胚胎干细胞的培养及其影响因素
干细胞应用安全性及其影响因素的研究
干细胞应用安全性及其影响因素的研究摘要：目前，对于干细胞的研究局限于干细胞应用引发的安全性问题，对于影响干细胞安全性因素的研究甚少，或仅局限于其中一种因素的分析。
现就干细胞应用安全性及其影响因素的研究进行综述，以综合分析各影响因素及其之间的相互作用、评估干细胞治疗技术的效果，并有望在未来拓宽干细胞应用的领域，提高其临床治疗的安全性，为疾病治疗提供更有效的治疗手段。
关键词：干细胞；安全性；致瘤性；影响因素1干细胞临床应用的安全性干细胞治疗临床应用中存在致瘤性、移植物抗宿主病(GVHD)、血栓等安全性问题，其中以致瘤性为主。
干细胞可能具有促进肿瘤发生的作用，一般可分化成畸胎瘤、畸胎癌和继发性肿瘤，干细胞在应用前多经过连续传代扩增，长期的体外培养导致细胞端粒长度变化，染色体不稳定性增加，易引发基因突变，最终导致细胞恶性转化；除致瘤性问题外，干细胞移植还会发生GVHD；此外，血栓问题也偶有发生，因为干细胞输入体内后易分布在肺、脾、肾和皮肤等血供丰富的器官，当大量干细胞在脏器内滞留时，可导致局部小血管内血栓形成。
除上述安全性问题外，变态反应、头痛、腰痛等也有发生，但一般不会对患者产生严重影响，一段时间后症状可自行消失。
2影响干细胞临床应用安全性的因素2.1干细胞种类目前广泛应用于临床的干细胞主要有间充质干细胞(MSCs)、胚胎干细胞(ESCs)、诱导多能干细胞(iPSCs)等，其中以MSCs为主。
干细胞临床应用的安全性因干细胞种类不同而有所差异，MSCs主要引发致瘤性和血栓，造血干细胞(HSCs)则主要引起GVHD，而ESCs及iPSCs主要促进畸胎瘤的发生发展。
MSCs是成体、成纤维细胞样的多能细胞，来源广泛、易于分离和扩增、免疫原性低，具有旁分泌和广泛的免疫调节能力，可从多种成人和胎儿组织(如骨髓、脂肪、脐带血、胎儿肺、胎盘、羊水)中分化而来，在疾病治疗和组织工程等方面具有广阔的应用前景。
其中，以骨髓间充质干细胞(BMSCs)，脐带间充质干细胞(UC-MSCs)及脂肪间充质干细胞(ADMSCs)的临床应用最为广泛。
小鼠胚胎干细胞培养
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展
04
胚胎干细胞体外诱导分化的应用前景
疾病治疗与药物筛选
疾病治疗
胚胎干细胞具有多向分化潜能，可分化为特定类型的细胞，如神经细胞、心肌细 胞等，为疾病治疗提供了新的途径。例如，通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞 ，可以用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病等神经系统疾病。
药物筛选
胚胎干细胞可在体外培养扩增，为药物筛选提供了大量的实验样本。通过比较胚 胎干细胞在药物处理前后的分化过程和表型变化，可以评估药物的疗效和副作用 ，为新药研发提供有力支持。
表观遗传修饰
表观遗传修饰可以影响胚 胎干细胞的分化，如DNA 甲基化、组蛋白乙酰化等 。
03
胚胎干细胞体外诱导分化方法
化学诱导分化方法
化学诱导分化是利用化学物质 调节胚胎干细胞的分化过程。
常用的化学物质包括细胞因子 、激素、小分子化合物等。
这些化学物质通过调节胚胎干 细胞的基因表达、信号转导等 途径，诱导细胞定向分化。
组织工程与器官移植
组织工程
胚胎干细胞具有发育成各种组织的潜力，为组织工程提供了理想的基础材料。例如，可以诱导胚胎干细胞分化 为软骨、肌肉、血管等组织，用于修复或替换受损的组织器官。
器官移植
胚胎干细胞可分化为多种器官细胞，为器官移植提供了新的来源。与传统的器官移植相比，胚胎干细胞诱导分 化的器官具有更好的组织匹配性和更少的不良反应，有望成为解决器官短缺和提高移植效果的重要途径。
研究方法
采用体外培养胚胎干细胞的方法，通过添加不同的诱导因子 或采用特殊的培养条件，观察细胞的分化过程和分化产物的 特性，同时结合分子生物学、细胞生物学等技术手段分析相 关机制。
02
胚胎干细胞特性与分化机制
胚胎干细胞特性
干细胞的基础知识
干细胞的基础知识干细胞的基础知识干细胞的概念干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。
它包括胚胎干细胞和成体干细胞。
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。
目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。
最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。
在胚胎的发生发育中，单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官。
在成年动物中，正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生。
胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果。
胚胎干细胞是全能的，具有分化为几乎全部组织和器官的能力。
而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性，只能分化成特定的细胞或组织。
然而，这个观点目前受到了挑战。
最新的研究表明，组织特异性干细胞同样具有分化成其他细胞或组织的潜能，这为干细胞的应用开创了更广泛的空间。
