液体活检

CTCs的分离方法（1）
Ramdane Harouaka , Zhigang Kang , Si-Yang Zheng , Liang Cao. Circulating tumor cells: Advances in isolation and analysis, and challenges for clinical applications. Pharmacology & Therapeutics.2014; 141:209–221.
液体活检优势及前景
• 液态活检无侵入性、可频繁多次检测及快速反应能力均体现出发展潜 力巨大应用价值。将削减无效肿瘤医疗开支、降低医疗成本。 • 适应症广泛，如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌、食管癌等常见肿瘤 均可用液态活检技术进行诊断与监测。 • 2015年美国发布的肿瘤治疗计划的四大举措之一：“液态活检”血浆 开发新方法来评估治疗反应以及抵抗可能的耐药性。 • 根据中国国家癌症中心发布的数据，我国5年内诊断为癌症且仍存活的
• 循环肿瘤细胞 （CTC） • 循环肿瘤DNA（ctDNA） • 肿瘤外泌体 exosome
• 提示肿瘤发展进程及抗 药性等信息，指导个体 化精准治疗
Diaz LA Jr, Bardelli A.Liquid Biopsies: Genotyping Circulating Tumor DNA. J Clin Oncol. 2014; 32(6): 579–586
病例数约为749万。也是液态活检巨大的市场。
CTC 研究概况
1）CTC与转移的关系
2）CTC异质性与肿瘤治疗
3）CTC应用和意义 4）CTC 研究方法
CTCs (circulating tumor cells, CTCs)
Ashworth早在1896年就提出了循环肿瘤细胞的概念。侵入循环系 统的肿瘤细胞，大部分由于机体的免疫识别、机械杀伤及自身凋亡在 短期内死亡，只有极少数存活下来，在适于自身存活和增殖的器官或 组织形成转移灶。
CTCs的研究方法
Ramdane Harouaka , Zhigang Kang , Si-Yang Zheng , Liang Cao. Circulating tumor cells: Advances in isolation and analysis, and challenges for clinical applications. Pharmacology & Therapeutics.2014; 141:209–221.
CTC
CTC circulating tumor cells
What： 循环肿瘤细胞，是指从实体瘤中脱离出来并 进入外周血液循环的肿瘤细胞。 Source: 原发肿瘤和转移灶都会释放CTC。可检测到 的CTC是肿瘤细胞在循环系统微环境下生存竞争的结 果。
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液体活检应用价值（监测肿瘤特异性突变发现肿瘤复发）
1 ： CAPP-Seq （ cancer personalized profiling by deep sequencing ） 癌 症 个 体化深度测序分析方法:利用定制化的 NimbleGen SeqCap EZ Choice Library 作 为”筛选器“对样本靶向捕获后再深度测 序，灵敏度高，特异性强且经济可行。 2 ： 利 用数 字错 误 抑 制（ IDES ）的 方法和 CAPP-seq （ ctDNA 测序方法），能够检测到 频率低至0.004％的突变等位基因
cfDNA－片段谱系分析
Deep sequencing of circulating cell-free DNA yields a dense, genome-wide map of nucleosome occupancy that enables identification of its cell-types of origin, potentially enabling the noninvasive monitoring of a broader set of clinical conditions
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Xiaohui Nia, Minglei Zhuo, Zhe Sua，et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. PNA,2013,52(110) 21083-21088.
液体活检在肿瘤精准治疗中的研究进展
郑秋红
福建省肿瘤医院，福建省肿瘤研究所
福建省肿瘤生物治疗重点实验室 2016.4.21
内容摘要
一. 液体活检
1）cfDNA&ctDNA & CTC概念和最新研究进展
2）液体活检应用和意义
二. CTC/CTSC研究方法和进展 三. 我们的研究
液态活检
• 来源于肿瘤组织，存在 于血液中：
（
cfDNA & ctDNA
Ellen Heitzer,Peter Ulz,and Jochen B.Geig.Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry . 2015,112–123
ctDNA-高通量测序
CTC异质性
Brouwer A, De Laere B, Peeters D, et al.consequences of heterogeneity in the circulating tumor cell compartment. Oncotarget. 2016 Mar 9. doi: 10.18632/oncotarget.8015.
