分子荧光与磷光光谱分析法教案
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分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
2、荧光、磷光的寿命和量子产率
荧光寿命τf ：荧光分子处于S1激发态的平均寿命
f
1 (kf
K)
k f ：荧光发射过程的速率常数
K ：各种分子的非辐射衰变过程的速率常
数的总和。
典型分子的荧光和磷i 在光 10-8~ 10-10s
光谱分析法讲解
➢ 磷光寿命τp ：磷光分子处于T1激发态的平均寿命。
f kf (kf K)
➢ 荧光量子产率的大小取决于荧光发射与非辐射 跃迁过程的竞争结果。
K << k f
f 1
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 磷光量子产率（p）
p
S
TKp
Kp
Kj
K p ：磷光发射的速率常数
ST ：S1 T1系间窜越的量子产率
Kj ：与磷光发射过程相竞争的从T1态发生 的所有非辐射跃迁过程的速率常数的
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
振动弛豫：分子将多余的振动能量传递给介质而 衰变到同一电子能级的最低振动能级 的过程。
内转化：相同多重态的两个电子态间的非辐射跃 迁过程。
例如： S1 S0
T2 T1
系间窜越：不同多重态的两个电子态间的非辐射 跃迁过程。
分子发光—荧光、磷光和化学
(L+S),(L+S0 1),…,(|L 1 -S|) 2 S 1 光 谱 项 n LJ
31 3 1 0
2, 1, 0
3.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通 过辐射跃迁 ( 发光 )和无辐射跃迁等方式失去能量（去 活化） 传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
能量传递过程
（1）振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR） 在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因 碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振 动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。 （2）内转换（Internal Conversion，IC） 对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振 动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子 可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如 S2-S1；T2-T1。 （3）外转换（External Conversion，EC） 受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而 使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭” 或“猝灭”。
激发态
单重态基态S0
辐吸 射收
单重态基态S0 激发后 S/T两态
泡利不相容原理 S= 1 2 1 2 1 辐吸 射收
通常自旋不变 激发态S1/ S2
自旋改变 激发态T1/T2
Hund 规 则
M=2S+1 3 三重态triplet state
平行自旋 能量更低
单重态与三重态
n
1 2
第七章分子发光荧光与磷光详解演示文稿
i1
kF、 kp主要取决与荧光物质的分子结构； st系间窜跃效率。
ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。
大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间；
例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1
化合物
F 0.11
第三十一页，共69页。
第十二页，共69页。
S1
外转移
荧光
反系间 窜跃 系间 窜跃
１. 辐射跃迁的类型
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
２. 无辐射跃迁的类型
振动弛豫: Vr 10-12sec T1 外 转 移:无辐射跃迁回
迟
到基态
滞
荧 光
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
镜像规则的解释
大多数吸收光谱的形状表明了 分子的第一激发态的振动能级 结构，而荧光发射光谱则表明 了分子基态的振动能级结构
一般情况下，分子 的基态和第一激发 单重态的振动能级 结构相似，因此吸 收光谱的形状与荧 光发生光谱的形状 呈镜像对称关系。
对于处于S1(T1)电子态的荧光体来说，其平均 寿命()可以左式表示：
F(P)
1
n
kF(P) ki
i1
第三十页，共69页。
3. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
发射荧光的分子数
F 激发分子总数
发射磷光的分子数
P 激发分子总数
F
kF
n
kF ki
i1
P st
kP
n
kP ki
1. 分子能级与跃迁
第二章第二节分子荧光和磷光分析法
带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基 丙氨酸，可以直借用荧光法测定。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
芳香族化合物具有共轭的不饱和体系，多 能发荧光。此外，胺类、蛋白质、酶与辅酶 、维生素等均可用荧光法进行分析。
见表.