干细胞具有自我更新能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。
干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。
1.1 胚胎干细胞胚胎干细胞（Embryonic Stem cell, ES细胞）当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。
胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。
早在1970年Martin Evans已从小鼠中分离出胚胎干细胞并在体外进行培养。
而人的胚胎干细胞的体外培养直到最近才获得成功。
进一步说，胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。
它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，包括生殖细胞。
研究和利用ES细胞是当前生物工程领域的核心问题之一。
ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代，由于畸胎瘤干细胞（EC细胞）的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。
目前许多研究工作都是以小鼠ES细胞为研究对象展开的，如：德美医学小组在去年成功的向试验鼠体内移植了由ES细胞培养出的神经胶质细胞。
动物克隆 第三章胚胎干细胞分离培养
第三章胚胎干细胞分离培养1981年，Evens等首次发现小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)在体外具有稳定增殖并维持未分化状态及分化全能性潜能的特性，并成功建立小鼠ESCs系[1]。
由于ESCs独特的生物学特性，ESCs方面的研究迅速成为生命科学研究领域的热点之一，1999年－2000年连续两年被评为世界十大科技新闻。
ESCs已成为分子遗传学、发育生物学、细胞工程、组织工程等研究的重要工具，在研究细胞分化机制、临床治疗、转基因等方面有着重要的意义。
随着对干细胞研究的不断深入，人们将逐渐掌握和利用干细胞，还将推动相关学科的发展。
文章综述了ESCs的研究概况、体外分离培养、生物学特性、鉴定方法、影响ESCs分离培养的因素、存在问题以及应用前景等。
1 胚胎干细胞研究概况ESCs的研究最早要追溯到畸胎瘤细胞的发现，但真正意义上的开始却是1981年Evens等首先从延缓着床的胚泡分离培养到小鼠的ESCs，并建立小鼠的ESCs系，之后ESCs研究迅速发展，已在大鼠、仓鼠、猪、牛、水貂、兔、山羊、绵羊、恒河猴和人等多种哺乳动物上建立了类ESCs系[2]。
近几年来，ESCs研究在ESCs来源与培养方法、探索建立和维持ESCs系的条件、定向诱导分化、遗传操作、疾病动物模型的治疗等方面取得了一定的进展。
研究人员利用体细胞核移植技术进行胚胎重建，从克隆胚胎中成功得到小鼠、兔和人等多种哺乳动物ESCs[3-5]；利用孤雌激活技术建立小鼠和非人灵长类孤雌激活胚胎源的ESCs系[6]，这些为ESCs的分离克隆开辟了新的途径。
利用定向诱导分化技术成功将ESCs分化为造血细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞、成骨细胞，甚至滋养层细胞和生殖细胞等所有3 个胚层的细胞类型[7-13]。
试验表明，人ESCs 能有效治疗心肌梗死、糖尿病、中风等疾病。
国内在ESCs方面的研究起步较晚，但发展迅速，在相关领域做了大量的研究。
高考生物真题加练习题 专题32胚胎工程
高考生物真题加练习题专题32 胚胎工程考点胚胎工程考向胚胎工程[2019浙江五校联考,32(二)]回答有关胚胎工程的问题。
(1)“二娃”政策实施后,一些高龄夫妇选择“试管婴儿”技术孕育二胎。
要使精子和卵细胞在体外成功融合,首先须采集到成熟的卵细胞,最常用的方法是卵巢经处理后,使用超声监视器确定卵泡的位置,插入穿刺针吸取卵泡液,取出,在体外进行人工培养,促进其成熟。
同时对于男方提供的精子,须经系列处理与培养,以达到状态。
受精卵形成后,经人工培养至阶段,借助胚胎移植技术将其回输至女方体内,经过自然孕育,即得“试管婴儿”。
(2)胚胎干细胞研究发展前景诱人,其具有发育全能性和二倍体核型。
培养胚胎干细胞的培养基中,必须加入胰岛素、葡萄糖、等成分,并且要将干细胞接种在饲养层上,用于饲养层的细胞一般是。
(3)下列有关胚胎移植的说法错误的是( )A.供体与受体是同一物种的雌性B.受体与供体保持相同的生理状态C.来自供体的胚胎与受体子宫建立正常的生理和组织联系D.多胚胎移植在提高妊娠率的同时,常可获得性状完全相同的孩子答案(1)超数排卵卵母细胞获能8细胞以上的胚胎(2)动物血清胚胎成纤维细胞(3)D方法试管动物与克隆动物的比较[2019浙江十校联考,32(二)]在畜牧生产中,人们利用克隆技术和试管动物技术促进优良畜群繁育并取得了显著成绩,回答以下问题: (1)克隆高产奶牛:从供体高产奶牛体内获得体细胞后,对其进行的初次培养称为;用于核移植的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞,原因是10代以内细胞能保持正常;将供体细胞核注入,形成重组细胞,并促进其发育成早期胚胎,之后将胚胎移入代孕母牛体内,从而获得与(填“供体奶牛”或“受体奶牛”)遗传物质基本相同的犊牛。
