western blot 步骤
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项adminWesternblot 实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
--Western blot 详细步骤(中文版)
Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。
2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。
2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。
倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。
3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。
4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。
6.接通电源，积层胶电压为60V。
7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。
8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。
9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。
11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。
12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。
13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。
14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。
Western-Blot的步骤
Western Blot的原理及步骤免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE 分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤（一）蛋白质样品获得：1.所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM 25ul 50uM*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml *EGTA（pH8.0）0.5M 80ul 8mM*EDTA（pH8.0）0.5M 10ul 1mMAprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml Pepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml 50ul 10ug/ml Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/mlBenzamidine 100mM 250ul 5mMNaF 5M 250ul 250mMNaVO4（FW183.8）0.2M 25ul 1mM 注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
Western Blot(免疫印迹法)步骤
主要包括以下 4 个基本步骤：样品制备；电泳分离；蛋白的膜转移；免疫杂交与显色――蛋白检测。
溶液和试剂1. 1X 磷酸盐缓冲液(PBS )2. ModifiedRIPAbuffer：Tris-HCl:50 mM, pH 7.4； NP-40: 1%；Na-deoxycholate: 0.25%；NaCl: 150 mM；EDTA :1 mM；PMSF: 1 mM；Aprotinin,leupeptin,pepstatin:1 microgram/ml each；Na3VO4: 1 mM；NaF: 1 mM3. 1X SDS 样品缓冲液：62.5 mMTris-HCl(pH 6.8 于25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mMDTT, 0.01% w/v溴酚蓝4. 转移缓冲液：25 mM Trisbase, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)5. 10X Tris缓冲盐 (TBS)：准备1L 10X TBS：24.2 g Trisbase, 80 g NaCl；用1N HCl调pH为 7.67. 甲醇8. TBS/T缓冲液：1X TBS, 0.1% Tween-209. 封闭缓冲液(TBS/T)：1X TBS,0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA10. 一抗的稀释：1X TBS,0.1% Tween-20 加 5% BSA ( 多抗) 或 5%脱脂奶粉( 单抗)。
Note：一般来说，BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率。
样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1.培养细胞或药物处理。
2.弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3.加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate,100μl /w或 75 cm2 plate,500- 1000μl/瓶) ，刮落细胞，转移到Ep管。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
western-blot步骤
western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。