11:04:30
11:04:30
磷光分析法基本原理
一、磷光的产生和磷光强度 磷光是由处于第一激发三重态的最低振动能级的
3.室温磷光 (1)固体磷光法：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子 刚性,减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率 。 滤纸、纤维素色层纸、氧化铝、硅胶等
11:04:30
(2)胶束增稳： 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变
磷光体的微环境，增加定向约束力，使其刚性增强。从而减 小碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性．
对于较浓溶液， 由于猝灭 现象和自吸收等原因，使荧光强 度与浓度不成线性关系。
问:为什么荧光分析法的灵敏度比相应的吸收光度法高?
①荧光强度叠加在很小的背景值上，提高荧光讯号的放大 倍数;
② I0↑
A= lg(I0/It)
11:04:30
（2）定量方法
1. 确定ex和em (激发光谱和发射光谱)；
2. 确定适宜的条件: 试剂浓度、pH、T、t 等； 3. 以标准溶液做工作曲线； 4. 测未知样的荧光强度(If), 根据工作曲线计算荧光
如：pH=8.50,Cu2+能催化过氧化氢氧化罗丹明6G,使其发 生荧光猝灭,建立了测定微量Cu2+的催化荧光分析法.
如:铀的测定:将80gNaF压制成片,取含铀溶液滴在片上,在 1000℃烧成熔珠后测量.
11:04:30
11:04:30
(2)生物与有机化合物的分析
脂肪族有机化合物—般需要与某些试剂反 应后才能进行荧光分析。
医学：分子荧光与分子磷光分析法
在疾病诊断和治疗中的应用
肿瘤诊断
荧光与磷光分析法可用于肿瘤的早期 诊断和监测，通过检测肿瘤标志物或 特定基因的表达水平，为肿瘤治疗提 供依据。
感染性疾病诊断
药物疗效评估
荧光与磷光分析法可用于评估药物治 疗的效果，通过监测疾病标志物的变 化，了解药物治疗对疾病的影响。
荧光与磷光分析法可用于检测病原体 和抗体，快速准确地诊断感染性疾病， 如细菌、病毒和寄生虫感染。
06
未来展望
分析技术的发展趋势
智能化
01
随着人工智能和机器学习技术的快速发展，分析方法将更加智
能化，提高检测的准确性和效率。
高灵敏度
02
通过改进荧光和磷光的发光机制，提高检测的灵敏度，实现对
低浓度生物分子的快速检测。
多组分同时检测
03
发展多组分同时检测技术，实现对复杂生物样本中多种生物分
子的快速、准确检测。
在医学领域的应用前景
01
02
03
疾病诊断
利用荧光和磷光分析法对 生物分子进行高灵敏度检 测，为疾病诊断提供准确 依据。
药物研发
通过荧光和磷光分析法对 药物与生物分子相互作用 进行研究，为新药研发提 供有力支持。
个体化医疗
根据个体基因组、蛋白质 组等信息的检测结果，制 定针对性的治疗方案，实 现个体化医疗。
在生物分子检测中的应用
蛋白质检测
荧光与磷光分析法可用于检测蛋白质的含量和性质，有助于研究蛋 白质的功能和相互作用。
核酸检测
通过荧光与磷光分析法，可以检测DNA和RNA的含量和序列，用 于基因诊断、基因表达研究和疾病诊断。
生物标记物检测
荧光与磷光分析法可用于检测生物体内的生物标记物，如肿瘤标志物、 炎症标志物等，有助于疾病的早期发现和治疗监测。
分子荧光和磷光光谱分析法讲解
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
二、荧光、磷光与分子结构的关系
➢ 分子中的电子是依序排列在能量由低到高的 分子轨道上。
σ* π*
反键轨道
n 电子
π
键合轨道
σ
图8-2.有机分子吸光所涉及的能层
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 虽然很多物质能够吸收紫外和可见光，然而只 有一部分物质能发荧光或磷光，分子能否发荧光 或磷光，在很大程度上决定于它们的分子结构。
涉及非键的孤对电子
随溶剂形成氢键能力增大
荧光光谱向短波方向移动
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
➢ 某些芳族羰基化合物和氮杂环化合物
非极性、疏质子溶剂中 激发单重态（n、π*） 荧光弱或无
高极性的氢键溶剂中 激发单重态（ π 、π*） 荧光强
例如: 异喹啉 在环己烷中 在水中
无荧光 发磷光 发荧光
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
S2
系间跨越
S1
能 量
吸 收
发
射
荧
外转换
光
T1
T2
发 射 磷 光 振动弛豫
S0
l3
分子荧光和磷光
l 1 光谱分析法讲解l 2
l 2
➢ 假如分子被激发到S2以上的某个电子激发单重 态的不同振动能级上，处于这种激发态的分子，
很快（约10-12~ 10-14s）发生振动弛豫而衰减到该
电子态的最低振动能级，然后又经过内转化及振
π → π*：自旋许可的跃迁 摩尔吸光系数大， 104 激发态寿命短 S1 T1系间窜越概率较小
n → π*：自旋禁阻的跃迁 摩尔吸光系数小，102 激发态寿命长 S1 T1系间窜越的几率大
分子荧光和磷光 光谱分析法讲解
分子磷光和荧光优质资料课件
19
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多
为
S1→
S0跃迁），发射波长为