(2)试管牛的培育:将体外培养成熟的卵母细胞与经处理的精子在体外受精后,应将受精卵移入一系列含不同成分的培养液中继续培养,通常将胚胎培养至期,取细胞做DNA分析和性别鉴定,并将胚胎移入同种的、生理状态相同的其他雌牛体内,使之继续发育为新个体。
不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响
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技 术 方 法
ห้องสมุดไป่ตู้
不 同饲 养 层对 鸡 胚 胎 干 细胞 培 养效 果 的影 响
陈志胜 ， 丙云 ， 王 黄文 静 ， 陈胜 锋 ， 慧琴 计
佛 山科 学技 术 学院 动 物 医学 系 ， 东 佛 山 ５ ８３ 广 ２２１
［ 摘要 】 目的 ： 为探 索 鸡胚 胎 干 细胞 培 养 的优 化条 件 ， 比较 不 同饲 养 层 对鸡 胚 胎 干 细胞 离体 培养 的效 果 。 法 ： 传 方 用 至第 ２代 的鸡 胚成 纤维 细胞 与 鸭胚 成 纤维 细 胞 ， 丝 裂 霉 素处 理 后 制 作 饲养 层 ， 较 这 ２种 饲 养 层 以及 不用 饲 养 层 经 比
ｃ ｉｋ ｎ ｅ ｂｙ ｎｃ ｆ ｒｂａｔ Ｅ ） ｎ ｕ ｋ ｅ ｂｙ ｎｃ ｆ ｒｂａｔ Ｅ １ｗ ｒ ｓｄ ｔ ｍ ｋ ｅ ｄ ｒ ａ ｅ ｅ ｔ ｉ ｈｃ ｅ ｍ ｒｏ ｉ ｉ ｏ ｌｓ Ｃ Ｆ ａ ｄ ｄ ｃ ｍ ｒｏ ｉ ｉ ｏ ｌｓ Ｄ Ｆ ｅｅ ｕ ｅ ｏ ａ ｅ ｆ ｅ ｆ ｒｔ ａ ｄ ｗ ｔ ｂ （ ｂ （ ｅ ｓ ｔ ｒ ｅ ｈ
［ 键 词 ］ 鸡胚 胎 干细胞 ； 关 饲养 层 ； 胚 成 纤 维细 胞 ； 鸡 鸭胚 成 纤 维细 胞 ［ 中圈分 类 号 】 Ｑ １ ８３ ［ 文献 标 识 码 ］ Ａ ［ 章 编 号ｌ １０ — ０ ２ ０ ０ ３ ０ １ － ３ 文 ０ ９ ０ ０ （ １） — ４ ６ ０ ２ ０
胚胎干细胞在培养条件下会自然分化吗
Ｅ Ｓ Ｃ ｓ 的形态结构是 ： 核大 、 有１ 个或几个核 仁、 细 胞核 中多为常染色质 、 细胞 质少、 结构简单。体外培养 时， 细胞排列 紧密 ， 呈集 落状生 长。在分化 方面 ， Ｅ Ｓ Ｃ ｓ 在解 除分化抑制 的条件下具有能形成包 括生殖腺在 内 的各种组织 的发育潜 力 。将 Ｅ Ｓ Ｃ ｓ 在特定 培养基 进行
・
５ ８ ・
生物 学教学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第１ 期
胚 胎 干 细 胞 在 培 养 条 件 下 会 自然 分 化 吗
窦勇兵 （ 江 苏 省 新 海高 级 中 学 ２ ２ ２ ０ ０ ６ ）
摘 要 本文通过分析影响胚胎 干细胞分化的因素 ， 探讨 了胚胎干细胞在 自然条件下 的分化原理。
培养 ， 可 以定 向分化成特定 组织 ， 如Ｅ Ｓ Ｃ ｓ 在含 有 白血 病抑制 因子 （ Ｌ Ｉ Ｆ ） Ｅ ２ Ｊ 和维生素 Ａ酸 （ Ｋ ａ ） 的培养基上 ，
条件下 ， ｈ Ｅ Ｓ Ｃ ｓ 可分化为 Ｃ Ｄ ３ ４ 的造 血祖 细胞 。上 海 交通大学医学院、 中科 院上海 生命 科 学研究 院 的研 究 人员证实 Ｃ ａ ｌ ｅ ｉ ｎ ｅ ｕ ｒ ｉ ｎ —Ｎ Ｆ Ａ Ｔ信号可 与 Ｅ ｒ ｋ ｌ ／ ２信 号共
子浓度增加 ， Ａ Ｃ ｈ的释放量增加 ， 但细胞外镁离子 浓度 增加能够 明显抑 制 Ａ Ｃ ｈ的释放 ， 由此可知神 经递 质释
６ ． ４ 相 关酶是 否有活性
在突触 间隙分 布有水解神
经递质 的酶 ， 其能够及时水解神 经递质 ， 使神经 递质发
挥作用后 即被 降解 失 活 ， 从 而 达到 准 确调 节 的 目的。 如乙酰胆碱酯 酶能够 及时水解 Ａ Ｃ ｈ ， 从 而使下 一个 神
胚胎发育时期生物体遗传因素的调控机制
胚胎发育时期生物体遗传因素的调控机制生命起源于一粒受精卵，从而经过胚胎发育到最终的成体。
在这个过程中，各种因素协同作用，达到正确的基因表达，从而使胚胎得以正常发育。
但是，在这个过程中，有些生物体遗传因素的调控机制并不十分清楚，需要更深入的研究。
遗传因素的调控机制包含了有丝分裂时期、减数分裂时期、和胚胎发育过程中的调控。
而这些调控机制则包括了DNA甲基化、组蛋白修饰、ncRNA和转录因子等多个方面。
下面将分别从这些方面进行阐述。
DNA甲基化DNA甲基化是真核生物中最重要的表观遗传修饰之一。
它是通过将DNA链上的甲基基团加入到胞嘧啶（C）嘌呤（G）二核苷酸的C上，来确保基因的正常表达。
同时，它也是在胚胎发育期间最早开始的调控机制之一。
研究表明，在人类和鼠类的胚胎发育期间，DNA甲基化的水平高度降低。
而这种降低水平可能会影响到DNA的结构和功能。
此外，在小鼠胚胎干细胞的体内实验中，DNA甲基化的缺失可以导致干细胞的分化和为胚胎提供内胚层和外胚层细胞。
组蛋白修饰组蛋白修饰也是胚胎发育中表观遗传调控机制的重要方面。
组蛋白是DNA最基本的包装蛋白，通过组蛋白修饰可以改变其结构，从而影响到基因的表达。
研究表明，胚胎发育过程中，组蛋白修饰在细胞分化和胚胎干细胞的提取过程中起着非常重要的作用。
例如，在小鼠胚胎干细胞中，组蛋白甲基化的水平可以显著地影响细胞的分化。
此外，组蛋白乙酰化和磷酸化等修饰还可以影响到胚胎实体的形成和分化。
ncRNAncRNA（非编码RNA）是一类不编码编码蛋白质的RNA分子。
在胚胎发育期间，ncRNA被发现在细胞核内和细胞质中起着重要作用。
