液态活检研究进展及技术平台简介

液态活检之循环肿瘤细胞（CTC）研究进展及技术平台简介1.CTC基础知识
1.1.CTC的基本概念
1869年，澳大利亚学者Ashworth在一例转移性肿瘤患者血液中首次观察到从实体肿瘤中脱离并进入血液循环的肿瘤细胞，并首次提出了循环肿瘤细胞（CTC）的概念。

1976年，Nowell将CTC的定义修正为：来源于原发肿瘤或转移肿瘤，获得脱离基底膜的能力并入侵通过组织基质进入血管的肿瘤细胞。

上世纪90年代，科学家开始对CTC的临床意义进行研究。

2000后，CTC日益成为临床上液态活检标志物的研究热点，并在临床越来越广泛的应用。

1.2.CTC的特点
i.可能是单个细胞从病灶脱落进入外周血，也可能是成簇脱落；
ii.不同CTC在形态上有较大差别；
iii.CTC有很强的异质性，不同类型的肿瘤CTC差别很大，即使同一病人来源的不同CTC 细胞表所表达的标志物种类及表达量也有差异；
iv.CTC可能在循环过程中发生上皮间质转化（EMT）逐渐丧失上皮标志物；
v.血液中存在可检测CTC的患者比例随癌症类型的不同而不同。

比如结直肠癌、卵巢癌和乳腺癌大约是50-70%，而非小细胞肺癌则低至30%；
vi.CTC活力强，有抗脱巢凋亡活性；
vii.CTC有侵袭和转移潜能。

图1. CTC的特点
2.CTC检测技术
血液中大部分成分是白细胞和红细胞，CTC所占的比例相对较少。

每10mL血液中，含有1亿个白细胞和500亿个左右红细胞，而CTC的数目可能仅有几个到几十个。

想要准确地检测CTC细胞数目依赖非常灵敏的检测手段。

近年来随着现代医学研究技术的进步和CTC临床应用价值凸显，许多研究机构和研发团队都在推出不同的CTC检测技术。

CTC检测技术包括CTC的富集（分离）和CTC的分析鉴定（识别）等。

2.1.CTC富集（分离）
1.1 免疫亲和法
建立在免疫亲和原理上的CTC富集方法，利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来富集CTC。

基于免疫亲和的方法也分为很多种：
1.1.1免疫磁珠法：以CellSearch®法为代表，在磁珠上包被细胞表面粘附分子EpCAM，来捕获CTC。

临床研究证明该方法检测出的CTC数目与肿瘤的预后密切相关。

FDA已批准CellSearch®检测的CTC数目用于预测转移性乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌的预后。

1.1.2微流体法：Nagrath和Toner的团队研发了一种用于捕获CTC的微流体。

上面有78，000个微柱与EpCAM的抗体相结合，可直接捕获全血中的CTC。

整个微流体共有970 mm2的表面积，在2mL/hour的通量下，CTC捕获效率>60%，特异性在50%左右。

在多种转移肿瘤中该方法已被证明有较高的CTC捕获效率。

1.1.3纳米结构基体：Wang et al等人将EpCAM抗体结合在硅质的纳米基体上，进行CTC捕获。

1mL/hour的通量下，可以达到95%以上的捕获效率。

一项研究利用该方法对26例前列腺癌进行检测，CTC的检出率为20/26，明显高于CellSearch®系统（8/26）。

1.1.4微量离心管：由Hughes et al研制，在微量离心管上包被EpCAM及PSMA的抗体，4.8mL/hour的通量下，捕获率可达50%，特异性达66%。

用该方法对14例转移性肿瘤患者进行CTC检测，检出率为100%，明显高于CellSearch®系统（9/14）。

1.1.5体内富集：将结合EpCAM的装置从前臂静脉插入病人体内，并停留30min，从而进行体内CTC富集。

临床实验证明这种方法对乳腺癌和肺癌的CTC细胞均有较高的捕获效率。

1.1.6白细胞去除法：属于阴性富集法。

用特异性抗体CD45，CD14等与白细胞结合，从而去除全血中的白细胞。

该方法比其它富集方法捕获效率更高，但特异性明显低于其它方法。

利用抗原抗体相互作用原理的CTC富集方法可得到较高的纯度。

但捕获效率对细胞表面抗原的表达情况依赖较明显。

对于依赖EpCAM的捕获方法，CTC捕获效率与细胞表皮抗原的表达情况密切相关，一些CTC可能由于EMT过程中表皮抗原发生变化而未被捕获。

另外EpCAM法仅限于对上皮来源的CTC进行检测。

相对于其它方法，免疫亲和法对CTC 的富集效率偏低。

1.2 物理特性富集法
依据CTC的物理特性，如密度、大小、可变形性及表面电荷等进行富集。

1.2.1密度梯度离心：非常廉价高效的CTC分离方法，可将CTC与白细胞和红细胞分离。

目前市场上有较多的依赖密度梯度离心进行CTC富集的试剂盒，如Ficoll-Paque®solution (PharmaciaFine Chemicals, Uppsala, Sweden)，OncoQuick®(Grenier BioOne, Frickenhausen, Germany)等。