λ
’ 的荧光；而且不论电子开始
2
被激发至什么高能级，最终将只发射出波长为λ ‘2的荧光。时间
10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；
λ
‘ 2
>
λ
2
>
λ
1
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
1.荧光(磷光)的激发光谱曲线
激发光的光源用单色器分光，测定不同波长激发光照射下 荧光强度的变化。以激发波长（λ）为横坐标，荧光强度（IF） 为纵坐标作图，便可得到荧光物质的激发光谱 （图中曲线I ） 。
2 .化合物的结构与荧光
(1)跃迁类型
对于大多数荧光物质，首先经历π→π∗或n(非键电子轨道)→π∗ 激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生π∗→π或 π∗→n跃迁而得到荧光。
二、激发光谱与荧光光谱
excitation spectrum and fluore-scence spectrum
三、荧光的产生与分子结构关系
relation between fluorescence and molecular structure
四、影响荧光强度的因素
factor influenced fluorescence
6
（2）分子光谱 基于分子中电子能级、振-转能级跃迁 紫外光谱法（UV） 红外光谱法（IR） 分子荧光光谱法（MFS） 分子磷光光谱法（MPS）
1 理解分子荧光和分子磷光的基本原理
第6章分子发光分析法教学时数：4学时教学要求：1. 理解分子荧光和分子磷光的基本原理；2. 理解分子荧光激发光谱、发射光谱的含义；3. 掌握分子荧光发射光谱的特性；4. 了解荧光光谱仪的组成及各部分的作用；5. 了解磷光分析法的特点和仪器；6. 了解化学发光分析法的原理及应用教学重点与难点：1. 荧光分析法，荧光现象的基本原理、特点和分子的结构特征；荧光物的量子产率和荧光猝灭现象，分子荧光发射光谱的特性；2. 荧光分析的定量原理，荧光分光光度计的原理和结构；3. 磷光分析法的特点和仪器；4. 化学发光现象及其产生的基本条件，化学发光分析方法的特点。
室温下，大多数分子处于基态的最低振动能级，处于基态的分子吸收能量（光能、化学能、电能或热能）后被激发为激发态，激发态不稳定，将很快衰变到基态，若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象称为“发光”。
分子发光包括荧光，磷光，化学发光，生物发光等。
6-1 荧光分析法原理一. 荧光产生的机理每个分子中都具有一系列严格分立相隔的能级，称为电子能极，而每个电子能级中又包含有一系列的振动能级和转动能级。
分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外，还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1 。
根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。
若分子中所有电子都是自旋配对的，则S=0,M=1该分子便处于单重态(或叫单重线)，用符号S表示。
大多数有机化合物分子的基态都处于单重态。
基态分子吸收能量后，若电子在跃迁过程中，不发生自旋方向的变化，这时仍然是M=1，分子处于激发的单重态；如果电子在跃迁过程中伴随着自旋方向的变化，这时分子中便具有两个自旋不配对的电子，即S=1,M=3，分子处于激发的三重态，用符号T表示。
图14.1为电子重态示意图。
处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些(洪特规则)，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。
第七章分子发光分析法(荧光、磷光和化学发光)教材
7
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s
。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长；
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
2019年6月12日星期三
21
4.内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射 的荧光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收 光谱的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
2019年6月12日星期三
24
一、仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。
基本流程如图： 单色器：选择激发光波长的 第一单色器和选择发射光( 测量)波长的第二单色器； 光源：氙灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一 激发单重态的最低振动能级。 外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转 移能量的非辐射跃迁；
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。