有关ncRNA在胚胎发育期间所扮演的角色，有很多研究已经表明。
在小鼠的研究中，ncRNA和小RNA的功能主要在转录后调控基因的表达水平和细胞增殖过程中起着作用。
此外，研究人员还发现，其中一些ncRNA可以在胚胎发育的过程中以一种动态的方式的表达，这表明它们在细胞分化和特定细胞型的形成中可能会起到非常重要的作用。
胚胎干细胞的培养原理和方法
胚胎干细胞的培养原理和方法胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）的培养是一个复杂且精细的过程，涉及到多个步骤和原则。
以下是胚胎干细胞培养的基本原理和方法：一、培养原理1.多能性维持：胚胎干细胞具有高度的多能性，即它们有能力分化成体内任何类型的细胞。
培养过程中的一个关键点是维持这种多能性，防止细胞分化。
2.培养环境： ESCs需要特定的培养环境，包括合适的温度、pH值、湿度和气体组成（如CO₂水平）。
3.营养和生长因子：培养基需要包含必要的营养物质和生长因子，以支持细胞的生长和多能性维持。
这些生长因子通常包括利钠、胰岛素以及特定的细胞因子。
二、培养方法1.获取胚胎干细胞：通常从早期胚胎（如囊胚）的内细胞团中分离得到。
2.培养基准备：培养基通常包含高葡萄糖DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium）、胎牛血清（FBS）或者定义的血清替代物、L谷氨酸、非必需氨基酸、抗生素等。
3.生长因子添加：例如添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）来维持多能性。
4.共培养系统：有时使用“给养层”（Feeder Layer）的方法，即在胚胎干细胞下方培养一层辐射灭活的成纤维细胞，以提供必要的支持和营养。
5.无给养层培养：也可使用定义清晰的培养基，不依赖给养层，减少异种蛋白的污染。
6.培养条件控制：保持恒温（通常为37°C）和特定的CO₂水平（通常为5%）。
7.细胞传代：由于ESC会不断增长，需要定期进行传代，避免过度生长和分化。
8.观察和评估：定期检查细胞形态和生长情况，评估是否保持了未分化状态。
三、注意事项1.避免分化：细胞培养过程中要特别注意防止胚胎干细胞的非计划性分化。
2.遗传稳定性：长期培养可能会导致遗传改变，因此要定期检查细胞的染色体和遗传稳定性。
3.伦理问题：胚胎干细胞的研究和应用常伴随着伦理争议，特别是关于胚胎的使用。
这些方法和原则是胚胎干细胞培养的基本框架，但实际操作中可能会根据研究目的和具体条件有所调整。
干细胞提取和培养的操作技巧分享
干细胞提取和培养的操作技巧分享干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有重要的生物学和医学研究价值。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的重要环节，操作技巧对于获得高质量的干细胞至关重要。
在本文中，我将与大家分享一些干细胞提取和培养的操作技巧，希望能对广大科研工作者有所帮助。
一、干细胞的提取技巧1. 选择合适的组织来源：干细胞的提取来源有很多种，如胚胎、胎盘、脐带血、骨髓等。
在选择组织来源时，需要考虑到干细胞的种类与目标研究的需求，以及提取的难度和伦理道德问题等方面因素。
2. 提取方法的选择：干细胞的提取方法有多种，如机械分离、酶消化、磁珠分离等。
在选择提取方法时，需结合组织来源的特点和研究需求进行评估，并优化提取步骤以提高干细胞的纯度和活力。
3. 组织处理和细胞分离：对于一些组织样本，需要进行前处理步骤，如组织粉碎、胶原酶等酶消化处理。
之后，通过离心等方式将细胞分离出来，将干细胞与其他细胞分离开来。
4. 干细胞单克隆的建立：在提取的细胞中，可以通过单克隆化方法建立纯种的干细胞克隆。
单克隆的建立有助于获得高质量的干细胞群体，为后续的研究提供可信的实验样本。
二、干细胞的培养技巧1. 培养基的选择：干细胞的培养基的选择直接影响到细胞的生长和分化。
不同类型的干细胞具有不同的培养基需求，常用的培养基有无血清培养基（serum-free medium）、DMEM/F12培养基等。
在选择培养基时，需综合考虑细胞的生长特性、细胞需求的添加物和研究目的等因素。
2. 培养条件的控制：干细胞的培养需要控制适宜的温度、湿度和气氛等条件。
常见的培养温度为37℃，湿度需要保持适宜的水分，而气氛通常是5%CO2和95%空气的混合气体。
保持恰当的培养条件有助于干细胞的健康生长和维持干细胞状态。
3. 培养基和培养器具的消毒：在干细胞的培养过程中，保持培养基和培养器具的无菌状态是非常重要的。
所有使用的培养器具和培养基应经过严格的消毒处理，以防止有害细菌或真菌的污染。
2020届人教版胚胎工程单元测试(1)
胚胎工程一、选择题1．在生物工程中，所用物质和其发挥的作用组合正确的是( )A．Ca2＋——诱导精子和卵细胞结合B．胃蛋白酶——动物细胞培养时分散细胞C．聚乙二醇——诱导细胞分化D．促性腺激素——促进供体母畜超数排卵【答案】D【解析】用钙离子处理能使大肠杆菌处于感受态，利于目的基因的导入；动物细胞培养时分散细胞用的是胰蛋白酶或胶原蛋白酶；聚乙二醇能诱导细胞的融合；促性腺激素能促进供体母畜超数排卵。
2．关于哺乳动物早期胚胎发育的叙述正确的是( )A．合子形成后立即进入子宫内进行有丝分裂B．卵裂时随着细胞数目的增加胚胎总体积也随之增大C．桑椹胚阶段的每个细胞都属于全能细胞D．内细胞团将来发育成胎盘和胎膜【答案】C【解析】合子在输卵管内形成后就开始进行有丝分裂；卵裂期细胞的数量不断增加，但胚胎的总体积并不增加，甚至略有缩小；滋养层将发育为胎盘和胎膜，内细胞团发育为胎儿各种组织。