临床实验证明，密度梯度离心富集CTC比CellSearch®系统效率更高。

1.2.2微孔过滤：依据CTC体积大于血细胞的特性，对CTC进行捕获。

该技术已在转移性肝癌，肺癌，前列腺癌，黑色素瘤等肿瘤中被证明有效。

捕获效率高于CellSearch®系统。

1.2.3微流控芯片：最初由Tan和Lim团队研发，针对CTC的体积和可变形性，CTC 的捕获率和特异性均可达到80%以上。

在Tan和Lim研究的基础上，研究者们又发展了不少改进型的微流控芯片。

1.2.4介电电流：由于CTC与血细胞所携带的电荷不同，在双向电泳的条件下，可将CTC 有效捕获（95%）。

目前该技术主要对细胞株进行研究，临床标本的研究相对较少。

物理特性富集法操作简单，成本低廉，不依赖细胞表面抗元的表达，捕获效率较高，但相比其它方法，所富集的CTC纯度较低。

图2. CTC分离、富集及检测
2.2.CTC分析鉴定
利用免疫亲和或物理特性法可富集到CTC，这只是研究CTC的第一步，还需要结合有效的下游分析方法。

一方面由于目前CTC捕获技术不能保证百分之百的纯度，需要对所得到的细胞进行鉴定，以进一步确定CTC细胞的数目，以减少CTC数目判定的假阳性率和假阴性率。

另一方面在肿瘤的发生发展过程中，不仅CTC的数目在动态的变化，CTC所携带的分子标志物也在变化，通过对CTC表面标志物检测，能够反应肿瘤发生发展的动态变化，是研究肿瘤发生发展机制的有效策略，并能很好地指导临床治疗。

常用的CTC分析鉴定技术如免疫荧光、PCR、FISH及高通量测序等。

2.2.1.免疫荧光法（IF）
IF可用于检测CTC表面分子标志物的表达情况。

CellSearch®系统应用了免疫荧光对CTC进行鉴定。

EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 -的细胞被判定为CTC，而EpCAM +、CK +、DAPI+、CD45 +的细胞不被判定为CTC。

在科研方面有非常多的免疫荧光法结合CTC的研究案例。

Baccelli等在各自的研究中对富集的CTC进行干细胞相关标志物CD44，CD24, CD133,ALDH1等的检测。

Armstrong等在各自的研究中对富集的CTC进行表皮间质细胞相关标志物，TWIST, AKT2, PIK3α,N-cadherin and vimentin等进行检测。

Ignatiadis等用IF检测了乳腺癌CTC中HER2的表达。

Shaffer 等分别检测了前列腺癌中EGFR和AR基因的表达。

2.2.2.荧光原位杂交（FISH）
FISH技术亦可以与CTC非常好的结合，不仅可以检测CTC表面标志物，亦可以检测CTC细胞内部的标志物及核型等。

I-FISH CTC检测系统利用白细胞去除法富集CTC 后，用FISH法对细胞的核型进行判断，将异倍体阳性，表面EpCAM阳性，和DAPI阳性的细胞定义为CTC。

Attard G等6，对89例乳腺癌患者进行研究，在治疗过程中每个月提取一次CTC，并用FISH技术检测TMPRSS2-ERG融合基因，AR和PTEN拷贝数变化，该研究发现CTC表面标志物与组织活检有高度的一致性，并最终分析出在前列腺癌治疗过程中，上述基因的动态变化。

另一个典型的例子是Pailler E等7发表在J Clin Oncol上的一项研究。

研究对象是18例组织检测ALK融合基因阳性和14例组织检测ALK融合基因阴性的肺癌患者。

结果表明组织检测ALK融合基因阳性患者体内可检测到ALK融合基因阳性的CTC，这些ALK融合基因阳性的CTC在融合位点方面有很强的异质性，各种类型的CTC 所占比例在crizotinib治疗过程中动态变化。