1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。
2、4℃，1000rpm,5min。
弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。
3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。
（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。
若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。
2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。
稀释液与样品的溶解液相同。
3、待测蛋白做相应的稀释。
（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。
5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
westernblot实验步骤
westernblot实验步骤Western blot实验是一种常用的免疫学检测方法，适用于分析特定蛋白质的存在量、大小和结构等。
下面将介绍Western blot实验的主要步骤，以及注意事项。
1. SDS-PAGE凝胶电泳Western blot实验首先需要进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE （Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）是一种分离蛋白质的方法，可以根据蛋白质的大小将其分离离子定位在凝胶中相应的位置。
在SDS-PAGE中，蛋白质会被特定化学物质SDS （十二烷基硫酸钠）包裹，其带负电荷的端口相互排斥，并使蛋白质在电场中沿着凝胶运行，根据大小排序在不同位置。
2.转移蛋白质到膜上SDS-PAGE电泳完毕后，需要将蛋白质迁移到聚丙烯腈或硝酸纤维素膜上。
转移可以采用湿式或半干燥式方法，膜的种类和转移缓冲液的浓度、pH值等因素都会影响转移效果。
3.蛋白质与抗体结合膜上的蛋白质需要与浓度足够的抗体进行结合，使其出现颜色。
抗体可以是多克隆或单克隆抗体，通常由动物免疫学制备而成。
在结合抗体之前，膜需要被阻断，以避免非特异性的背景信号。
4.识别蛋白质识别特定蛋白质需要使用标记有酶、荧光体或放射同位素等的二抗或底物。
蛋白质与特定抗体形成复合物后，可以使用二抗结合在蛋白质与一抗之间。
底物是标记于蛋白质特定抗体上的酶，在底物的作用下，可生成可见信号，如液态手套（ECL）。
注意事项：1.蛋白质的提取和纯化，提取方式会影响到实验结果，选择适当的提取方法是十分重要的。
2.涉及到蛋白质电泳和转移过程，准确控制电泳时间和电压，转移条件、时间以及温度都会影响转移效果和转移后的后续步骤。
3.在结合抗体前，必须阻断膜上的未被结合的蛋白质，减小背景信号。
通常使用酵素或乳清蛋白等物质进行阻断，以避免非特异性结合。
4.选择合适的底物，控制反应条件，避免过度堆积或实验时间不够导致底物显色偏低。
Western Blot步骤
Western Blot步骤
1. 将得到的样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳;
2. 电泳后，去掉积层胶（也可留），用剪刀剪下与分离胶大小相同的滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，大小为5.5x8.5 cm。
（裁减NC膜时带手套）
3. 滤纸、NC膜、凝胶及海绵在1X转移缓冲液中浸泡5分钟后，按负极板、海绵、3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸、海绵、正极板的顺序组装成“三明治”结构(在浸泡时，用镊子将它们摆放整齐)；然后在100V的电压下，冰水中转膜0.5-2小时。
根据目的蛋白大小而定，小分子蛋白需要时间短。
1X转移缓冲液（10xbuffer :ddH2O:甲醇＝80ml:720ml:200ml）
4. 卸下转膜装置，将NC膜转到培养皿，用TBST溶液洗3次，各5分钟；
7. 用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭膜上空白位点，30分钟（可过夜）；多余的含5%脱脂奶粉的TBS溶液可以用来配制后面所需的1%脱脂奶粉的TBS溶液。
9. 一抗孵育：（用含1%脱脂奶粉的TBS溶液将一抗稀释1000倍）与NC膜温育1小时；反应液量是NC膜面积的1/10，如40cm加4-6ml。
10. TBST溶液洗膜三次，每次5分钟；
11. 二抗反应液（含1%脱脂奶粉的TBS溶液将二抗稀释2000倍）与NC膜温育1小时；
12. TBST溶液（TBS含0.05% V/V Tween-20）洗NC膜三次，每次5分钟；
13. 化学显色：按华美公司或其它公司的NBT/BCIP试剂盒说明书配置AP显色液；与NC膜在黑暗处反应，至有清晰的条带出来后，ddH2O洗三遍，终止反应。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
WesternBlot操作步骤
WesternBlot操作步骤1.样品处理：-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。
-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。
-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。
-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。
-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。
2.SDS-：-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。
- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。
-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。
-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。
-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。
3.电转印：-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。
-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。
-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。
-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。
4.膜上抗体反应：-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。
-一次抗体：加入适当稀释的一次抗体，针对待检测蛋白的抗体。
将膜和一次抗体一起在冰箱中孵育，使二者结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体。
-二次抗体：添加适当稀释的二次抗体，该抗体与一次抗体结合，并标记有辅助酶或荧光标记物。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除未结合的二次抗体。
Western Blot 步骤
Western Blot 步骤：1、样品处理（细胞样品的处理）：1）培养细胞或药物处理2）弃上清，1*PBS漂洗细胞2遍，去尽残留培养基3）加入1*SDS电泳缓冲液，刮落细胞，转移到EP管中（注意冰上操作）4）4摄氏度下搅拌30分钟5）4摄氏度离心，转速和时间根据细胞不同进行改变，一般是12000转/分，20min。
6）离心管取出，置于冰上，吸取上清，其余丢弃。
7）测定蛋白浓度（BSA、BCA、Lowry、Bradford法），-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。
8）加入Loading Buffer， 95~100摄氏度煮沸5min，若测多种蛋白时，70摄氏度加热5~10分钟更为合适。
2、配胶：将两块玻璃清洗干净，先用洗洁精，再用70%乙醇，最后用ddH20，有Bio-Bad字样朝上，完成后加入H2O，约10分钟，确认无漏水后倒出H20，残留的用滤纸吸干（不要伸到里面去，倾斜后在边缘吸）。
3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制（过硫酸铵APS最后加入，且需分装），混匀，用1mL枪加至绿线下方1~2mm处，注意不要将液体全打出来，防止气泡产生，从一边到另一边缓缓加入无水乙醇，ddH20溢出后，室温放置25~30分钟，可看到分离胶与ddH20之间有一条清晰的分界线，倒出上层的乙醇，并用ddH2O洗涤两遍，用滤纸吸去残留的水。
（Tris pH：8.8，配制10mL的量）4、配制浓缩胶：APS最后加入，快速加至液体溢出，将清洗干净的梳子水平插入，擦干外面，静置60分钟后应用于下一步试验；或4摄氏度冰箱过夜。
（Tris pH：6.8，一般配制4mL的量）分离胶与浓缩胶的pH一定要调准，否则严重影响实验结果。
APS1周内使用。
5、加样：将配制好胶的玻璃板轻轻取出，不可分离，放入电泳仪，矮面朝内，放平加紧，倒入1*电泳缓冲液，最好内外液面基本持平，或外液面稍矮，放置检查有无漏电泳液，电泳液配制约1000mL，如果电泳仪有漏液情况，则配制1200mL，使内外液面基本持平。
WesternBlot操作流程
Western Blot操作流程一、蛋白提取准备：1×PBS、吸管、冰盒、细胞裂解液、PMSF（蛋白酶抑制剂）、1.5ml和0.5mlEP管、双蒸水、滤纸、超声仪（用之前、之后及处理不同样本之间均需用双蒸水冲洗，将水用滤纸吸干）、加样枪（200ul和1000ul），Tip头、细胞刮子（使用前、后及不同样本之间，均需用双蒸水冲洗，用滤纸吸干）、封口膜、计时器步骤（所有操作均在冰上进行）1、4℃ 1×PBS洗涤细胞三次后，用力将其内水甩干，将培养瓶倒置于滤纸上，控干约10min。
2、加100ul细胞裂解液，尽可能铺满器皿。
（用加样枪均匀成Z字形走行加样、第一瓶完后即开始计时30min）3、冰上裂解30min(准备细胞刮子；准备EP管，并将其做好标记；准备离心机设置为4℃12000rpm 12min等其降温)4、将细胞刮入1.5ml EP管中（将产物刮至瓶底，用1000ul枪吸出），用手上离心机瞬时离心数秒。
5、用超声波破碎细胞、剪切DNA（超声时间<5S,超声间隔约6S，剪切DNA至溶液不粘稠为止，超声次数约为6~8次；将探头接触到EP管底部，但不要用力，不容易出气泡）6、用封口膜封口7、沸水浴5~10min一般8min（沸水浴时，用1000W火锅即可，不要盖锅盖）8、4℃ 12000rpm 离心 12min,取上清也，根据自己的蛋白用量分装，-20℃或-70℃冻存备用。
二、蛋白浓度测定准备：96孔板、75%酒精棉球、双蒸水（DW）、0.5mlEP管、37℃水浴箱、酶标仪（波长调至570nm）、加样枪、Tip头步骤：1、用酒精棉将96孔板所需孔擦干净，放入37℃温箱，待酒精挥发干净2、空白管加入25ulDW、样品管加入22.5ulDW+2.5ul待测蛋白3、将分析液按A:B=50:1的比例混合，涡旋混匀，瞬时离心4、在各EP管中加入200ul分析液，涡旋混匀，瞬时离心5、37℃水浴30min，使分析液与蛋白样品充分反应6、取100ul各样品加入96孔板中，用酶标仪测蛋白浓度7、所读数值为OD值，按试剂盒所测出的标准曲线计算样品的蛋白浓度（Cpro）8、计算如下项目：OD测、Cpro、Vpro、Mpro、V上样缓冲液（终用法为1×）、V总三、Western blot相关试剂的配制1、1×PBS 1000ml 2000mlNaCl 8.0g 16.0gKCl 0.2g 0.4gNa2HPO4.12H20 