3．下列说法符合胚胎移植生理学基础的是( )A．供、受体的发情时间要一致，才能使胚胎在移植前后所处的生理环境保持一致B．供体胚胎移入受体子宫的位置，应与在供体内的位置相同或相似C．受体子宫与外来胚胎发生排斥反应，是胚胎移植过程需要重点克服的难题D．胚胎移植产下的个体在遗传性状上与受体母畜相似【答案】A4．利用下列细胞工程技术培养出的新个体中，只具有一个亲本遗传性状的是( )①组织培养②细胞融合③动物胚胎移植④克隆羊技术A．①② B．②③C．① D．①④【答案】C【解析】组织培养是由同一种生物的细胞进行分裂分化形成新个体，属于无性生殖，因而新个体中具有一种亲本的遗传性状。
细胞融合是由两个细胞融合到一起，融合后的细胞同时具有原来两个细胞的遗传物质。
动物胚胎移植本质仍是有性生殖，只不过当受精卵卵裂到一定阶段后找一个代孕场所，同样具有两个亲本的遗传性状。
克隆羊技术中“多利”的产生是指把乳腺细胞的细胞核移植到另一个去核的卵母细胞中，发育形成新个体的基因主要来自乳腺细胞的细胞核，也有少数基因来自卵母细胞线粒体中的DNA。
干细胞的建系
干细胞的建系干细胞(stem cells, SC）是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。
可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞）和成体干细胞（somatic stem cell)。
干细胞系的建立，对讨论基因在分化发育过程中的表达与调控，建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，以及制备人类疾病动物模型等讨论具有重大意义。
目前，小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟。
一、干细胞分别材料的猎取与处理按照干细胞所处的发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。
①胚胎干细胞(ES细胞）是一种高度未分化细胞。
它具有发育的全能性，能分化出成体的全部组织和器官。
可由哺乳动物的囊胚内细胞群或者床后胚胎组织生殖嵴的原始生殖细胞（primordial germ cells, PGCs）中分别获得。
②成体干细胞是指存在于组织的特定区域内的未分化细胞，数量极少，在数年内都保持不分裂的状态，惟独当组织受到损伤时才被激活，开头分裂。
成体干细胞主要存在于脑、骨髓、外周血液、血管、骨骼肌、皮肤和肝脏，成体干细胞在培养时光上有限制，并且只能分化为限定类型的几种细胞。
成体干细胞表面有许多特别标志，利用这些标志，采纳荧光细胞分别器从细胞悬液中的分别纯化出成体干细胞。
二、干细胞的分化抑制培养胚胎干细胞是从动物胚胎内细胞团或原始生殖细胞分别的具有全能性的细胞，在遗传学、发育生物学和细胞工程领域具有广大的应用前景。
抑制胚胎干细胞分化和促进胚胎干细胞增殖是克隆胚胎干细胞的关键，添加白血病抑制因子（LIF）能有效提高胚胎干细胞克隆率、抑制干细胞的分化。
三、干细胞的生物学性状与鉴定干细胞具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞。
胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。
干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。
胚胎干细胞的培养和调控
胚胎干细胞的培养和调控胚胎干细胞是一种具有极高生物学价值的细胞。
它的特点是可以无限制地自我复制，并能够分化成人体内的各种细胞类型，包括心脏细胞、神经细胞、肌肉细胞等。
这使得胚胎干细胞成为了治疗许多疾病的有力工具，例如肌萎缩侧索硬化症、帕金森病、白血病等。
为了能够将胚胎干细胞应用于实际医疗中，必须先要掌握胚胎干细胞的培养和调控方法。
第一部分培养胚胎干细胞胚胎干细胞的培养需要一定的条件，其中最重要的是营养基质和生长因子。
营养基质是指提供细胞培养所需营养物质的培养基，生长因子则是刺激细胞增殖、分化和细胞功能发挥的非细胞因子分子。
经过多年的研究，科学家们已经掌握了许多优化的胚胎干细胞培养方法，不断改进和创新。
胚胎干细胞的培养主要分为两种方式：一种是使用人类免疫缺陷病毒（HIV）携带的重编程因子，使成人普通细胞重新向胚胎干细胞转化，这种方法的优点在于可以避免使用和浪费胚胎，并且可以根据患者自身的细胞进行个性化治疗；另一种是从人类胚胎中提取胚胎干细胞，这种方法的优点在于可以获得自体造血干细胞以及每一个器官的种子细胞，但在实际应用中受到较多的道德和法律争议。
无论哪种方式，胚胎干细胞的培养本质相同，主要包括以下几个步骤：1. 种植选取营养基质，并将干细胞种植在营养基质中。
营养基质需要包含必需氨基酸、维生素和其他生命所需营养元素。
2. 培养维持培养基的稳定状态，将培养器置于恒温室内，控制培养环境的温度、湿度和CO2浓度等。
3. 复制控制胚胎干细胞的倍数，使其以匀速增长的状态进行培养。
此过程中，应将胚胎干细胞分离至新的培养基中，以保证细胞的数量和干细胞的稳定性。
4. 检测定期检测胚胎干细胞的状态，包括细胞分裂速率、分化程度和遗传特征等，以确保其基态的维持和无突变状态的可能。
第二部分调控胚胎干细胞胚胎干细胞的应用广泛，不仅包含了生物学研究的范畴，还拥有丰富的临床应用前景。