2.2.
3.基于PCR的检测方法
CTC富集结合RT-PCR可同时对若干个基因的表达进行检测。

Sieuwerts等8对50例转移性乳腺癌患者进行研究，术前采集CTC，其中CTC数目的大于5的患者为32例。

接下来用RT-PCR法检测55个mRNA和10个miRNA，依据这些基因的表达情况，将转移性乳腺癌患者分成四类，每类患者的恶性程度和预后是不同的。

这种分类方法比依赖HER2
和ER进行分类能更好地指导临床。

Chang K等对75例前列腺癌患者进行研究，统计外周血中CTC的数目，并检测CTC所含的干细胞相关基因（ABCG2，PROM1，PSCA）和EMT 相关基因（TWIST1和vimentin）的表达情况，经统计分析发现，CTC中干细胞相关基因的表达情况可作为前列腺癌的预后指标。

位点特异性PCR技术可用于检测CTC携带的驱动基因的突变情况。

例如，MaheswaranS等9对接受酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的非小细胞肺癌患者进行CTC检测，在统计CTC的数目的同时，对CTC携带的EGFR激活突变进行检测，统计结果表明，携带T790M突变CTC的患者表现出明显的TKI耐药，且无进展生存期明显低于不携带T790M突变CTC的患者（7.7 months vs 16.5months, p<0.001）。

2.2.4.高通量单细胞测序
随着新一代测序技术的发展，对单个CTC细胞进行测序具有了可行性。

CTC单细胞测序首先依赖于单细胞扩增技术。

比较有代表性的是哈佛大学谢晓亮团队研发的多重退火和成环循环扩增技术（MALBAC）。

该技术能从一个细胞的基因组中，分离出来自单细胞的DNA，然后添加称作引物的短DNA分子。

这些引物可与DNA的随意部分互补，从而使得它们能够附着到DNA链上，充当DNA复制起点。

MALBAC可以有效地降低PCR扩增偏倚，使得单细胞中93%的基因组能够被测序。

这种方法使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异10。

这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制。

另一种常用的单细胞扩增技术被称作多重置换扩增（MDA）。

该方法随机设计引物，让这些引物与基因组广泛结合，同时使用特定的聚合酶，这种聚合酶能够转换与它自身附着在同一模板上的DNA链片段，形成一种反复分支结构，扩增出大段DNA。

单细胞扩增技术保证了足够量的DNA进行高通量的检测。

目前不少课题组都发表了CTC单细胞高通量测序的相关文章，证明了CTC单细胞测序方法的可行性和有效性。

例如HeitzerE等11对来自6例结直肠癌的37个CTC进行单细胞测序，Ni X等12对来自11例肺癌病人的24个CTC进行全基因组测序。

3.CTC研究现状
CTCs检测是“液态活检”的重要工具，是目前转化医学研究的热点。

大量的临床研究结果提示，CTC具有重要的临床应用潜能。

在许多恶性肿瘤如肺癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌、大肠癌等中均能发现CTCs（详见延伸阅读部分）。

与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，CTC检测具有明显优势：（1）CTCs比传统方法更敏感地发现肿瘤的变化，并对肿瘤患者的预后、复发和转移进行监控；（2）CTCs检测是一种非侵入性的诊断工具，它的分离富集只需要抽取患者少量外周血，对患者无创，也无副作用，同一患者能够反复多次采集。