改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道耦合进行。
2019年6月12日星期三
第7章荧光和磷光光谱法方案
1
1
3p
2
2
1
1
3s 2
2
基态
1
1
2
2
1st激发态
2S+1=1 2S+1=1 2S+1=3
内量子数J有2S+1个取值 (L+S),(L+S-1),…,(|L-S|)
S
好 多
单线S=态1 2与三1线2 态0
Mg的S0/ S1/ T1态
， 3p
1
1
2
2
意
1
1
义 3s 2
2
1 2
1 2
23:06:33
2.1.1 产生 7.1 荧光
7.1.1 荧光的产生 7.1.3 荧光的影响因素 7.1.5 发射与激发光谱 7.1.7 实验技术与应用
7.1.2 荧光效率 7.1.4 定量关系 7.1.6 荧光仪器
23:06:33
7.1.3 影响因素
分子结构
（1）首要条件有吸收，含共轭双键，通常>1个 苯环增大共轭
F
50
4 mg/L
1000
2 mg/L
苯0 丙氨酸phe，λex=257nm， 800
n=1,2处有峰， 250 270 290 310 330 350 λ /nm
600
强1200度不随浓度变化
n=2 1000
400
800
600
4 mg/L
2 mg/L
400
200
0
250
350
450
550
650
200
室温磷光
胶束稳定 固体表面 敏化溶液室温磷光
S1 受体e A的选择：
第十一章 分子荧光与分子磷光光谱法
17
若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /（kf+ki） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率 常数的总和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下 接近1，说明ki很小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于化 学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 磷光的量子产率与此类似。
14
荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
15
由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发态各个振动能 层的吸收过程中，振动能层越高，两个能层之间的能量 差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越 短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能层降落到基 态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高， 两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。 另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸 收在大约10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的 位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸 收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层 之间的跃迁几率最大，那么，在荧光发射过程中，其相 反跃迁的几率也应该最大。也就是说，吸收和发射的能 量都最大。
11
如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同 的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷 光光谱曲线。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无 辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长 波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也 相对较弱。
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荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由 于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此， 在激发和发射之间产生了能量损失。 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子 激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛 豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射 光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发， 电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能 层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。
