棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究

Keywords: Cotton; Somatic embryogenesis; Synchronization control; Culture system
高等植物的体细胞胚发生过程在形态学水平和分子水平上都非常类似于合子胚发生过程，它是细胞全 能性的重要体现。自从Steward等[1]和Reinert[2]分别独立报道从胡萝卜(Daucus carom L.)愈伤细胞中获得体细 胞胚以来，体细胞胚胎发生被认为是植物材料离体繁殖的有效方式，并为研究胚胎发生机制和分离胚胎发 育相关特异蛋白、基因等提供了一个良好的替代体系。然而，在组织培养过程中，植物体细胞胚胎发生的 频率往往较低，特别是从胚性愈伤组织中诱导体细胞胚时，不同发育阶段的体细胞胚常常高度共存。这给 体细胞胚胎发生的生理学、生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。因此，为了获得同一发育阶段的 体细胞胚，采用了一定大小的玻璃柱结合离心[3]、差示沉降结合不同孔径筛子筛选[4]、植物胚性细胞团分
基金项目：教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-04-0740) 作者简介：曹景林（1967–），男，在读博士研究生，遗传育种专业。
* 通讯作者（Corresponding author）：张献龙，男，教授，博士生导师。E-mail: xlzhang@ Received (收稿日期): 2007-07-16; Accepted (接受日期): 2007-09-20.
pH 值 pH value
6.0 5.8
5.8
5.9
2
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China)
Abstract: Low efficiency of somatic embryogenesis and asynchronous embryo development brings a lot of difficulties to the physiological, biochemical and molecular biological studies of embryogenesis processes in cotton. In the present study, a simple and efficient method was developed to improve somatic embryogenesis frequency and synchronous development of mass somatic embryos from cultured cells of Gossypium hirsutum cv. Coker 201. The embryonic calli obtained after several rounds of subculture were scattered in liquid medium by shaking for 2 d and then resuspended in the same liquid medium after discarding the larger callus aggregates over 30 mesh-size-sieve. The suspensions cultured for 14 d were filtered through 50 mesh-size-sieve and then the aggregates over the sieve were inoculated onto the surface of Whatman filter paper placed on the solid medium containing 2.46 µmol L-1 IBA and 0.70 µmol L-1 kinetin to culture for 21 d followed by subculturing. The somatic embryo amount obtained by using new system was 15.5-fold higher than that by suspension culture and 3-fold higher than that by solid culture (without filter papers) at the same culture period, and in the different stages of somatic embryo development, 70.2% for globular, 52.3% for torpedo-shaped and 73.0% for cotyledonary embryos were obtained respectively during the culture. Suspension culture combined with solid culture with filter paper were considered to be beneficial for synchrony of somatic embryogenesis and mass embryo development.
棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究
曹景林 张献龙* 金双侠 杨细燕 朱华国 付莉莉
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，湖北武汉430070)
摘 要：棉花体细胞胚胎发生的频率低，且体细胞胚的发育存在着不同步性，给体细胞胚胎发生发育过程的生理学、生物 化学和分子生物学的研究带来许多困难。本研究以陆地棉品种Coker201为材料，建立了一种简单有效的棉花体细胞胚高频 率发生和同步发育的培养体系。经过多次继代获得的胚性愈伤首先在液体培养基中振荡培养2 d使其分散，然后过30目筛去 除大的颗粒，重新悬浮于同样的液体培养基中。悬浮培养14 d后，过50目筛，将筛上的胚性愈伤重悬浮于新鲜的培养基中， 并用吸管吸取悬浮液，将其均匀地接种在表面垫有滤纸的同成分固体培养基（附加2.46 µmol L-1 IBA和0.70 µmol L-1 kinetin） 上。培养21 d后，用垫有滤纸的相同的固体培养基继代培养。利用这种培养体系，获得的体细胞胚数量分别是单纯悬浮培 养和固体培养（不垫滤纸）的16.5倍和4倍。其中，球形胚、鱼雷形胚和子叶胚的同步发生率分别为70.2%、52.3%和73.0%。 关键词：棉花；体细胞胚胎发生；同步控制；培养体系
An Efficient Culture System for Synchronization Control of Somatic Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.)
CAO Jing-Lin, ZHANG Xian-Long*, JIN Shuang-Xia, YANG Xi-Yan, ZHU Hua-Guo, FU Li-Li
值，高温高压灭菌15 min。
表 1 棉花组织培养所用培养基
培养基
Table 1 Media used during cell cuLeabharlann ture in cotton 基本成分
Medium
Basic component
MS0
1/2MS[36]大量元素 + 1.5% (W/V) glucose + 0.25% (W/V) Phytagel
1
选仪分选[5]、不同孔径大小筛盘过滤[6]、对各种悬浮培养物低温处理并结合过筛[7]等方法。但是，这些方法 都不适合体细胞胚发育早期、极早期的同步化调控，而且在较迟的阶段，难以单独分离直径相似的不同发 育阶段的胚。其中，低温处理法还会改变胚胎发育中的代谢。这些方法均有一定局限性。近年来，利用悬 浮培养使初始细胞群体均一，使胚胎发生同步进行的方法得到了发展。Nadel等[8]和Torres等[9]采用脱落酸 (ABA)预处理法来调控体细胞胚同步发生。Hutchinson和Saxena[10]采用乙酰水杨酸(ASA)处理与噻苯隆(TDZ) 处理相结合的方法来促进体细胞胚的同步发育。Kumar和Tuli[11]采用肌醇饥饿法来调节体细胞胚的同步发 生。但是，这些方法能够影响胚性培养物的生理状态，改变体细胞胚胎发生和胚胎发育过程中的代谢，因 此，不利于直接获得体细胞胚胎发育机制的真实信息，可能会给有关研究的结果分析带来困难。此外，Osuga 等[12]和Tonon等[13]使用Ficoll不连续密度梯度离心结合过筛法获得初始胚性细胞或细胞团，进而实现体细胞 胚胎发生的同步化。遗憾的是，这种方法不仅增加了劳动强度，而且反复过滤和离心增大了污染的风险。
MS1 MS2 MS3
MS无机盐 + B5 有机物[37] + 0.45 µmol L-1 2,4-D + 0.46 µmol L-1 KT + 0.1% (W/V) MgCl2·6H2O + 3% (W/V) glucose +0.25% (W/V) Phytagel MS无机盐(KNO3加倍) + B5 有机物 + 0.23 µmol L-1 2,4-D + 0.46 µmol L-1 KT + 0.1% (W/V) MgCl2·6H2O + 3% (W/V) glucose +0.25% (W/V) Phytagel MS无机盐(KNO3加倍，去掉NH4NO3) + B5 有机物 + 2.46 µmol L-1 IBA + 0.70 µmol L-1 KT +0.1% (W/V) Glu +0.1% (W/V) Asn + 3% (W/V)glucose +0.25% (W/V) Phytagel
MS1 培养基上。35 d 左右将愈伤组织转入 MS2 培养基，每 28 d 继代一次，直至愈伤组织发生胚分化。把