液体活检技术比较

液体活检技术比较

肿瘤负荷具有重要的临床价值，一直以来，由于缺乏简便、准确的检测方法而无法在临床普遍开展。液体活检技术的迅猛发展为连续精准监测到肿瘤负荷提供了可能性。我们从评估肿瘤负荷的需求出发，理想的肿瘤负荷监控标靶应具备以下特性：⚫与人体肿瘤负荷高度相关；

⚫标本获取容易；

⚫检测周期短、价格低、连续性好；

⚫覆盖病种多，能监测多种癌症；

基于尿液、唾液、脑脊液的肿瘤液体活检仅适用于某一类或某一种癌症，在此不再赘述。而传统的基于外周血蛋白类标志物，如前列腺特异抗原PSA、癌胚抗原CEA、甲胎蛋白AFP、糖蛋白CA 等，同样只能检测一种或少数几种癌症，而且与肿瘤负荷的相关度低，不能在症状出现前对肿瘤发病、转移、复发做出预警，因此不能满足肿瘤负荷监控的需求。本节主要比较基于外周血的循环肿瘤细胞（CTCs）、循环肿瘤DNA（ct-DNA）和游离DNA （cf-DNA）三种新型热门外周血肿瘤标志物，分析它们用于评估肿瘤负的优势和不足。

1、循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTCs）：是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。随着实体肿瘤的生长，在病灶周围微环境发生特定变化时，将促使一部分肿瘤细胞获得异常的活动能力，这些细胞从原发肿瘤上脱落，搭乘血液系统或淋巴系

统去往身体各处，在身体里寻找新的落脚点。这些搭乘血液、淋巴快线的脱落肿瘤细胞就被称为循环肿瘤细胞（CTCs），同时也包含侵袭、手术操作等外部因素导致的进入血液循环的肿瘤细胞。

CTCs以不同形态存在于外周血中，既有游离的单个CTC，也有聚集成团的细胞团。

早在1869 年，Ashworth 就在肿瘤患者的血液中发现了肿瘤细胞的存在。但由于肿瘤患者血液中的CTCs数目极少（5-10ml 外周血中CTCs数量级仅为个位数），直到最近十五年细胞捕获技术取得突破进展后，CTCs才成为研究热点。2012年，来自武汉同济的Zhang 研究团队对1990年1月至2012年1月所有CTCs 与肿瘤预后相关的文章进行荟萃分析，结果显示CTCs检测可用于早期和转移性乳腺癌患者的预后判断。Nole 等研究显示，治疗前CTCs数目超出5/7.5 ml 的转移性乳腺癌患者，约一半患者的CTCs数目可在治疗中降低。若CTCs数目无变化或增高，则可能暗示治疗的无效或失败，提示临床医生对患者的治疗进行早期干预。

以上研究证实，对外周血中的CTCs进行计数评估肿瘤负荷具有一定的临床价值。这一策略的关键在于如何有效、精准捕获CTCs并正确判断获取的信号。目前常用的CTCs获取方法大多是根据其生物学特性或者物理学特性进行捕获，然而，由于外周血中存在一定量未被认知的肿瘤细胞、CTCs细胞表面缺乏足够有效的标志物、数量稀少、形态大小不均一、细胞类型不单一等等因

素的存在，现有的技术不仅对CTCs捕获准确率不足，而且缺乏生物学活性的评价作为质控标准。因此，CTCs计数结果对于评估肿瘤负荷,判断疗效和预后都明显不可靠。

CTCs是具有活性的细胞，生物特性最接近于实体肿瘤，其最大价值和研究方向在于药物伴随检测，指导临床用药。现有捕获和计数技术的局限性使得CTCs现阶段不适合作为肿瘤负荷监测的理想标靶。

2、循环肿瘤DNA （circulating tumor DNA，ct-DNA）：指坏死或凋亡的肿瘤细胞释放到外周血中的肿瘤DNA 片段，其带有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变。从概念上可看出，它被包含在游离DNA（cf-DNA）当中，是肿瘤患者cf-DNA中的一部分。从ct-DNA被发现至今，研究人员不断探索和评估其在肿瘤负荷方面的价值。

2007 年，Shinozaki 等6研究者们在不同分级分期的黑色素瘤患者中检测血清B-RAF 基因突变（V600E），结果显示血清中突变B-RAF的含量可反映疗效，且B-RAF 的突变状态与患者总生存率密切相关。这是第一篇关于ct-DNA 突变检测在肿瘤临床疗效监测中的意义的报道。随后，关于ct-DNA 甲基化与肿瘤诊断和预后判断7；ct-DNA 微卫星的改变与肿瘤进展、转移复发的关系8；ct-DNA 基因突变与肿瘤疗效评估和转移复发监测9的研究层出不穷。

因ct-DNA具有肿瘤特异性突变或表观遗传学改变，其获取

通常需要预先对手术切除的肿瘤组织进行测序，或者直接对游离DNA（cf-DNA）做肿瘤基因组大范围捕获测序，以确认ct-DNA 的存在及含量。

基因检测技术百花齐放，以聚合酶链式反应（PCR）为核心技术的检测方法仅能检测已知突变位点，灵敏度高，但对未知突变不可检出，若采用该方法通过ct-DNA含量去评估肿瘤负荷，势必将漏检掉未知突变对肿瘤负荷的影响。

以高通量测序为核心技术的方法可以获取血液中全部的游离DNA（cf-DNA）序列信息，筛选出更多未知的突变ct-DNA并获取含量，但是其灵敏度不及PCR方法，并且随着测序深度增加检测成本也急速增加。因此，受灵敏度和测序深度影响，高通量检测ct-DNA应用于动态监控肿瘤负荷将受限。ct-DNA目前最成熟的应用是在通过对已知位点的检测，筛选出有效的靶向治疗药物，也可通过深度测序寻找出未知突变位点，从而筛选更新的靶向治疗药物。

3、游离DNA（circulating-free cell DNA，cf-DNA）：又称循环DNA 或无细胞DNA，是指存在于血浆或血清的细胞外DNA。早在1948年，Mandel等首次在人类血液中检测到游离DNA的存在，但当时并没有引起科学界的关注。1977年，Leon 等10首先报道肿瘤患者外周血中存在较高水平的游离DNA，随后众多学者研究了肿瘤患者血液循环中的游离DNA。关于cf-DNA 与肿瘤负荷的关系，及其在肿瘤负荷监控的应用，后续章节将予以详

细介绍。

以上便是对当前3种最热门的液体活检标靶应用于肿瘤负荷监控方面的简单介绍。CTCs是存在于肿瘤患者血液中完整的肿瘤细胞，其临床价值与研究方向在于药物伴随治疗。目前，若应用于肿瘤负荷监控受限于细胞的捕获技术，临床一致性不足，参考意义一般。ct-DNA/cf-DNA是血清或血浆中的游离DNA，其检测无需捕获或富集步骤，在现有技术条件下，评估肿瘤负荷的可靠性优于CTCs。ct-DNA需要测序获取，未知突变基因直接影响到检测结果与临床的一致性。cf-DNA 只需进行整体定量检测，不论已知突变与未知突变有多少含量，其总量的变化即可反应出全身所有病灶的平均水平，更能反映肿瘤负荷的整体状况，是肿瘤负荷监控的理想标靶。