若用数学式来表达这些关系，得到 = kf /（kf+ki） 式中kf为荧光发射过程的速率常数，ki为其它有关过程的速率 常数的总和。 凡是能使kf 值升高而使其它ki值降低的因素，都可增强荧光。 实际上，对于高荧光分子，例如荧光素，其量子产率在某些情况下 接近1，说明ki很小，可以忽略不计。一般来说，kf主要取决于化 学结构，而ki则主要取决于化学环境，同时也与化学结构有关。 磷光的量子产率与此类似。
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荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系。
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由基态最低振动能层跃迁到 第一电子激发态各个振动能 层的吸收过程中，振动能层越高，两个能层之间的能量 差越大，即激发所需的能量越高，所以吸收峰的波长越 短。反之，由 第一电子激发态的最低振动能层降落到基 态各个振动能层的荧光发射过程中，基态振动能层越高， 两个能层之间的能量差越小，荧光峰的波长越长。 另外，也可以从位能曲线解释镜像规则。由于光吸 收在大约10-15的短时间内发生，原子核没有发生明显的 位移，即电子与核之间的位移没有发生变化。假如在吸 收过程中，基态的零振动能层与激发态的第二振动能层 之间的跃迁几率最大，那么，在荧光发射过程中，其相 反跃迁的几率也应该最大。也就是说，吸收和发射的能 量都最大。
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如果 固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同 的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷 光光谱曲线。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无 辐射跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长 波方向移动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也 相对较弱。
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荧光发射光谱的普遍特性： （1）Stokes位移 在溶液中，分子荧光的发射相对于吸收位移到较长的波长，称为 Stokes位移。这是由于受激分子通过振动弛豫而失去转动能，也由 于溶液中溶剂分子与受激分子的碰撞，也会有能量的损失。因此， 在激发和发射之间产生了能量损失。 （2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关 因为分子吸收了不同能量的光子可以由基态激发到几个不同的电子 激发态，而具有几个吸收带。由于较高激发态通过内转换及转动弛 豫回到第一电子激发态的几率较高，远大于由高能激发态直接发射 光子的速度，故在荧光发射时，不论用哪一个波长的光辐射激发， 电子都从第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能 层，所以荧光发射光谱与激发波长无关。
现代仪器分析-荧光分析教案
学习好资料欢迎下载题目：荧光分析法教学目的与要求：（1）掌握分子荧光、磷光和化学发光的产生机理；掌握激发光谱和发射光谱特征。
（2）掌握荧光与分子结构的关系以及溶液的荧光（磷光）强度影响因素。
（3）熟悉荧光（磷光）分析法的特点及疋里测定方法。
（4）了解磷光分析法的类型。
（5）熟悉荧光、磷光和化学发光分析仪器的结构。
内容与时间分配：①荧光分析原理：120mi n；②荧光仪器：20min；③分析方法：40min；④磷光分析简介：20mi n；重点与难点：1、荧光的产生；2、荧光光谱与激发光谱；3、荧光与分子结构4、影响因素5、分析方法PPT教具准备:学习好资料欢迎下载荧光分析法（fluorometry ）灵敏度高，紫外—可见法10”g/ml待测物质：分子荧光原子荧光激发光：紫外可见荧光红外可见荧光X—射线荧光1、基本原理利用目一波长得光照射试样，使试样吸收这一辐射，然后再发射出波长相同或较长得光，若这种再发射约在10-9秒内发生，称为荧光，利用荧光得强度和特性对物质进行定性、定量分析，称为荧光分析法。
当分子轨道中电子吸收光子跃迁，若电子跃迁后，处于自旋方向相反得状态，则总自旋量子数S= 0，体系的多重性M=2S+1既为激发态的单线态（此分子在磁场中不产生能级裂分）若电子跃迁后，处于自旋方向相同的状态，则总自旋量子数S=1/2+1/2=1,体系的多重性M=2S+1=3即为三线态（在磁场中，三线态的电子能级产生裂分，一条线可分裂成三条线。
三线态的能量较相应单线态的能量低）。
［电子由单T单跃迁，所需E<E2（单T三）由于单 > 三的跃迁使禁阻的，所以摩尔吸光系数£小］分子在室温基本处于电子跃迁的级态，吸收了可见-紫外光后，基态分子只能跃迁到激发单线态的各个不同振-转能阶，而不能直接跃迁到激发三线态的各个振-转能级（自旋禁阻定律）紫外-可见光照射物质，基态分子不断跃迁到激发态，则分子的紫外吸收应逐渐减小至消失，但事实上物质分子能够连续吸收紫外-可见光，说明存在一条或多条从分子激发态往基态的途径。