在这个方向上，胚胎干细胞的调控成为了必不可少的一环。
胚胎干细胞的分离培养技术(最全版)PTT文档
ES细胞的特点：
➢ES细胞具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为
体积小、核大，核仁突出，培养时呈克隆状生 长；在功能上，ES细胞具有发育的全能性，即 具有分化为成年动物体内任何一种细胞类型的 能力。
➢ES细胞具有细胞系的特征，在饲养层上能维持
未分化状态并实现自我更新。因为可无限增殖， 也可冷冻保存。
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嵌合体动物制作方法： 1、集合（凝集）法：在卵裂阶段使2个以上的
胚胎发生粘着和结合。 2、注入法：在临近着床的胚泡期，用显微操作
方法将另一个体的细胞注入到囊胚腔中。
研究现状：
家畜的嵌合体不但已在个体间和品种间 取得成功（绵羊、牛等），而且在异种间 也得到了活的后代，如绵山羊人工嵌合体， 该技术对遗传学研究具有重要意义，塑造 特异性状的新奇物种，从而为动物园展示 了新的前景，嵌合体也被用来研究免疫学 系统的机理。
延迟小鼠囊胚中分离出来的多能性细胞，当 时称之为EK细胞。以后称之为胚胎干细胞。
胚胎干细胞体外培养
胚胎干细胞体外培养(一)胚胎干细胞的来源目前胚胎干细胞的主要来源有：①囊胚的ICM及受精卵发育至桑葚胚之前的早期胚胎细胞；②从胚胎生殖嵴及肠系膜中分离原始生殖细胞PGCs后培养建系的胚胎生殖细胞(embryonic germ cells，EG细胞)，也具有ESCs的特性，可以分化为各种类型的成熟细胞；③体细胞核转移(somatic cell nuclear transplantation，SCNT)至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。
其中囊胚的ICM最为常用。
(二)胚胎干细胞的分离1.分离获取ESCs的时间：以既保证ESCs的全能性又要有足够的细胞数量为原则来确定ESCs分离获取的最佳时间。
以ICM为ESCs来源时：小鼠取3～5天囊胚；猪取9～10天囊胚；羊取7～8天囊胚；牛取6～7天桑葚胚或早期囊胚；人取7～10天囊胚。
以PGCs取ES细胞时：小鼠取12.5天胎儿生殖嵴；大鼠可取10.5天尿囊、中胚层组织块、12.5天背肠系膜或13.5～14.5天生殖嵴；牛取29～35天胎儿生殖嵴；人取35～63天的生殖嵴。
2.分离获取ESCs的方法：从PGCs分离ESCs的方法常为机械剪切与消化相结合法，即把采取的胚胎组织充分剪碎，采用EDTA、EDTA/胰酶消化。
从囊胚分离ICM的方法主要有三种：(1)免疫外科学方法：体外培养的小鼠胚泡去除透明带后，经兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清(抗H-26)作用30分钟，移至1∶6稀释的新鲜豚鼠血清中作用30分钟，Hank’s液冲洗，此时胚泡的滋养外胚层呈空泡状，用眼科手术刀挑去死了的滋养层细胞，留存ICM 细胞用于培养。
这种方法利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留ICM细胞进行培养。
(2)组织培养法：在小鼠受精2.5天后切除卵巢，给予外源激素，使胚胎继续发育，但延缓着床，4～6天后，由子宫冲取胚泡进行培养。
结果滋养层细胞生长并推开饲养层细胞，在培养皿底壁上铺展；而ICM细胞增殖，垂直向上生长，形成卵圆柱状结构，在显微镜下用细玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。
小鼠esc培养方案
小鼠esc培养方案一、细胞来源与获取小鼠胚胎干细胞（ESC）可来源于受精后3.5\~5.5天的胚胎，这些胚胎可通过显微操作技术从囊胚中剥离。
剥离的胚胎干细胞需要在含有血清和饲养层细胞的培养基中进行培养。
二、培养基选择与配制培养基是小鼠胚胎干细胞（ESC）生长的必要条件，常用的培养基包括Glasgow MEM、Ham F12、ES Cell Medium等。
在配制培养基时，需要添加适量的血清（一般为胎牛血清）和抗生素等成分，以维持细胞的生长和繁殖。
三、饲养层细胞准备饲养层细胞可以为胚胎干细胞提供必要的生长因子和细胞因子，常用的饲养层细胞包括STO、STO-derived fibroblasts等。
在准备饲养层细胞时，需要将细胞接种在消毒后的培养皿或培养瓶中，待细胞生长至适宜密度后，再进行后续操作。
四、细胞接种与培养将剥离的胚胎干细胞接种在饲养层细胞上，通常情况下，接种密度为1\~5万个/cm²。
在培养过程中，需要保持适宜的温度和湿度，并定期更换培养基，以维持细胞的生长状态。
一般情况下，小鼠胚胎干细胞（ESC）会在接种后2\~3天开始贴壁生长。
五、细胞传代与扩增当小鼠胚胎干细胞（ESC）生长至适宜密度时，需要进行传代和扩增。
通常情况下，传代时的细胞密度为1\~2万个/cm²。
在传代过程中，需要将细胞从培养皿或培养瓶中吹散，并接种到新的培养皿或培养瓶中。
扩增过程需要定期更换培养基，并保持适宜的温度和湿度。
六、细胞冻存与复苏为了长期保存小鼠胚胎干细胞（ESC），需要进行细胞冻存。
将处于对数生长期的细胞进行离心和清洗后，加入适量的冷冻保护剂（一般为二甲基亚砜），然后放入液氮中进行保存。
在需要使用时，将冻存的细胞取出，进行复苏。