3.58g 7.16gKH2PO40.2g 0.4gdddH2O 1000ml 2000ml2、0.5mol/L EDTA(PH=8.0)DdH2O 800ml NaOH约EDTA-Na.2H2O 186.1g 20g 调节PH至8.0，定容至1000ml或称取EDTA 9.3g,加ddH2O 50ml,边搅拌边加NaOH固体（约1g）调PH值至8.03、细胞裂解液0.5mol/L EDTA(PH=8.0) 40ul10% SDS 4ml1mol/L Tris.HCl(PH=6.8) 1ml 混匀定容至20mlddH2O 14.96ml蛋白酶抑制剂（用之前加） 10ul4、30%丙烯酰胺（保存最好不超过两个月）丙烯酰胺（Arcylamide） 29g(神经毒性) 加热至补水至 N,N’-亚甲双丙烯酰胺（bis- Arcylamide） 1g 37℃溶解 100ml 于棕色瓶中保存于室温5、1.5mol/L Tris (PH=8.8) 100mlTris-base 18.15gddH2O 80ml 定容至 100ml浓HCl 约 3ml6、1mol/L Tris(PH=6.8) 100mlTris-base 12.1gddH2O 80ml 定容至 100ml浓HCl 约7~8ml7、10%SDS(w/v) 100ml定容至100ml,室温保存，长期保存或温度很低时若出现沉淀，水浴溶解后可再使用8、10%过硫酸铵（APS）现用现配APS 0.1 g 溶解混匀后4℃保存，ddH2O 1.0ml 保质期为2W左右9、分离胶配方：（不同浓度适用于不同分子量的蛋白），具体各浓度胶的分离范围和配方详见《分子克隆》。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western_Blot实验方法步骤
Western_Blot实验方法步骤Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n样品制备n电泳分离n蛋白的膜转移n免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐 (TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH 为 7.6n脱脂奶粉或BSAn甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗) Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
Western_Blot过程步骤详解
做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。
每次30秒,重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。
(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。
沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。
western blot步骤
提取细胞蛋白步骤：1、配蛋白裂解液（蛋白酶抑制剂：RIPA裂解液=1:100）2、培养瓶弃去培养液，用PBS冲洗2遍3、用枪吸干PBS，加入80μl裂解液4、用刮刀刮下壁上细胞，吸入置于1.5ml EP管中5、超声，每次6-8下，间隔5min，2次-3次6、裂解30min，离心，13500转，10min7、铺96孔板中测蛋白浓度，每孔19μl裂解液，1μl样品，200μl工作液（A液：B液=50:1）8、96孔板于培养箱中孵育30min9、放入酶标仪中测浓度10、剩余蛋白吸入0.6ml EP管于-80℃中冻存提取组织总蛋白：取材时，应涮去组织表面的血，影响吸光度。
步骤：1、配裂解液（裂解液：10%SDS：蛋白酶抑制剂=60:40:1）2、研磨组织块，加300μl裂解液3、超声，3次，每次间隔5min4、冰中静置30min，裂解5、4℃离心13500转25min，吸取上清液至1.5mlEP管6、配工作液：BCA试剂A液：B液=50:17、铺入96孔板，依次加入19μl RIPA裂解液/PBS、1μl样品、200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）放入37℃孵育20min8、放入酶标仪中测蛋白浓度：96孔板放入酶标仪中，进板—开始检测—bca562—read plate—Read—完成—结果（不能时间过长，否则检测的OD值偏高）9、剩余样品分装（避免蛋白降解）于0.6ml EP管，50μl/管10、保存于-80℃Western blot步骤：一、配胶，准备样品（10%的胶）1、胶板中倒入去离子水，静置5min，观察是否漏水，并用滤纸垫脚调平2、弃去去离子水，加入分离胶（10%），用去离子水封口3、40min左右，分离胶凝固，倒去去离子水，加入积层胶4、快速插入梳子（以免积层胶凝固，梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道）5、20min左右，将胶板置于去离子水中4℃保存，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。
western-blot标准步骤
Western-blot检测a. 将制胶玻璃板和样品梳用水冲洗干净，安装好制胶板。
b. 按照制胶体系配置5mL 10%分离胶，充分混匀后吸取4mL灌入玻璃板间隙中，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子齿长再加1cm），最后向分离胶中加入1mL 蒸馏水。
将凝胶放置于室温40min后聚合。
c. 倒出覆盖层水，用去离子水洗去未聚合的丙烯酰胺，排去凝胶上的液体，用滤纸吸干残留液体。
d. 按照制备浓缩胶体系配置3mL 5%浓缩胶，充分混匀后加入到玻璃板间隙，立即在浓缩胶中插入干净的样品梳，避免混入气泡，将凝胶放置室温约40min 后聚合。
e. 小心移出梳子，用去离子水吸取未聚合的丙烯酰胺。
把凝胶固定于电泳装置上，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
