣｌ ｉｎ Ａ５４９ ｃｅｌｌｓ，Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａ５４９／ＤＤＰ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＲＴ—ＰＣＲ ａｎｄ ｗｅｓｔｅｎｌ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ
系统，ＢＩＯ—ＲＡＤ公司；ＮＤ一２０００核酸蛋白测定
修复的限速步骤，ＥＲＣＣｌ为ＮＥＳ中ＤＮＡ损伤识别
和链问切割的关键基因，ＥＲＣＣｌ表达上调可致肿
瘤细胞ＤＮＡ修复加快，导致耐药ｕ Ｊ。细胞因子活
仪，Ｔｈｅｍｌｏ公司；注射用顺铂（冻干型），齐鲁制药
有限公司；ＭＴＴ，ｓｏｌａｒｂｉｏ公司；抗人ＣＤ３单克隆抗 体、ＩＦＮ一吖、ＩＬ一２，ｓｉｇｍａ—ａｌｄｒｉｃｈ公司；ＩＬ一１０ｔ， ｐｒｏｓｐｅｃ公司；人淋巴细胞分离液，天津灏洋生物制 品科技有限责任公司；ＲＮＡｉｓｏ
１．２．３
１．２．１
Ａ５４９及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞的培养
胞及Ａ５４９／ＤＤＰ细胞均采用改良型ＲＰＭＩ一１６４０ 培养基，向其中加入胎牛血清及青链霉素配制的双 抗，置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ：孵箱中培养。０．２５％胰蛋 白酶消化传代。
１．２．２
ＭＴＴ法检测耐药逆转倍数①取对数生长
期的Ａ５４９／ＤＤＰ细胞，制成单细胞悬液，调整细胞 浓度为１×１０４个／ｍＬ，以每孔１００¨Ｌ接种于９６孔 培养板，置于３７ ｏＣ，５％ＣＯ，培养箱中培养过夜。 次日早上向其中加入ＣＩＫ细胞，效靶比分别为５：１；
Ｐｌｕｓ、Ｒｅａｌ—Ｔｉｍｅ ＲＴ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎ—
化的杀伤细胞被认为是新一代肿瘤过继治疗的首
选方案之一。近年来，有学者发现ＣＩＫ能逆转肿 瘤耐药，其逆转耐药的机制涉及了多种蛋白质及通
路的改变，ＥＲＣＣｌ作为介导耐药的重要基因，是否 也能被ＣＩＫ所改变从而实现耐药的逆转，是我们 需要思考的问题。因此，本研究通过在体外用ＣＩＫ
ａｎｃｅ
ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔ—
ｅｘ—
ｏｆ Ａ５４９／ＤＤＰ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＤＤＰ ａｎｄ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ＥＲＣＣｌ
ｐｒｅｓｓｌｏｎ・
［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ］ｌｕｎｇ
ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｌｌ Ｓ
Ｓｔｕｄｙ
ｏｎ
ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＥＲＣＣｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｒｃｈａｎｉｓｍｓ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｃｙ—
ｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ—．ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｃｉｓｏｌａｔｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ａ５４９／ＤＤＰ Ｃｅｌｌｓ Ｔｉａｎ Ｘｉｎ．丘Ｎｉｎｇ．丘Ｒａｎ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ
ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｅｒｅａｓ
ｔｈｅｒｅ ｗａｓ
ｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＣＣ １
ｍＲＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｏｓｓｉｏｎｓ ｉｎ
ｒｅｖｅｒｓｅ
Ａ５４９／ＤＤＰ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ Ａ５４９／ＤＤＰ ＣＯ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｗｉｔｈ ＣＩＫ ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＣＩＫ ｃｏｕｌｄ
主要实验材料
１．１．１实验细胞Ａ５４９细胞和Ａ５４９／ＤＤＰ细胞 购自中国医学科学院肿瘤细胞库。
ＤＮＡ修复机制是目前研究较多的机制之一，核酸
切除修复（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｅｘｃｉｓｉｏｎ
１．ｅｐａｉｒ，ＮＳＥ）为ＤＮＡ
１．１．２主要试剂及仪器ｉＭａｒｋ“”Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、 ＭＩＮＩ电泳系统、Ｃｈｅｍｉ ＤｏｓＸＲＳ电泳凝胶成像分析