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胚胎干细胞的培养及其影响因素前言胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。
1981年Evans 和Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素C处理的STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ），后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。
由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。
体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。
胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。
本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。
研究内容与方法1.材料1.1实验动物昆明白小鼠。
1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C （Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因子；干细胞生长因子；牛胰岛素。
[2]2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5]2.1 胚胎的获取昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。
次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。
选妊娠11.5-16.5D 母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。
2.2 组织原代培养2.2.1 改良组织块法[7](1）在离心管剪碎组织中，加0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，按1 mL/6胎鼠加入，轻柔吹打30S。
（2）用2倍以上成纤维细胞培养液终止，室温静置5 min，弃上清液，尽量减少组织中消化酶的剩余量。
（3）再加MEF培养液（2.5 mL/胎），吹打混匀组织块。
（4）培养瓶提前用MEF培养液湿润整个瓶底，弃多余汇集的培养液。
（5）将含有组织块的悬液均匀滴入瓶底，组织悬液随即均匀平铺于培养瓶底，不会出现组织块悬浮于培养液滴中现象。
（6）后置于37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养；（7）6小时后，将瓶底轻轻翻转平置，避免组织块脱落随培养液流动，后向组织块贴壁的背面补加液体量，继续入培养箱培养过夜；（8）第二天，轻轻翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，切忌动作过快，使液体产生的冲力让贴壁的组织块飘起，而造成原代培养失败。
37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱继续培养。
（9）第三天，观察组织块贴壁及细胞游出情况，漂浮细胞多或培养液颜色变黄，（10）将培养液及漂浮细胞全部转移至离心管中，2000rpm，8min离心去除死细胞及未贴壁组织，取上清液及新鲜培养液各一半加入培养瓶中。
2.2.2 简化酶消化法（1）向离心管剪碎组织中，加入0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，以 2.5 mL/6胎鼠，轻柔吹打混匀组织，37℃水浴轻摇晃5min；（2）再加入同量的0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA 轻柔吹打混匀，轻晃水浴10min；（3）超净工作台内加两倍鼠胚成纤维细胞培养液终止消化，轻吹打，最后可见絮状物将其弃之；（4）需要10cm培养皿个数=胚胎个数×0.8，培养皿个数×10 mL=最终接种细胞悬液量；（5）用培养液补足离心管中液体量，混匀均匀分配于培养皿中。
（6）将培养皿上下左右四个方向，呈“十”字型摇匀细胞，使细胞均匀分布于皿底，置37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养。
（7）第二天将培养皿中全部培养液吸弃，连同漂浮死细胞，更换为新鲜成纤维细胞培养液，进行全量换液。
2.3 继代MEF培养（1）MEF80%-90%长满培养瓶底，弃全部培养液。
（2）预先37 ℃预热的PBS清洗3遍，弃清洗液。
（3）加1ml 0. 05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA于培养皿中，四个方向使消化液均匀流遍每个细胞表面。
（4）将培养瓶或皿置于显微镜下观察，见细胞间隙增大或大量细胞脱壁流动在消化液中时，加入两倍以上定量的培养液终止消化。
（5）弯头吸管吸取培养瓶/皿中的细胞悬液，均匀按顺序反复吹打瓶/皿各部分细胞，从瓶底部一边开始另一边结束，动作轻柔不能产生气泡，确保培养瓶细胞脱落。
（6）计数上述细胞悬液细胞数量。
（7）将上述细胞悬液一并转移入离心管中，1200rpm，5min，去除上清液。