f. 按顺序向加样孔中加入15μL样品。
将电泳装置与电源接通，恒压80V电泳，当染料前沿进入分离胶时，将电压调至100V，待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。
g. 从电泳装置上卸下玻璃板。
戴上手套，根据胶大小，裁剪8张滤纸和1张PVDF膜。
将PVDF膜用甲醇浸泡3~5s，随后将其与滤纸放入转移缓冲液中浸泡3~5min。
h. 转膜装置从上到下依次按阳极碳板→4层滤纸→PVDF膜→凝胶→4层滤纸→阴极碳板顺序放置，尽量避免气泡的产生。
i. 将500g的阳极盖子压上，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5h。
j. 断开电源，从上到下拆卸转移装置，将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝的容器中染色；在PVDF滤膜左上角做标记。
用TBS/T洗膜3次，每次5分钟。
用含有5%脱脂奶粉的封闭液将膜封闭2h。
k. 弃封闭液，用TBS/T洗膜，5min×3次。
l. 加入合适浓度的一抗（用封闭液将一抗稀释到合适比例），4℃孵育过夜。
m. 弃一抗，用TBS/T洗膜，5-10min×4次，加入合适浓度的二抗，室温放置2h。
n. 弃二抗，用TBS/T洗膜，5min×4次。
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背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。
Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。
最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和Western，与这两个技术的发明人没有关系了。
一、蛋白质的样品制备：由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。
蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题:> 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
> 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
> 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
> 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。
> 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。
除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。
具体方法见各试剂盒说明书。
为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。
测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。
网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积）。
按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。
上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。
上样前要将样品置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。
也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。
之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。
三、SDS－PAGE电泳1. 清洗玻璃板：蘸点洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。
梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。
2. 灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。
②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。
配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。
灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。
梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。
注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐长度为插入的梳齿长再加1cm）。
③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等几分钟觉得差不多的时候就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。
由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以如果APS不新鲜的话加再多的TEMED效果也不佳，这就是为什么推荐APS每周新鲜配置的原因。
④按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤趁积层胶聚合的这段时间，取适当体积样本混合1X SDS loading buffer（最好事前分装好，每次从冰箱里取一管即可），95~100°加热5min，若有沉淀可用稍低温度，比如45~55°加热1h达到变性的目的。