Ellen Heitzer,Peter Ulz,and Jochen B.Geig.Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry . 2015,112–123
液体活检应用价值（分析耐药株的遗传变异）
Ellen Heitzer,Peter Ulz,and Jochen B.Geig.Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry . 2015,112–123
cfDNA
• What :循环游离DNA，机体细胞释放入外周血 循环后发生部分降解的内源性DNA。高度片段 化，约170bp。 • Source:正常细胞、异常细胞（如肿瘤细胞） ，病毒DNA 等 • State: 半衰期短，动态表达量，核小体以单 个、双联或三联的形式进入血液，并逐步分解 。
cfDNA cell-free DNA
Newman AM , Lovejoy A F , Klass DM, et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. Nature Biotechnology(2016) doi:10.1038/nbt.3520
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ctDNA
ctDNA circulating tumor DNA
• What: 循环肿瘤DNA，是指肿瘤细胞DNA经脱落或 细胞凋亡后释放进入循环系统。一种特征性的肿 瘤生物标记物，可以被定性、定量和追踪。
• Source:来源于肿瘤细胞的cfDNA，属于cfDNA的 一种类型。不同患者的水平差异显著，受肿瘤负 荷，分期等因素的影响
CTCs的分离方法（2）-体外培养
Representative images of nonadherent CTC
immunofluorescent staining ：CK： red； Ki67：yellow； CD45 ：green； DAPI： blue.
Papanicolaou staining for uncultured primary
CTCs的研究方法（2）-基因芯片
CTCs的研究方法（3）-测序
Xiaohui Nia, Minglei Zhuo, Zhe Sua，et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients. PNA,2013,52(110) 21083-21088.
Matthew W. Snyder, Martin Kircher,Andrew J. Hillet al. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin.Cell. 2016 Jan 14;164(1-2):57-68.
CTC与肿瘤转移
Simon A Joosse, Tobias M Gorges, and Klaus Pantel. Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells. EMBO Mol Med. 2015 ; 7(1): 1–11.
2012年Bian,乳癌患者在接受化疗（白蛋白结合型紫杉醇+卡培 他滨+曲妥珠单抗）前后CTC变化。 治疗前：CTC 3，HER-2+； 1疗程： CTC 0。 6疗程：病理学 CR。 证实CTC值在乳腺癌治疗早期发生显著变化，能够准确预示疗效， 能够科学指导选择治疗方案。
Goldkorn A，Ely B，Quinn DI，et al．Circulating Tumo cell counts are Prognostic of overall survival in SWOG S0421：a Phase III Trial of docetaxel with or without atrasentan For Metastatic castration resistant prostate cancer.J Clin Oncol2014 32(11)：1136-1142． Bian L，Wang T，Liu Y，et al．Evaluation of treatment response for breast cancer：are we Entering the era of ”biological Complete remission”?．Chin J Cancer Res．2012，24：403-407．
Min Yu , Aditya Bardia , Nicola Aceto, et al. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility. Science. 2014 ; 345(6193): 216–220.
研究方法（1）-Cell Search
CellSearch系统是唯一经FDA批准进入临床应用的CTCs检 测方案。
原理：EpCAM抗体标识的微磁珠从全血中捕获细胞，用免 疫荧光识EpCAM+CK+CD45−进行磁性分离。
CK EpCAM DAPI
CD45
CTC
Cell Search
数据解读:
1. 7.5ML外周血 2. 判断阈值： 转移性乳腺癌 CTCs ≥5 细胞 前列腺癌 CTCs ≥5细胞 结肠癌：CTCs ≥3细胞 表明预后不良 3. 目前FDA只批准用于以上三种肿瘤
CTC应用和意义
乳腺癌、前列腺癌 结肠癌、肺癌、胃癌、 肝癌、胰腺癌多种肿瘤
肿瘤转移 预测
监测早期转移
CTCs
CTCs数量改变反映了肿瘤细胞对各种治 疗方案的敏感性和有效性，为个体化治疗 提供依据。
肿瘤治疗
监测CTCs基因表达／突变，找到药物敏 感的靶点，指导个体化治疗
CTC优化治疗方案
2014年GoldKorn，接受多西他赛联合阿曲生坦治疗的转移性去势 抵抗性前列腺癌患者，基线循环肿瘤细胞CTC数量可预测预后，3周时 CTC升高提示总生存较差，有望作为重新指导和优化治疗的较好指标。