（8）加新的培养液于离心管中，用吸管吹打使之形成均匀细胞悬液。
（9）按6×104-1×105个/mL 传代接种细胞。
原代成纤维细胞传代时可按1：8-1：10的比例进行，以后传代可按1：2-1：3进行传代。
2.4 胚胎培养将胚胎转移至预先制备好的饲养层的6孔板或12孔板，弃全部培养液，移入前1-3小时全部换成胚胎干细胞培养液，采用3种不同的培养液，（即，培养液1：DMEM液+10%NBS+10%FCS；培养液2：1+1000IU/ml LIF；培养液3:1+10mg/ml 胰岛素），置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察1次，加、换液1次，记录有关胚胎贴壁、ICM出现等生长情况。
2.5 内细胞团的分离胚胎接种到有饲养层的培养板中培养4~5天后，弃去原培养液，加入无Ca2+、Mg2+的PBS液洗1次。
在解剖镜下剥去周围的滋胚层细胞，用吸管把转移到干净的培养皿中。
加一滴胰酶于ICM上，37℃，消化3min。
将ICM 转移到新的培养液中，用吸管吹打将其打散。
把打散的细胞接种到有新鲜饲养层的培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
[2]2.6 干细胞集落的分离分散的ICN细胞培养3~7d后，在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。
此时形成的干细胞集落为F1代，在解剖镜下将F1代干细胞集落挑出，按照ICM 分离法离散F1代干细胞集落，再获得的干细胞集落称为F2代，将F2代干细胞集落挑出，再进行分离传代数次，直至获得纯净的ES细胞集落。
[2]2.7胚胎干细胞鉴定2.7.1 细胞形态学观察[7]未分化胚胎干细胞呈克隆性生长，有明显的聚集倾向，集落呈“鸟巢”状生长，圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密，与周围饲养层细胞分界清；集落内细胞小而圆，胞浆较亮，边界不清，排列紧密，胞核较大。
2.7.2 APK染色鉴定将待测细胞用含7.5%蔗糖的1%多聚甲醛固定，底物buffer平衡，室温避光染色：75mg/ml NBT溶于70%DMF，50 mg/ml BCIP溶于100% DMF ，染色前分别取45μl、35μl 溶于10ml底物buffer中，新鲜配制。
ES（PGC、EG)APK染色被染为深蓝紫色，饲养层细胞、分化细胞不着色[2]。
2.8 检测指标[8]实验过程中，主要比较三种不同培养液中贴壁率（贴壁胚胎数/培养胚胎数）、出现率（ICM出现胚胎数培/养胚胎数）、F1出现率（出现F1胚胎数/培养胚胎数）、F2出现率（出现F2胚胎数/培养胚胎数4个与干细胞建系相关的指标。
3 预期结果与培养液1比较，培养液2、3对胚胎培养极更加有利，贴壁率、ICM出现率以及F1、F2出现率差异显著。
培养液2和培养液3对胚胎贴比率、ICM出现率以及F1、F2出现率比较差异不显著。
参考文献［1］Evans MJ et al. Nature,1981,292(5819):154-156.[2] 小数胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代研究.畜牧兽医学报，2002,33（5），433-438.[3] Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041.[4] Sohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Culturing Human Embryonic Stem Cells with Mouse Embryonic Fibroblast Feeder Cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008;2008:pbd. prot5042. [5] ohyun L. McElroy, Renee A. Reijo Pera. Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture. Cold Spring Harb Protoc, 2008:5041.[6] 黄治军, 吕中华, 郑鹏等. 昆明小白鼠胚胎干细胞分离培养的影响因素[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2010, 01:16-18.[7] 李济强, 马天驰等. 小鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上向胚胎干细胞的生长发育[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2009, 13(14):2779-2782.[8] 杨奇, 史远刚, 窦忠英. 影响小鼠胎儿成纤维细胞饲养层的因素[J]. 动物医学进展, 2001, 22(4):45.[9] Miyabayashi T, Yamamoto M, Sato A, et al. Indole derivatives sustain embryonic stem cell self-renewal in long-term culture[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2008. 72(5):1242-1248.。