我一般习惯分装20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，临用前用PCR仪加热95°C 5min，效果不错。
⑥胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后开始准备上样（我们使用的是大连竞迈科技公司的MV-III型小型单垂直板电泳槽，电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。
加样前可用5ml注射器或加样器先冲洗一下加样孔。
用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
目前我们做的mini胶上有10个上样孔，一般在第一个孔加入marker（我用的是Fermentas预染marker），其余9个孔加入样品，也可在头尾孔内加入marker，中间8个孔加样品。
加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。
在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。
上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
也可使用10ul的枪头就行，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。
3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺，网上有资料建议低电压短时间的预电泳，清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通，但是在《分子克隆》上却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。
请各位按照实际经验来做即可。
电泳时间和电压说法各异。
按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接或者转印。
四、转膜我们实验室使用的是半干转膜电泳槽。
对于转印90kd以下的蛋白，转膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的话可以加入0.037%的SDS。
1. 在电泳结束前20min开始准备转膜所需的东西。
转一张膜需准备6张的滤纸（长一般为8.1~8.3cm，宽度根据裁的胶大小实际测量，但胶一般会缩水，所以裁8cm就行）和1张PVDF 膜。
切滤纸和膜时一定要戴干净手套，因为手上的蛋白会污染膜。
PVDF膜使用前用无水甲醇中浸泡1min~2min。
目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
2. 将玻璃板撬开才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板（撬时一定要小心，玻板很脆弱，我用的是冰箱里附带的塑料除霜铲，效果出奇的好）。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去，要避免把分离胶刮破。
也可取10ml注射器吸满转印缓冲液，往玻璃板与凝胶之间注水，使液体的压力将两者自然分开。
取出凝胶后应注意分清上下，可以在右上角裁一个小角。
之后有两种方法供选择，一是按照marker 指示，把含有自己感兴趣的蛋白的胶裁下来，二是把整张胶转膜，前一种方法更加节约材料，但操作稍微麻烦了一点。
在加有转移液的培养皿里放入裁好的胶、浸过甲醇的PVDF 膜和滤纸，平衡10min左右，也是为了除去滤纸和转移膜中的气泡以及胶上多余的SDS。
3. 带上手套，平放转移槽的底座，依次在石墨电极上叠放3张浸泡过缓冲液的滤纸、PVDF膜（此时可在PVDF右上角减去一个角，以辨明转膜后的蛋白面与非蛋白面）、刚刚完成电泳的凝胶和另外3张浸泡过缓冲液的滤纸。
用枪头或移液管在叠层的滤纸上滚动，除去气泡。
注意每叠一层就要用玻璃棒或圆筒试管赶去气泡，因为一个气泡的厚度对于蛋白来说都是十万八千里的。
用干净纱布将叠层上面和周围的多余缓冲液吸干（这一步很重要，宁可太干也不能太湿，太干容易烧胡，太湿的话多余的缓冲液会导致电流短路，大大降低转移效率，如果同时转好几条胶的时候更要小心，有一个胶短路就会影响整体的转移效率）。
最后将转移槽的上盖扣上，接通电源开始转膜。
由于设备昂贵，第一次操作应向熟手请教，否则短路可能烧坏设备！转完后立即清洗设备，特别是金属上盖，转膜液特别容易在金属上盖上形成结痂，影响设备的正常使用，我们实验室今年做western的同志因为忽略这一点，转膜仪烧坏了好几次。
4. 依据分子量大小电泳15~60min。
如果初次转膜，可以根据一般经验，即多少kD的蛋白就转多少分钟，再根据结果调整时间。
之后断开电源，取出转移膜进行后继实验。
5. 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染。
传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
实际上更常用且简便的方法是先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（此方法仅仅适合PVDF膜）。
将膜晾干备用。
使用预染marker话可以看见marker的颜色转印到了膜上，但是凭借这个颜色来判断是否转印完全或转印过头是不可靠的。
五、免疫杂交反应1. 将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h即可。
如果是自己配置的封闭液，最好过滤一下以消除固体杂质。
实际经验表明与其封闭过夜，不如一抗孵育过夜，具体原因可以参考这个帖子：/bbs/topic/178980802. 将一抗用封闭液稀释（一般用封闭液稀释即可，如果背景不高用TBST稀释也可以，当然熟练后还可以自由发挥，配制一些自己的复方稀释液）至适当浓度（可以在1.5mlEP 管中配置工作液，常用稀释倍数为1:200，1:500，1:1000，具体需要预实验进行摸索，用后可回收重复用2~3次，但回收重复利用的效果如何就要看抗体的质量，分装的抗体不推荐回收。