目前有关CTC的研究主要集中在早期筛查、辅助肿瘤分期、预后评估、个体化治疗策略制定，疗效及耐药监测、复发和转移预警等方面。

3.1.CTC细胞体外培养及个体化治疗相关研究
CTC作为一种有活性的细胞，可以从体内富集分离，并在体外扩增培养。

很多实验室都报道了体外成功进行CTC培养的案例。

如Cayrefourcq 等成功地建立了结肠癌CTC细胞系，Gao等建立了前列腺癌的CTC细胞系，Zhang等建立了乳腺癌CTC细胞系。

2014年，《Science》上的发表了一篇CTC相关的研究成果。

研究者们从6例ER阳性的乳腺癌患者中分离出CTC细胞，进行体外扩增培养。

成功培养的5个细胞系中有3个可以使裸鼠成瘤。

图5. CTC细胞体外培养
对这些细胞系进行基因组测序发现了FGFR2，PIK3CA，ESR1等基因的驱动变异。

随后的药敏实验发现CTC药物敏感性测量结果与临床病史一致，包括紫杉醇和卡培他滨的敏感性，氟维司群和阿霉素的耐药。

CTC培养可以帮助恶性肿瘤患者在整个疾病过程中接受最好的治疗。

这篇文章充分说明了CTC培养的可行性和临床意义。

4.CTC研究策略简介：
CTC是目前液态活检最重要的技术之一，研究CTC既能够提高肿瘤的诊疗水平，又有助于反应肿瘤发生发展机制。

下图概况了CTC的研究策略。

在肿瘤患者治疗前及治疗的不同时间点，采集外周血，检测CTC数目，CTC基因突变或分子标志物表达，最终与随访数据综合统计分析。

图6. CTC研究策略
5.总结与展望
CTC作为一种重要的液态活检技术显现出非常大的应用潜能，已经成为转化医学领域的亮点。

目前有关CTC的研究论文已经接近两万篇。

随着CTC检测技术的进一步完善，及CTC检测成本的逐渐下降，CTC将会有越来越大的用武之地。

临床上，尽管目前FDA仅批准CTC对乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌预后评估，越来越多的临床研究证明CTC是有效肿瘤早筛、辅助诊断、预后评估、实时监控和复发预警等方面的标志物。

随着CTC检测技术的成熟，及CTC相关临床数据的积累，CTC检测将会越来越多地写进临床指南（各种肿瘤与CTC研究详见延伸阅读部分）。

科研上，近年来单细胞测序、CTC培养等技术突飞猛进，CTC日益成为研究肿瘤发生发展机制的有效工具。

尤其在肿瘤转移方面，依赖CTC技术，会有越来越多肿瘤转移的机制被揭开。

附录
肿瘤外泌体研究进展及技术平台简介
（一）外泌体（Exosome）简介
Exosome是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm的膜性囊泡。

Exosome的来源广泛，除了网织红细胞以外，T细胞、B细胞、血小板、树突状细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等，被分泌出的Exosome会进入各种体液如羊水，腹水，鼻灌洗液，唾液，血清，血浆，乳汁，尿液，脑脊髓液等中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。

Exosome内含物的很大部分是蛋白质，如：Annexins、CD9、CD63、CD81、MHC-I和Tsg101等；肿瘤细胞产生的Exosome中还可以检测到过度表达的蛋白质标志物，如FasL、TRAIL和TGF-β等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白，这使得Exosome在肿瘤及相关疾病的诊断中具有重要的潜在应用价值。

除蛋白质外，Exosome中还含有大量的mRNA、miRNA、lncRNA 和cirRNA等。

图1. Exosome的组成（Zhang et al. Journal of Hematology &Oncology, 2015, 8:83）
随着蛋白质组学研究和基因测序技术的快速发展，已经发展出一个Exosome数据库（; ）。

据检测结果，细胞外囊泡可以携带92,897种蛋白质，584种脂类分子，4,934 种miRNAs及27,642种mRNAs。

肿瘤患者和自身免疫性疾病患者Exosome的含量比正常人要高，这表明其在各种疾病中的重要作用，目前，已有越来越多的学者开始关注Exosome在肿瘤发生和发展中的作用及其机制。

（二）肿瘤液态活检的最新技术---Exosome检测平台
1、目前临床检测Exosome方法
1.1超速离心法：是最常用的Exosome纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。

1.2密度梯度离心：通过密度梯度离心，样品中的Exosome将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。

1.3超滤离心：利用不同截留相对分子质量（MWCO）的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得Exosome。

1.4磁珠免疫法：Exosome表面有其特异性标记物（如CD63、CD9），用包被抗标记物抗体的磁珠与Exosome孵育，即可将Exosome吸附并分离出来。

1.5 PEG-base沉淀法：聚乙二醇（PEG）可与疏水性分子结合共沉淀，被用来沉淀Exosome。

1.6试剂盒提取：近年来已出现各种商业化的Exosome提取试剂盒，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。

6.1 ExosomeDiagnostics公司推出全球首个基于ExosomeRNA的液体活检产品：ExoDx ™Lung(ALK)。

ExoDx Lung（ALK）已在Exosome Diagnostics公司的CLIA认证实验室得到验证，是一种基于血浆Exosome的诊断产品，可灵敏、准确、实时检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者的EML4-ALK突变。

6.2用于Exosome分析的集成磁电化学感受器(IMEX)将两个正交的磁性选择系统和电化学检测系统结合。

使用小磁珠捕获Exosome，捕获的Exosome通过电化学传感器检测。

6.3肿瘤Exosome的新一代测序分析：MD安德森癌症中心的研究人员从胰胆管癌患者的体液中分离出Exosome。

对exoDNA、exoRNA进行全基因组、外显子组和转录组测序分析，表明Exosome中含有肿瘤细胞来源的DNA片段。

（三）Exosome RNA研究策略简介
图5. Exosome研究策略。